Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Het voorbereiden hechtende cellen voor X-stralen fluorescentie beeldvorming door Chemical Fixatie

8.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52370

⸱

12 maart 2015

 , 
1X-ray Science Division, Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory, 2Department of Physics and Astronomy, Northwestern University

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol over hoe de hoeveelheid en verdeling van metalen in een monster kan worden bepaald met behulp van synchrotron X-ray fluorescentie. We richten ons op adherante cellen en beschrijven de chemische fixatiemethode om dit monster voor te bereiden. Vervolgens beschrijven we hoe het monster kan worden gemonteerd en beeldvorming kan worden uitgevoerd met behulp van synchrotron X-stralen.

Samenvatting

Röntgenfluorescentiebeeldvorming stelt ons in staat om de ruimtelijke verdeling en concentratie van meerdere elementen gelijktijdig non-destructief te meten over grote of kleine monsteroppervlakken. Het is toegepast op vele gebieden van de wetenschap, waaronder materiaalkunde, geowetenschappen, het bestuderen van cultureel erfgoed en in chemische biologie. In het geval van chemische biologie, bijvoorbeeld, maakt het visualiseren van de metaalverdelingen binnen cellen het mogelijk om zowel van nature voorkomende metaalionen in de cellen als exogene geïntroduceerde metalen zoals medicijnen en nanodeeltjes te bestuderen. Vanwege de volledig gehydrateerde aard van bijna alle biologische monsters, vertegenwoordigt cryo-fixatie gevolgd door beeldvorming onder kryogene temperaturen de ideale beeldvormingsmodaliteit die momenteel beschikbaar is. Wanneer een dergelijke combinatie echter niet gemakkelijk toegankelijk of praktisch is, blijft aldehyde-gebaseerde chemische fixatie nuttig en soms onvermijdelijk. Dit artikel beschrijft zo gedetailleerd mogelijk de voorbereiding van adherente zoogdiercellen door chemische fixatie voor röntgenfluorescentiebeeldvorming.

Inleiding

X-ray fluorescentie beeldvorming maakt zowel de identiteit en hoeveelheid van elementen in een monster ruimtelijk worden opgelost. Invallende röntgenstraling, van een energie groter gekozen dan het elektron bindingsenergie van het zwaarste onderdeel van belang, overwonnen de bindingsenergie van binnenste electronen naar de kern 1. Hierdoor ontstaat een 'gat' in het elektron shell. Als hogere energie elektronen vallen in deze gaten worden fluorescente röntgenstraling waarvan de golflengte afhangt van de energie scheiding van deze orbitalen. Aangezien de energie afstand van de orbitalen is kenmerkend voor een bepaald element, de röntgenfluorescentie emissie ook karakteristieke golflengten, afhankelijk van het element. Hierdoor emissie bij een karakteristieke golflengte die de identificatie van de aanwezige elementen toelaat. Kalibratie van de fluorescentie-intensiteit maakt de kwantificering van de aanwezige elementen.

X-ray fluorescentie microscopy (XFM) is in toenemende mate benut, mede door de ontwikkeling van zeer briljante X-ray synchrotron bronnen, zoals die bij Spring-8 in Japan, de Europese Radiation Synchrotron Facility (ESRF) in Frankrijk, en de Advanced Photon Source ( APS) in de US 2. Deze bronnen bieden zeer hoge intensiteit röntgenstralen. Tegelijkertijd, verbetering röntgenoptiek, zoals zoneplaat technologie, kon de concentratie van deze bundels op submicron spots, zij het ​​wat inefficiënt 3. Met zeer hoge intensiteit balken, een betrekkelijk kleine hoeveelheid licht kan worden gericht voldoende om de endogene metalen in cellen wekken, produceert signaal dat kan worden gemeten met de huidige detectortechnologie. Aldus bestuderen van de chemische biologie van metalen in de cel een applicatie met name gebruik van veel van de recente ontwikkelingen in deze techniek maakt 4-10.

Er zijn veel kritische factoren worden beschouwd, terwijl appliggend XFM de elementaire verdeling en kwantificering van gekweekte zoogdiercellen of andere biologische monsters te onderzoeken. Ten eerste moet het monster intact te blijven, zowel structureel als wat betreft de elementaire samenstelling, zodat de meting zinvol zijn. Ten tweede moet het monster worden bewaard andere manier zodat het winterhard tot stralingsschade die kan worden veroorzaakt door een gerichte röntgenbundel. Een manier die een monster kan aan deze beide criteria tegelijk is om snel tot een glasachtig, amorfe ijs 11,12 worden bevroren. Snel invriezen wordt vaak bereikt door middel van verschillende cryopreservatie technieken zoals invallend bevriezing of hoge druk invriezen 13-16. Het is algemeen aanvaard dat cryopreservatie bewaart totale cellulaire architectuur en de chemische samenstellingen in biologische monsters dicht natieve toestand mogelijk. Chemische fixatie, anderzijds, vanwege de langzame en selectieve penetratie van fixeermiddelen in cellen en weefsels well als latere wijzigingen in membraanpermeabiliteit, kunnen verschillende cellulaire ionen vooral de diffundeerbare ionen zoals Cl, Ca en K worden uitgeloogd, verloren of verplaatst, dus waardoor het onderzoek van deze elementen suboptimale 17-19 mogelijk te maken. Ondanks het duidelijke voordeel van cryo-fixatie dan chemische fixatie in het algemeen, voor adherente cellen van zoogdieren in het bijzonder, cryopreservatie heeft verschillende beperkingen 20-23. De meest voor de hand liggende is dat niet elk onderzoek lab heeft een gemakkelijke toegang tot cryopreservatie instrumenten. De meeste huidige hoge druk diepvriezers of zelfs dompelen vriezers zijn kostbaar en bezit alleen een subset van cryo faciliteiten, ver van waar cellen worden geïncubeerd zijn. Het voordeel van cryopreservatie zou kunnen worden verhandeld voor het nadeel van reizen spanning geplaatst op de cellen. Dus, terwijl cryopreservatie is zeker de meest rigoureuze manier om monsters voor X-stralen fluorescentie analyse te bewaren, het is zeker niet de meest toegankelijk is voor alle onderzoekers onder alle omstandigheden;noch is het essentieel - als de metalen worden strak gebonden aan fixeerbaar macromoleculen en de resolutie waarmee het monster wordt afgebeeld groter is dan de schade aan de ultra-microstructuur die kunnen optreden tijdens het drogen. Indachtig de kanttekeningen 24, kan chemische fixatie en drogen een geschikte keuze te zijn.

Andere factoren in een succesvolle röntgenfluorescentie imagingexperiment omvatten juiste analyse. X-stralen fluorescentie beeldvorming is fundamenteel X-ray fluorescentie-emissie spectroscopie gecombineerd met raster-scan om ruimtelijke resolutie bieden. De X-ray fluorescentie-emissie spectra verzameld bevatten een combinatie van overlappende emissie pieken, achtergrond, en de elastische en inelastische verstrooiing toppen van de invallende bundel. Software die de de-convolutie van deze bijdragen, en de montage van de uitstoot pieken mogelijk maakt, is een kritische ontwikkeling van dit gebied 25. Ook de ontwikkeling en commerciële distribution van dunne-film standaarden van bekende samenstelling, gebruikt voor fluorescentie-intensiteit ten opzichte materiaalhoeveelheid calibreren is ook belangrijk geweest.

Dit protocol geeft een beschrijving van de bereiding van hechtende cellen door chemische fixatie en drogen aan de lucht. Een essentiële stap in dit proces is de groei van de cellen op het siliciumnitride ramen, die vaak niet goed hechten, waardoor zacht spoelen op een bepaalde wijze sleutel tot succes.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Voorbereiding van de instrumenten, Substrates, Cultuur Media en Schotels

  1. Behandeling van Siliciumnitride (Si 3 N 4) ramen.
    1. Open de capsule enigszins door uitknijpen ene uiteinde met het venster op zodanige wijze dat het raam zelf niet knijpen, terwijl het draaien van de andere kant van de capsule met de andere hand.
    2. Check een paar omgekeerde, puntig pincet onder stereomicroscoop om ervoor te zorgen dat er geen lijm, gaten of bochten aan het uiteinde. Anders kunnen de ramen worden gebroken door de pincet of vliegen van hen tijdens de volgende stappen.
    3. Haal het venster uit de capsule door voorzichtig grijpen het kader van het venster met een pincet, terwijl knijpen de capsule aan de bovenrand aanbrengen van druk in een richting om de capsule breder te maken wanneer de randen van het raam moet komen.
  2. Venster pre-wash (optioneel).
    1. Indien gewenst, voorwas ramen door ze voorzichtig te dompelenin gedestilleerd water gedurende 5 seconden, gevolgd door 2 minuten wassen in 70% ethanol en 2 minuten wassen in 100% ethanol.
  3. Het aanbrengen en het steriliseren van ramen aan de cultuur schotel.
    1. Om de ramen aan te brengen, stelt u het venster met de platte kant naar boven op de bodem van de cultuur schotel, leg een stukje tape op een schoon glasplaatje. Snijd ongeveer een kwart inch strip af langs de lange zijde van de tape. Neem een ​​stukje tape uit de korte zijde (bij ⅛ "met ¾") met een schone scheermesje.
    2. Gebruik pincet om het stukje tape toepassing op de rand van het rooster of raam. Gebruik voldoende om veilig te houden zonder die de raamopening zelf. Manipuleren van de gehandeld tape met een pincet, stelt het raam naar beneden op de bodem van de cultuur schotel. Gebruik de punt van de pincet tape hechten aan de bodem van de kweekschaal stevig.
    3. Breng een strip aan de andere rand en zich deze aan de onderzijde verbonden met het uiteinde van de pincet.
    4. Zodra alle ramen zijnafgeplakt, steriliseren ramen in de cultuur gerechten met ultraviolet (UV) straling. Dit te bereiken door het plaatsen van de schotel onder de UV lamp in een laminaire stroming kap voor ongeveer 1 uur.
    5. (Optioneel) Als ramen zijn om vooraf worden bekleed met poly-lysine, hoeft dus volgende venster sterilisatie. Coat het raam met 10 ul steriel 0,01% poly-L-lysine oplossing gedurende 1 uur in een 37 ° C incubator, en spoel de resterende oplossing weg het kweekmedium.
  4. Bereid buffers voor de laatste wasbeurt voordat XFM.
    1. Bereid ofwel een Tris-glucose of piperazine-N, -sucrose N-bis (ethaansulfonzuur) (PIPES) vrij van sporenmetalen met osmolariteit en pH equivalent aan Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (D-PBS) buffer zonder calcium en magnesium. Gebruik een van deze buffers aan cellen te spoelen na cellen chemisch worden gefixeerd.
      1. De Tris-glucose-oplossing (10 mM Tris, 260 mM glucose, 9 mM azijnzuur,) maak voeg 1,4 g glucose, 36 mg Tris base en16 gl azijnzuur 20 ml ultrazuiver water. Dan passen uiteindelijke volume tot 30 ml met ultrapuur water. Geen pH aanpassing nodig. Bewaren bij kamertemperatuur tot een week.
      2. Te maken de leidingen-sucrose (20 mM PIPES, 200 mM sucrose) toe te voegen 0,18 g van leidingen en 2,0 g sucrose tot 20 ml van ultrapuur water en breng de pH op 7,4 met kleine hoeveelheden geconcentreerd azijnzuur. Dan passen uiteindelijke volume tot 30 ml met ultrapuur water. Bewaren bij kamertemperatuur tot een week.
        OPMERKING: De reden om het gebruik van PBS in het naspoelen is dat de concentratie van fosfaat, chloride en kalium in PBS zo hoog dat het kan interfereren met XFM als deze niet volledig verwijderd voordat de lucht drogen.
  5. Bereid buffers voor mobiele plating.
    1. Bereid of neem alle media zoals RPMI medium 1640, 1x trypsine-EDTA-oplossing, D-PBS, en andere reagentia nodig voor de bepaalde hechtende cellijn wordt normaal gedaan passage van de hechtende cellen of belang en warm ze tot 37 ° C.

2. Het plateren van Cellen

  1. De gesteriliseerde kweekschaal met de ramen in de laminaire stroming kap voorzichtig medium (10 ml voor een 100 mm kweekschaal) toe, langs de kant van de kweekschaal met het scheef staat. Vermijd onnodige oppervlaktespanning of het laten vallen van de media direct op het oppervlak van siliciumnitride ramen. Omdat de media wordt toegevoegd, langzaam verlichten van de kantelhoek om de vacht van het net en het venster met de media.
  2. Bereid de aanhanger cellijn van belang adequaat, trypsinizing of schrapen van de cellen af ​​van de platen zoals gebruikelijk voor passage van de cellijn. Voer een cel tellen, of andere voorbereiding nodig voor het aanbrengen van de cellen aan de verse plaat.
  3. Cellen toe te voegen aan de cultuur schotel met ramen bij een celdichtheid die nodig is om 50% -70% samenvloeiing meestal bereiken binnen 24-72 uur, en incuberen bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% koolstofdioxide.
  4. Let groei van de cel af, met een omgekeerde lichtmicroscoop, totdat de gewenste celdichtheid (gewoonlijk 50% -70% confluentie) bereikt.

3. Fixatie van Cellen

  1. Bereid vers 4% paraformaldehyde in D-PBS door verdunning van een voorraad gekocht (bijvoorbeeld 25% paraformaldehyde) en de pH op 7,4 met azijnzuur (niet te verhogen overmaat natrium te voegen).
  2. Wanneer cellen werden gekweekt zoals gewenst, en alle vitale vlekken (zoals Hoechst) zijn toegepast en afgebeeld, verwijder de media door zachte aspiratie, kantelen van de schotel 45 ° hoek enerzijds en aanzuigen hand pipet met de andere .
    OPMERKING: In plaats van pipetteren besteed media, een alternatief is om het venster te halen, dompel het raam in microcentrifugebuisjes met D-PBS twee keer en leg het in een nieuwe cultuur schip met een fixatief oplossingen gedurende 20 min gevolgd door 2 maal PBS wassen de resterende fixeermiddelen verwijderen. Als dit wordt gekozen, gaat directly stap 3.5.
  3. Spoel de schotel voorzichtig met D-PBS en onmiddellijk vervangen de verwijderde vloeistof door voorzichtig toevoegen van de verse 4% PFA / PBS terwijl het gerecht in een hoek van 45 °, pipetteren in de richting van de kant van de schotel, en langzaam het ontspannen van de kantelhoek om de fixeeroplossing ter dekking van de ramen. Houd de cellen bedekt met fixatief 20 minuten bij kamertemperatuur.
  4. Verwijder de vloeistof door zachte aspiratie, opnieuw zoals hierboven, het kantelen van de schotel lichtjes en opzuigen met de hand.
  5. Vervang de verwijderde vloeistof door voorzichtig toevoegen van een aantal van de leidingen / sucrose-oplossing, met behulp van het kantelen en pipetteren methode in stap 3.3 beschreven.
  6. Herhaal stap 3.4 en 3.5.
  7. Bereid de materialen drogen.
    1. Verzamel-pluizende handdoeken zoals Kimwipes, en trek een out of the box, dus het is handig zeer snel en gemakkelijk.
    2. Bereid een schone, niet-niveau plaats te zetten het raam te drogen. Stel een rubberen mat raster van de soort gebruikt in elektronenmicroscopie, die ribbels heeft zohet raam kan worden gestut aan één uiteinde terwijl het droogt. Het venster houden komen te zitten aan het droogoppervlak als het droogt en afvoer resterende buffer aan de rand van het monster.
  8. Tweeze de tape bevestigd aan het venster om het venster maximaal uit de vloeistof zorgvuldig. Ophalen ramen die off van de band komen door toepassing van een kleine hoeveelheid van de leidingen / sucrose om hen te drijven en dan ze op te pakken met het omgekeerde pincet.
  9. Zorgvuldig (zonder het raam zelf) en grondig pleisteren overtollige PIPES / sucrose uit de rand van het venster met een Kimwipe. Ook bekladden de rug ingesprongen gebied met behulp van een afgeronde plooi van een Kimwipe.
    Opmerking: Het doel is om zo weinig kristallisatie van zouten of buffers op het oppervlak van het scherm mogelijk.
  10. Plaats het raam op de grid mat. Zorg ervoor dat het venster niet wordt plat op de grid mat, maar gestut op een rand (met behulp van de ruggen van de grid mat) en zo weinig van het net te rakenmat mogelijk. Laat het raam droog.

4. Steekproef Montage en Imaging

  1. Zodra het monster droog is, controleert de aanwezigheid van cellen op de ramen met behulp van een lichtmicroscoop. Voer deze controle, voor de voorbereiding van de monsters voor vervoer naar een synchrotron.
  2. Verpak de ramen voor het transport naar de synchrotron beamline hosten van uw experiment. Voorzichtig aanbrengen ramen met tape aan twee zijden een glasplaatje, dan brengt het glaasje met tape aan de onderkant van een plastic petrischaal. Tape de petrischaal dicht.
    OPMERKING: Voorafgaand aan dit punt, deze stappen kunnen worden uitgevoerd in elke typische lab uitgevoerd. De volgende stappen kunnen het best worden gedaan op een synchrotron beamline.
  3. Verwijder de tape van het raam voorzichtig met een pincet. Gebruik nagellak, in een dunne gelijkmatige laag aan de rand van het venster, de ramen bevestigen aan een aluminium houder door de bundellijn medewerkers synchrotron.
  4. Plaats de aluminium houder ineen kinematische monteren, en plaats het in de juiste positie in de X-ray microscoop. Monteer het monster op een console aan te sluiten op gemotoriseerde podia, binnen de steekproef kamer bij de beamline.
  5. Nadat het monster röntgenmicroscoop instrument gebied (een hok gemaakt van met lood gevulde muren), het instellen van de scan te verlaten. Met bundellijn-specifieke software, kiest het juiste gebied van het monster te scannen, terwijl het bekijken van de positie van de röntgenbundel op het monster met een camera uitgerust met een video dradenkruis en pre uitgelijnd met een stroomafwaartse scintillator camera.
  6. Kies de juiste resolutie voor het monster, op basis van een schatting van de omvang van de kleinste kenmerk van belang. Voor beeldvorming van enkele zoogdiercellen (~ 20-40 micrometer in grootte), gebruik dan een resolutie van 0,25-0,5 urn. Voor beeldvorming gebied van weefsels en onderscheiden cellagen van elkaar, gebruik een oplossing van 2-20 urn.
  7. Kies de juiste verblijftijd voor de steekproef, gebaseerd op een schatting van de hoeveelheid van de ontmoetingal van belang aanwezig is. Voor een snel overzicht scan, of wanneer grote hoeveelheden metalen aanwezig zijn, gebruik dan vlieg scans met verblijftijden van 30-300 msec per pixel. Als weinig materiaal aanwezig is, of om metalen van lage relatieve overvloed te meten, gebruiken stap scans met verblijftijden van 1-2 sec per pixel.
  8. Programmeren van de scans in de beamline-specifieke software. Verwerven van een rasterafbeelding-scan. Werken samen met de beamline medewerkers om de gegevens met software die de karakteristieke energie pieken zal voor elke element analyseren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het vermogen van X-stralen fluorescentie beeldvorming om informatie over biologische monsters is afhankelijk van deze monsters wordt bereid zodanig dat ze robuust stralingsschade op de tijdschaal van het experiment, en toch hun chemische en structurele karakteristieken goed behouden. Bij bekijken van de resultaten van een monster dat is bereid zoals hierboven is beschreven en afgebeeld, is het mogelijk dat er variatie in de onderhavige elementen - aangeeft dat fixatie behouden deze aspecten van de cel (figuur 1)...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

X-stralen fluorescentie beeldvorming is bruikbaar in vele gebieden, met inbegrip van aardwetenschappen, materiaalkunde, en chemische biologie 26-34. Vooruitgang in synchrotron X-stralen, en de nadruk hebben zeer hoge intensiteit balken geproduceerd. Gerichte röntgenstralen voldoende om de endogene metalen in cellen bestaan ​​nu wekken, produceert signaal dat kan worden gemeten met de huidige silicium drift detector technologie. En bestuderen van de chemische biologie van metalen in de cel een applicatie met n...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs danken Stefan Vogt voor zijn hulp bij het passen van de representatieve gegevens die in dit artikel worden getoond, en voor nuttige discussies. De auteurs danken ook Chris Jacobsen voor zijn ondersteuning aan Q. J.

Gebruik van de Advanced Photon Source, straallijnen 2-ID-E en 8-BM-B, in het Argonne National Laboratory werd ondersteund door het U. S. Department of Energy, Office of Science, Office of Basic Energy Sciences, onder Contract No. DE-AC02-06CH11357.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Silicon nitride windowsSilson Ltd/J B J Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, United KingdomSiRN-5.0-200-2.0-200. Bestel op maat. Membraanmaat: 1.5 mm x 1.5 mm. Dikte: 200 nm. Lijstmaat: 5 mm x 5 mm. Lijstdikte: 200 µm.Alternatieve bron: SPI Supplies / Structure Probe, Inc. West Chester, PA.
Omgekeerde pincetElectron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Gratis: 800-523-5874, Fax: 215-412-845078520-5XEMS 5X, NC – Ultra Fine Pincet
Rubber rastermatElectron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Gratis: 800-523-5874, Fax: 215-412-845071170Ronde rastermat
AzijnzuurSigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052338826geconcentreerd azijnzuur met sporenmetalen
PIPES bufferSigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052P6757vaste PIPES buffer
Formaldehyde stockoplossingElectron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Gratis: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450RT 1711310 x 10 ml ampullen van 20% waterig paraformaldehyde

Referenties

  1. Thompson, A. C. Center for X-ray Optics and Advanced Light Source. , 1-53 (2009).
  2. Helliwell, J. R. Synchrotron radiation facilities. Nat. Struct. Biol. 5, 614-617 (1988).
  3. Lai, B., et al. X-ray Phase Zone Plate Fabricated by Lithographic Techniques. Appl. Phys. Lett. 61 (16), 1877-1879 (1992).
  4. Dodani, S. C., et al. Calcium-dependent copper redistributions in neuronal cells revealed by a fluorescent copper sensor and X-ray fluorescence microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (15), 5980-5985 (2011).
  5. Finney, L., et al. X-ray fluorescence microscopy reveals large-scale relocalization and extracellular translocation of cellular copper during angiogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (7), 2247-2252 (2007).
  6. Kehr, S., et al. X-ray fluorescence microscopy reveals the role of selenium in spermatogenesis. J. Mol. Biol. 389 (5), 808-818 (2009).
  7. McCormick, N., Velasquez, V., Finney, L., Vogt, S., Kelleher, S. L. X-ray fluorescence microscopy reveals accumulation and secretion of discrete intracellular zinc pools in the lactating mouse mammary gland. PloS One. 5 (6), (2010).
  8. Paunesku, T., Vogt, S., Maser, J., Lai, B., Woloschak, G. X-ray fluorescence microprobe imaging in biology and medicine. J. Cell. Biochem. 99 (6), 1489-1502 (2006).
  9. Twining, B. S., et al. Quantifying trace elements in individual aquatic protist cells with a synchrotron X-ray fluorescence microprobe. Anal. Chem. 75 (15), 3806-3816 (2003).
  10. Chen, S., et al. The Bionanoprobe: hard X-ray fluorescence nanoprobe with cryogenic capabilities. J Synchrotron Radiat. 21, 66-75 (2014).
  11. Medalia, O., et al. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298 (5596), 1209-1213 (2002).
  12. Forster, F., Medalia, O., Zauberman, N., Baumeister, W., Fass, D. Retrovirus envelope protein complex structure in situ studied by cryo-electron tomography. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (13), 4729-4734 (2005).
  13. Muller, M., Moor, H. Science of Biological Specimen. , SEM, Inc. 131-138 (1984).
  14. Moor, H., Riehle, U. Proceedings of the 4th Eur. Reg. Conference Electron. , 33-34 (1968).
  15. Sitte, H. Advanced instrumentation and methodology related to cryoultramicrotomy: a review. Scanning Microsc Suppl. 10, 387-463 (1996).
  16. Studer, D., Graber, W., Al-Amoudi, A., Eggli, P. A new approach for cryofixation by high-pressure freezing. J. Microsc. 203, (Pt. 3, 285-294 (2001).
  17. Matsuyama, S., et al. Elemental mapping of frozen-hydrated cells with cryo-scanning x-ray fluorescence microscopy). X-Ray Spectrom. 39, 260-266 (2010).
  18. Schrag, M., et al. The effect of formalin fixation on the levels of brain transition metals in archived samples. Biometals. 23 (6), 1123-1127 (2010).
  19. James, S. A., et al. Quantitative comparison of preparation methodologies for X-ray fluorescence microscopy of brain tissue. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401 (3), 853-864 (2011).
  20. Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. EMBO J. 23 (18), 3583-3588 (2004).
  21. Bouchet-Marquis, C., Hoenger, A. Cryo-electron tomography on vitrified sections: a critical analysis of benefits and limitations for structural cell biology. Micron. 42 (2), 152-162 (2011).
  22. Bouchet-Marquis, C., Dubochet, J., Fakan, S. Cryoelectron microscopy of vitrified sections: a new challenge for the analysis of functional nuclear architecture. Histochem. Cell Biol. 125 (1-2), 1-2 (2006).
  23. Mesman, R. J. A novel method for high-pressure freezing of adherent cells for frozen hydrated sectioning and CEMOVIS. J. Struct. Biol. 183 (3), 527-530 (2013).
  24. Hackett, M. J., et al. Chemical Alterations to murine brain tissue induced by formalin fixation: implications for biospectroscopic imaging and mapping studies of disease pathogenesis. Analyst. 136 (14), 2941-2952 (2011).
  25. Vogt, S. MAPS: A set of software tools for analysis and visualization of 3D x-ray fluorescence data sets. J Phys IV France. 104, 635-638 (2003).
  26. Vantelon, D., Lanzirotti, A., Scheinost, A. C., Kretzschmar, R. Spatial distribution and speciation of lead around corroding bullets in a shooting range soil studied by micro-X-ray fluorescence and absorption spectroscopy. Environ. Sci. Technol. 39 (13), 4808-4815 (2005).
  27. Robison, G., et al. X-ray fluorescence imaging of the hippocampal formation after manganese exposure. Metallomics : Integrated Biometal Science. 5 (11), 1554-1565 (2013).
  28. Hard Kemner, K. M. X-ray micro(spectro)scopy: a powerful tool for the geomicrobiologists. Geobiology. 6 (3), 270-277 (2008).
  29. Walsh, W. Scientific Testing of Beethoven's Hair. 17, José State University San José, CA. Naperville, Illinois, Beethoven Center, San. (2000).
  30. Casadio, F., Rose, V. High-resolution fluorescence mapping of impurities in historical zinc oxide pigments: hard X-ray nanoprobe applications to the paints of Pablo Picasso. Applied Physics A: Materials Science and Processing. 111 (1), 1-8 (2013).
  31. Leonardo, T., et al. Determination of elemental distribution in green micro-algae using synchrotron radiation nano X-ray fluorescence (SR-nXRF) and electron microscopy techniques--subcellular localization and quantitative imaging of silver and cobalt uptake by Coccomyxa actinabiotis. Metallomics : Integrated Biometal Science. 6 (2), 316-329 (2014).
  32. Wang, P., et al. Quantitative determination of metal and metalloid spatial distribution in hydrated and fresh roots of cowpea using synchrotron-based X-ray fluorescence microscopy. Sci. Total Environ. , 463-464 (2013).
  33. Ducic, T., et al. X-ray fluorescence analysis of iron and manganese distribution in primary dopaminergic neurons. J. Neurochem. 124 (2), 250-261 (2013).
  34. Kim, A. M., Vogt, S., O'Halloran, T. V., Woodruff, T. K. Zinc availability regulates exit from meiosis in maturing mammalian oocytes. Nature Chemical Biology. 6 (9), 674-681 (2010).
  35. Ortega, R., Cloetens, P., Deves, G., Carmona, A., Bohic, S. Iron storage within dopamine neurovesicles revealed by chemical nano-imaging. PloS One. 2 (9), (2007).
  36. Bohic, S., et al. Synchrotron hard X-ray microprobe: fluorescence imaging of single cells. Appl. Phys. Lett. 78 (22), 3544-3546 (2001).
  37. Kosior, E., et al. Combined use of hard X-ray phase contrast imaging and X-ray fluorescence microscopy for sub-cellular metal quantification. J. Struct. Biol. 177 (2), 239-247 (2012).
  38. Glesne, D., Vogt, S., Maser, J., Legnini, D., Huberman, E. Regulatory properties and cellular redistribution of zinc during macrophage differentiation of human leukemia cells. J. Struct. Biol. 155 (1), 2-11 (2006).
  39. McRae, R., Lai, B., Vogt, S., Fahrni, C. J. Correlative microXRF and optical immunofluorescence microscopy of adherent cells labeled with ultrasmall gold particles. J. Struct. Biol. 155 (1), 22-29 (2006).
  40. Yang, L., et al. Imaging of the intracellular topography of copper with a fluorescent sensor and by synchrotron x-ray fluorescence microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (32), 11179-11184 (2005).
  41. Wagner, D., et al. Elemental analysis of Mycobacterium avium-, Mycobacterium tuberculosis-, and Mycobacterium smegmatis-containing phagosomes indicates pathogen-induced microenvironments within the host cell's endosomal system. J. Immunol. 174 (3), 1491-1500 (2005).
  42. Harris, H. H., et al. Time-dependent uptake, distribution and biotransformation of chromium(VI) in individual and bulk human lung cells: application of synchrotron radiation techniques. Journal Of Biological Inorganic Chemistry : JBIC : a publication of the Society of Biological Inorganic Chemistry. 10 (2), 105-118 (2005).
  43. Corezzi, S., et al. Synchrotron-based X-ray fluorescence imaging of human cells labeled with CdSe quantum dots. Anal. Biochem. 388 (1), 33-39 (2009).
  44. Marmorato, P., et al. Cellular distribution and degradation of cobalt ferrite nanoparticles in Balb/3T3 mouse fibroblasts. Toxicol. Lett. 207 (2), 128-136 (2011).
  45. Weekley, C. M., et al. distribution, and speciation of selenoamino acids by human cancer cells: X-ray absorption and fluorescence methods. Biochemistry. 50 (10), 1641-1650 (2011).
  46. Yuan, Y., et al. Epidermal growth factor receptor targeted nuclear delivery and high-resolution whole cell X-ray imaging of Fe3O4@TiO2 nanoparticles in cancer cells. ACS Nano. 7 (12), 10502-10517 (2013).
  47. McRae, R., Bagchi, P., Sumalekshmy, S., Fahrni, C. J. In situ imaging of metals in cells and tissues. Chem. Rev. 109 (10), 4780-4827 (2009).
  48. Carter, E. A., et al. Silicon nitride as a versatile growth substrate for microspectroscopic imaging and mapping of individual cells. Molecular Biosystems. 6 (7), 1316-1322 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Steriele siliciumnitridevensterscelgroeifixeeroplossingsucrosewasdroogprocedurebeamline imagingmetaaldistributie
Het voorbereiden hechtende cellen voor X-stralen fluorescentie beeldvorming door Chemical Fixatie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.