Hier presenteren we een protocol over hoe de hoeveelheid en verdeling van metalen in een monster kan worden bepaald met behulp van synchrotron X-ray fluorescentie. We richten ons op adherante cellen en beschrijven de chemische fixatiemethode om dit monster voor te bereiden. Vervolgens beschrijven we hoe het monster kan worden gemonteerd en beeldvorming kan worden uitgevoerd met behulp van synchrotron X-stralen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Het voorbereiden hechtende cellen voor X-stralen fluorescentie beeldvorming door Chemical Fixatie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Röntgenfluorescentiebeeldvorming stelt ons in staat om de ruimtelijke verdeling en concentratie van meerdere elementen gelijktijdig non-destructief te meten over grote of kleine monsteroppervlakken. Het is toegepast op vele gebieden van de wetenschap, waaronder materiaalkunde, geowetenschappen, het bestuderen van cultureel erfgoed en in chemische biologie. In het geval van chemische biologie, bijvoorbeeld, maakt het visualiseren van de metaalverdelingen binnen cellen het mogelijk om zowel van nature voorkomende metaalionen in de cellen als exogene geïntroduceerde metalen zoals medicijnen en nanodeeltjes te bestuderen. Vanwege de volledig gehydrateerde aard van bijna alle biologische monsters, vertegenwoordigt cryo-fixatie gevolgd door beeldvorming onder kryogene temperaturen de ideale beeldvormingsmodaliteit die momenteel beschikbaar is. Wanneer een dergelijke combinatie echter niet gemakkelijk toegankelijk of praktisch is, blijft aldehyde-gebaseerde chemische fixatie nuttig en soms onvermijdelijk. Dit artikel beschrijft zo gedetailleerd mogelijk de voorbereiding van adherente zoogdiercellen door chemische fixatie voor röntgenfluorescentiebeeldvorming.
Inleiding
X-ray fluorescentie beeldvorming maakt zowel de identiteit en hoeveelheid van elementen in een monster ruimtelijk worden opgelost. Invallende röntgenstraling, van een energie groter gekozen dan het elektron bindingsenergie van het zwaarste onderdeel van belang, overwonnen de bindingsenergie van binnenste electronen naar de kern 1. Hierdoor ontstaat een 'gat' in het elektron shell. Als hogere energie elektronen vallen in deze gaten worden fluorescente röntgenstraling waarvan de golflengte afhangt van de energie scheiding van deze orbitalen. Aangezien de energie afstand van de orbitalen is kenmerkend voor een bepaald element, de röntgenfluorescentie ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Voorbereiding van de instrumenten, Substrates, Cultuur Media en Schotels
- Behandeling van Siliciumnitride (Si 3 N 4) ramen.
- Open de capsule enigszins door uitknijpen ene uiteinde met het venster op zodanige wijze dat het raam zelf niet knijpen, terwijl het draaien van de andere kant van de capsule met de andere hand.
- Check een paar omgekeerde, puntig pincet onder stereomicroscoop om ervoor te zorgen dat er geen lijm, gaten of bochten aan het uiteinde. Anders kunnen de ramen worden gebroken door de pincet of vliegen van hen tijdens de volgende stappen.
- Haal het venster uit de capsule door voorzichtig grij....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het vermogen van X-stralen fluorescentie beeldvorming om informatie over biologische monsters is afhankelijk van deze monsters wordt bereid zodanig dat ze robuust stralingsschade op de tijdschaal van het experiment, en toch hun chemische en structurele karakteristieken goed behouden. Bij bekijken van de resultaten van een monster dat is bereid zoals hierboven is beschreven en afgebeeld, is het mogelijk dat er variatie in de onderhavige elementen - aangeeft dat fixatie behouden deze aspecten van de cel (figuur 1).......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
X-stralen fluorescentie beeldvorming is bruikbaar in vele gebieden, met inbegrip van aardwetenschappen, materiaalkunde, en chemische biologie 26-34. Vooruitgang in synchrotron X-stralen, en de nadruk hebben zeer hoge intensiteit balken geproduceerd. Gerichte röntgenstralen voldoende om de endogene metalen in cellen bestaan nu wekken, produceert signaal dat kan worden gemeten met de huidige silicium drift detector technologie. En bestuderen van de chemische biologie van metalen in de cel een applicatie met n.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs danken Stefan Vogt voor zijn hulp bij het passen van de representatieve gegevens die in dit artikel worden getoond, en voor nuttige discussies. De auteurs danken ook Chris Jacobsen voor zijn ondersteuning aan Q. J.
Gebruik van de Advanced Photon Source, straallijnen 2-ID-E en 8-BM-B, in het Argonne National Laboratory werd ondersteund door het U. S. Department of Energy, Office of Science, Office of Basic Energy Sciences, onder Contract No. DE-AC02-06CH11357.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Silicon nitride windows | Silson Ltd/J B J Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, United Kingdom | SiRN-5.0-200-2.0-200. Bestel op maat. Membraanmaat: 1.5 mm x 1.5 mm. Dikte: 200 nm. Lijstmaat: 5 mm x 5 mm. Lijstdikte: 200 µm. | Alternatieve bron: SPI Supplies / Structure Probe, Inc. West Chester, PA. |
| Omgekeerde pincet | Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Gratis: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450 | 78520-5X | EMS 5X, NC – Ultra Fine Pincet |
| Rubber rastermat | Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Gratis: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450 | 71170 | Ronde rastermat |
| Azijnzuur | Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052 | 338826 | geconcentreerd azijnzuur met sporenmetalen |
| PIPES buffer | Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052 | P6757 | vaste PIPES buffer |
| Formaldehyde stockoplossing | Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Gratis: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450 | RT 17113 | 10 x 10 ml ampullen van 20% waterig paraformaldehyde |
Referenties
- Thompson, A. C. Center for X-ray Optics and Advanced Light Source. , 1-53 (2009).
- Helliwell, J. R. Synchrotron radiation facilities. Nat. Struct. Biol. 5, 614-617 (1988).
- Lai, B., et al. X-ray Phase Zone Plate Fabricated by Lithographic Techniques. Appl. Phys. Lett. 6....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
