Methodenartikel

Een chirurgische ingreep voor resecting de muis Rib: Een Model Grootschalige Long Botherstel

DOI:

10.3791/52375

⸱

21 januari 2015

 ,  ,  ,  , 
1Eli and Edythe Broad Center for Regenerative Medicine and Stem Cell Research, Keck School of Medicine, University of Southern California

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het algemene doel van deze procedure is om met succes een deel van het bot van de rib van een muis te reseceren. De procedure is ontwikkeld als een model om grootschalige reparatie van lange botten te bestuderen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol introduceert onderzoekers om een ​​nieuw model voor grootschalige botherstel gebruik te maken van de muis rib. De procedure beschrijft het volgende: bereiding van het dier voor een operatie, het openen van de borstkas lichaamswand, waardoor de gewenste rib van de omringende intercostale spieren, uitsnijden van het gewenste gedeelte van de rib zonder induceren van een pneumothorax en sluiten van de insnijdingen. Vergeleken met de botten van de appendicular skelet, de ribben zijn zeer toegankelijk. Bovendien, geen interne of externe fixator is noodzakelijk omdat de aangrenzende ribben zorgen voor een natuurlijke fixatie. De operatie gebruikt commercieel beschikbare voorraden, is eenvoudig te leren en goed verdragen door het dier. De werkwijze kan met of zonder de omringende periosteum worden uitgevoerd, en derhalve de bijdrage van het periost te herstellen kunnen worden beoordeeld. De resultaten geven aan dat als de periosteum wordt gehandhaafd, robuust herstel optreedt in 1-2 maanden. We verwachten dat het gebruik van dit protocol zalonderzoek naar rib herstel te stimuleren en dat de resultaten van de ontwikkeling van nieuwe manieren om botherstel op andere plaatsen in het lichaam te stimuleren zal vergemakkelijken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Slopende skelet verwondingen, chronische artrose, en de ernstige problemen in verband met reconstructieve chirurgie invloed van de economische productiviteit, familie welzijn en kwaliteit van leven. Terwijl scheurtjes en letsels kan redelijk goed genezen, mensen niet kunnen herstellen grote gebreken en moeten daarom vertrouwen op reconstructieve procedures tot de structuur en functie te herstellen. Reconstructie kan allogene of heterogeneic enten, morcellized bot, geïmplanteerd steigers, of distractieosteogenese betrekken. Helaas, niet alleen is er blijvende morbiditeit factoren in verband met deze behandelingen maar de oorspronkelijke sterkte van het gerepareerde bot zelden bereikt. Zo worden nieuwe klinische benaderingen nodig.

One-way om innovatieve methoden om segmentale defecten ontwikkelen voor de behandeling is om situaties waarin grootschalige reparatie van nature voorkomt bestuderen. Amfibieën beroemde kan skeletelementen regenereren, terwijl zoogdieren beperkt in Th worden beschouwdis het vermogen. Aangezien het begin van de 20e eeuw, enkele gevallen van regeneratie in de menselijke rib gepubliceerd suggereren dat mensen niet worden beperkt 1-4. Momenteel wordt dit verschijnsel is bekend door plastisch chirurgen die rib materiaal voor kaak, gezicht en oor reconstructie, maar is niet breder gesteld 5. Om deze reparatie in meer detail te onderzoeken, hebben we een chirurgische model met de muis ontwikkeld. Met behulp van dit protocol, kunnen onderzoekers de aangeboren factoren te identificeren en deze informatie gebruiken om het skelet genezing in andere locaties te vergemakkelijken.

Er zijn vele voordelen aan het gebruik van de ribben als een model voor de studie skelet reparatie. Ten eerste, de omliggende ribben natuurlijke fixator (vergeleken met resectie van de femur 6,7). Dit vermindert de morbiditeit risico van interne en externe fixators en vereenvoudigt de chirurgische ingreep. Ten tweede, de dunne gespierde lagen van de borst wall zorgen voor een gemakkelijke toegang en een uitstekende zichtbaarheid die de test te vergelijken met het gemak van calvarial resecties 8 te maken. Ten derde, in tegenstelling tot de calvaria welke vorm van intramembraneuze ossificatie de ribben van endochondrale ossificatie en groeien in lengte via verlenging bij kweekplaten gelegen aan weerszijden van een centrale diafyse. Daarom kan de reparatie van de ribben meer te vergelijken met de reparatie van de lange botten van de appendiculair skelet zijn. Verder hebben we gevonden dat in vergelijking met het dijbeen, het periosteum van de rib dikker en kan gemakkelijker worden gemanipuleerd. Aldus kunnen onderzoekers die willen botherstel te testen ten behoeve van de studie periosteum of testen celtherapie, farmacologische agentia, en / of weefsel scaffolds vindt chirurgische model nuttig. Kortom, dit rib resectie model biedt een kader waarbinnen de natuurlijke grootschalige botherstel studeren bij zoogdieren als geen dergelijk model in algemeen gebruik op dit moment bestaat.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: Alle procedures zijn in overeenstemming met een dier protocol door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan de Universiteit van Zuid-Californië goedgekeurd.

1. Voorbereiding voor Heelkunde

  1. Lay-out van de noodzakelijke chirurgische instrumenten en benodigdheden (gesteriliseerd, artikelen 1-18 in Materials lijst) en regelen een dissectiemicroscoop en een glasvezel trans-hulplicht in een kap of op een afzuigtafel.
  2. Plaats een seksueel volwassen muis (20 - 30 g, 1-3 maanden oud) in een inductie kamer met 4% isofluraan anesthesie.
  3. Bevestig anesthesie met een poot en / of staartknijptest.
  4. Breng zalf ogen van de muis om droge ogen tijdens de operatie te voorkomen.
  5. Beweeg de muis om de microscoop podium. Plaats de muis in de neuskegel van het onderhoud slang en positioneren lateraal. Geef een opwarming zak grenzend aan het dier te helpen handhaven lichaamstemperatuur.
    NIETE:. Positie van de muis is afhankelijk van persoonlijke voorkeur en / of de handigheid van de chirurg, ofwel links of rechts is prima.
  6. Pas isofluraan tot 2-3% voor onderhoud, en let op de ademhaling.
  7. Injecteer buprenorfine (0,05 mg / kg) subcutaan (zijdelingse flank van de poot) voor postoperatieve pijn met een 25 G naald. Het been kan trillen wat een normale reactie.

2. openingssnede

  1. Detecteren de gewenste rib door palpatie, en duidelijk het gebied van haar met een scheerapparaat.
    OPMERKING: Ribs 8-10 aanbevolen omdat ribben 1-7 dichter bij de longen en 11-13 zijn aanzienlijk korter. Het tellen van de ribben moet beginnen met de meest rostrale rib als nummer 1.
  2. Bereid de met afwisselende povidonjood en isopropanol (70%) zwabberen (3x wordt vaak aanbevolen door toepassing dierlijke protocollen).
  3. Snijd een 2 cm incisie door de huid, direct boven en parallel aan de gewenste rib met middelgrote microchirurgie schaar. Incise door de onderliggende spieren en vet lagen.
  4. Plaats alle 3 lagen (huid, spier, vet) in een oprolmechanisme aan het operatiegebied bloot, terwijl het minimaliseren van de incisie.

3. wegsnijden van de Rib

  1. Dwars door de intercostale spieren bovenop de gewenste gedeelte van rib met een 5,0 mm scalpel. Plaats deze incisie ongeveer 5 mm proximaal van de chondrocostale gewricht aangezien dit is waar de rib niet zo sterk gebogen. Haal voorzichtig de spier van het bot met fijne tip pincet.
  2. Een resectie maken met behoud van de periost in het dier, snijd het periosteum langs de lengte van de rib met een 5,0 mm scalpel. Haal voorzichtig het periost van het onderliggende bot zijdelings met fijne tip pincet. Behoedzaam, als periost is zeer delicaat en een gelatineachtige consistentie.
  3. Vervolgens maakt een dwarsdoorsnede door het bot aan één uiteinde met fijne micro-schaar. Indien nodig, meet de resectie meteen dradenkruis in de microscoop of een soort liniaal meter. Dan til het bot uit het beenvlies en snijd de andere kant.
    LET OP: Ga voorzichtig te werk. Dit is de meest delicate stap, zo omhoog te trekken zonder het uitknippen van de rib onder de pleura membraan scheuren en leiden tot een pneumothorax. Als de pleurale membraan gescheurd deze gemakkelijk duidelijk zal zijn als het inwendige van de borstholte zichtbaar wordt.
  4. Als bloeden optreedt als gevolg van het snijden het bot passen druk aan het afgesneden uiteinde met een wattenstaafje gedurende 4-5 seconden om het bloeden te stoppen.
    Opmerking: In het zeldzame geval dat bloeden blijft, kan het nodig zijn om te stoppen en inslapen het dier aanzienlijk bloedverlies recovery beschadigen (zonder vloeistof substitutie, de maximale hoeveelheid bloed die veilig kan verloren 10% van het totale bloedvolume of 7,7 -. 8 gl / g voor 25 g muis, komt dit overeen met ongeveer 180-200 pl 9).
  5. Plaats onmiddellijk de verwijderde rib in4% PFA voor toekomstige analyse.
    OPMERKING: Als de resectie van zowel het bot en het periost moet worden uitgevoerd, laat de periost incisie en scheiding (stap 3.2). Aangezien het periost is zeer strak gehecht aan de pleura membraan voorzichtigheid te betrachten, plagen de rib uit de buurt van de pleura membraan met een tang om scheuren te voorkomen.

4. Het sluiten van de incisie

  1. Hecht de intercostale spieren over de bovenkant van de overblijvende periosteale huls met 9-0 hechtingen (2 hechtingen zijn meestal voldoende). Plaats de hechtingen direct boven de afgesneden einden van de rib, om als indicatoren voor chirurgie locatie.
  2. Verwijder het oprolmechanisme. Hechten de bovenliggende spieren en vet met 9-0 hechtingen (3-4 hechtingen zijn meestal voldoende). Bij muizen met een bijzonder dikke lagen spier- en / of vet, hechtdraad elke laag afzonderlijk (bijvoorbeeld 1 laag hechtingen voor de spierlaag en 1 laag van hechtingen voor de vetlaag).
  3. Sluitenhuid met 7-0 hechtingen (4-5 hechtingen zijn meestal voldoende).
  4. Bevestig de incisie met hechtdraad lijm, knijpen de randen samen met grote tang.
  5. Langzaam afkicken van de muis af isofluraan door eerst aan te passen aan 1% voor enkele minuten en dan uit te schakelen.
  6. Plaats de muis onder een warmtelamp en verlaten totdat het bewustzijn wordt herwonnen, 5-10 min. Na het bewustzijn wordt herwonnen en gedurende de genezing periode, moet de muis te bewegen en ambulate normaal en vertonen geen tekenen van nood.

5. Herstel en Analyse

  1. Zorg voor postoperatieve pijnbestrijding inclusief de toediening van buprenorfine in een orale gelatine formulier op 0,5 mg / kg om de 12 uur gedurende 48 uur. Orale toediening niet nodig beteugeling van het dier dat pijn zou kunnen veroorzaken aan de thoracale regio.
  2. Houd de muis in een kooi met vrije toegang tot voedsel en water tijdens de genezing periode. Na de incisie droog is, vrouwelijke dieren kan mede worden ondergebracht, terwijl de mannelijkes moet geïsoleerd blijven om gevechten te voorkomen.
  3. Na de genezing periode, volgt de goedgekeurde procedure voor euthanasie. Verwijder de ribbenkast voor bevestiging en analyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieren typisch snel te herstellen van deze procedure, de incisie geneest goed, en de dieren vertonen normaal gedrag. De procedure maakt gebruik van commercieel beschikbare voorraden en na praktijk kan worden voltooid in minder dan 1 uur. Alvorens deze procedure experimentele data genereren, is het belangrijk om de resectie te analyseren dag 0 tijdstip te bepalen of er grote botfragmenten in het resectie gebied zijn achtergebleven. Een manier om de juiste procedure te beoordelen is om de dieren door de X-ray of microCT b...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Als eerste het leren van dit protocol, het bepalen waar de eerste incisie te lokaliseren kan een uitdaging zijn. Echter, de praktijk op geëuthanaseerd muizen helpt de chirurg leren waar de eerste incisie te plaatsen en de gewenste rib te worden gereseceerd bloot. Werken aan kadavers verbetert ook de fijne motoriek om de rib gedeelte te verwijderen met of zonder het periost. Bovendien zou iemand nieuw deze procedure te manipuleren fijne gereedschappen en dun hechtingen moeilijk. Terwijl koppelverkoop af, teveel trekken a...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij bedanken de leden van het Mariani-lab voor het kritisch lezen van het manuscript. Onze financieringsbronnen waren: de Baxter Medical Scholar Research Fellowship (voor M.K.S.), USC-bachelorbeurzen en de Rector, Decaan Joan M. Schaeffer en Rose Hills Fellowships (voor M.K.S.). We erkennen ook een CIRM BRIDGES-beurs via Pasadena City College (voor T.T.T). en het James H. Zumberge Research and Innovation Fund, de USC Regenerative Medicine Initiative en de NIAMS NIH onder toekenningnummer R21AR064462 (voor F.V.M).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Medium sized micro-dissection scissors (Vannas-Tübingen Spring Scissors 5 mm)Fine Science Tools15003-08
Fine micro-dissection scissors (Vannas Spring Scissors - 2mm Cutting Edge)Fine Science Tools15000-04curved tip is beneficial
Micro-scalpel 5.0 mmFine Science Tools10315-12other fine scalpels can be substituted
Dumont 55 forcepsFine Science Tools11295-51
Retractor Fine Science Tools17004-05adjustability is convenient
Micro-needle holdersFine Science Tools12060-01
9.0 nylon sutures (Ethilon), taper point bestEthicon2819G or similartaper point best but reverse cutting is also good
7.0 prolene sutures (Prolene)Ethicon8700H or similar6-0 can be used too, needle point can vary
Large forceps (Adson Forceps)Fine Science Tools11006-12other brands are fine
Lubricant Eye Ointment (Akwa Tears)Akorn17478-062-35
Suture glue (GLUture Topical Tissue Adhesive)Abbot32046-01has excellent working time
ShaverWahl9918-6171 or similar
Clamp lampZoo MedLF-5
Infrared Bulb, 75WZoo MedRS-75
RC2 Rodent Anesthesia SystemVetEquip 922100
IsoFlo (Isoflurane)Abbot05260-05
Buprenorphine (Buprenex)Reckitt Benckiser12496-0757-1
BetadinePurdue Frederick67618015017
Flavored Gelatin, raspberryJell-OB000E1FYL0made up firm, to the consistency of 'jigglers'

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Philip, S. J., Kumar, R. J., Menon, K. V. Morphological study of rib regeneration following costectomy in adolescent idiopathic scoliosis. Eur Spine J. 14 (8), 772-776 (2005).
  2. Munro, I. R., Guyuron, B. Split-rib cranioplasty. Ann Plast Surg. 7 (5), 341-346 (1981).
  3. Taggard, D. A., Menezes, A. H. Successful use of rib grafts for cranioplasty in children. Pediatric neurosurgery. 34 (3), 149-155 (2001).
  4. Head, J. R. Prevention of Regeneration fo the Ribs: A problem in thoracic surgery. Archives of Surgery. 14 (6), 1215-1221 (1927).
  5. Kawanabe, Y., Nagata, S. A new method of costal cartilage harvest for total auricular reconstruction: part I. Avoidance and prevention of intraoperative and postoperative complications and problems. Plastic and reconstructive surgery. 117 (6), 2011-2018 (2006).
  6. Cheung, K. M., et al. An externally fixed femoral fracture model for mice. Journal of orthopaedic research : official publication of the Orthopaedic Research Society. 21 (4), 685-690 (2003).
  7. Matthys, R., Perren, S. M. Internal fixator for use in the mouse. Injury. 40, Suppl 4. S103-S109 (2009).
  8. Cooper, G. M., et al. Testing the critical size in calvarial bone defects: revisiting the concept of a critical-size defect. Plastic and reconstructive surgery. 125 (6), 1685-1692 (2010).
  9. Ask the Vet. JAX NOTES. 499, Available from: http://jaxmice.jax.org/jaxnotes/archive/499c.html (2005).
  10. Flecknell, P. A., Roughan, J. V., Stewart, R. Use of oral buprenorphine ('buprenorphine jello') for postoperative analgesia in rats--a clinical trial. Laboratory animals. 33 (2), 169-174 (1999).
  11. Rigueur, D., Lyons, K. M. Whole-mount skeletal staining. Methods in molecular biology. 1130, 113-121 (2014).
  12. Evans, D. J. Contribution of somitic cells to the avian ribs. Developmental biology. 256 (1), 114-126 (2003).
  13. Colnot, C., Thompson, Z., Miclau, T., Werb, Z., Helms, J. A. Altered fracture repair in the absence of MMP9. Development. 130 (17), 4123-4133 (2003).
  14. Lu, C., et al. Cellular basis for age-related changes in fracture repair. Journal of orthopaedic research : official publication of the Orthopaedic Research Society. 23 (6), 1300-1307 (2005).
  15. Zilberman, Y., Gafni, Y., Pelled, G., Gazit, Z., Gazit, D. Bioluminescent imaging in bone. Methods in molecular biology. 455, 261-272 (2008).
  16. Pelled, G., Gazit, D. Imaging using osteocalcin-luciferase. Journal of musculoskeletal. 4 (4), 362-363 (2004).
  17. Elefteriou, F., Yang, X. Genetic mouse models for bone studies--strengths and limitations. Bone. 49 (6), 1242-1254 (2011).
  18. Srour, M. K., et al. Natural large-scale regeneration of rib cartilage in a mouse. J. Bone Miner. , (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Resectie van muizenribbenbotreparatiemodelbehoud van periostribexcisieskeletreparatieintercostaalspierthoraxchirurgiebotregeneratiehistologische analyse

Gerelateerde artikelen