Hier presenteren we een protocol om eenvoudig en betrouwbaar de longdruk-volumecurve bij muizen te meten, waaruit blijkt dat het voldoende gevoelig is om fenotyische parenchymveranderingen in twee veelvoorkomende longaandoeningen, pulmonaire fibrose en emfyseem, te detecteren. Deze metrische biedt een middel om de structurele veranderingen in de long te kwantificeren met de zich ontwikkelende pathologie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Meting van de druk-volume curve in muizenlongen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
In de afgelopen decennia is de muis wordt de primaire diermodel van verschillende longziekten. In modellen van emfyseem of fibrose, worden de essentiële fenotypische veranderingen beste beoordeeld door het meten van de veranderingen in de longen elasticiteit. Om zo goed begrijpen specifieke mechanismen die een dergelijke pathologieën bij muizen, is het essentieel om functionele metingen die de ontwikkeling pathologie kan reflecteren maken. Hoewel er vele manieren om elasticiteit te meten, de klassieke methode is dat de totale long druk-volume (PV) curve uitgevoerd over het gehele bereik van longvolumes. Deze meting is uitgevoerd op volwassen longen uit bijna alle soorten zoogdieren dateert uit bijna 100 jaar, en dergelijke PV bochten speelde ook een belangrijke rol in de ontdekking en het begrip van de functie van pulmonaire oppervlakteactieve stof in de foetale ontwikkeling van de longen. Helaas, zoals totale PV curves zijn niet uitgebreid in de muis, hoewel zij nuttige informatie over de macrosc kan biedenOPIC effecten van structurele veranderingen in de longen. Hoewel gedeeltelijke PV curves van slechts veranderingen in longvolume soms worden gerapporteerd, zonder maat absolute termen, de niet-lineaire aard van de totale PV kromme maakt deze gedeeltelijke aard moeilijk te interpreteren. In deze studie beschrijven we een gestandaardiseerde manier om de totale PV curve gemeten. We hebben vervolgens getest het vermogen van deze curves veranderingen in muizenlong structuurverschillen in twee algemene long pathologieën, emfyseem en fibrose. De resultaten toonden significante veranderingen in verscheidene variabelen in overeenstemming met de verwachte structurele veranderingen van deze pathologieën. Deze meting van de long PV kromme bij muizen verschaft aldus een eenvoudige manier om de progressie van de pathofysiologische veranderingen in de tijd en het potentiële effect van therapeutische procedures volgen.
Inleiding
De muis is nu de belangrijkste diermodel van verschillende longziekten. In modellen van emfyseem of fibrose, worden de essentiële fenotypische veranderingen beste beoordeeld door het meten van de veranderingen in de longen elasticiteit. Hoewel er vele manieren om elasticiteit te meten, de klassieke methode is dat de totale druk-volume (PV) curve gemeten van residuale volume (RV) tot de totale longcapaciteit (TLC). Deze meting is uitgevoerd op volwassen longen uit bijna alle soorten zoogdieren dateert uit bijna 100 jaar 1-3. Dergelijke PV curves speelde ook een belangrijke rol in de ontdekking en het begrip van de functie van pulmonaire oppervlakteactieve stof in de foetale ontwikkeling van de longen 4-7. Ondanks het belang van het PV-curve als een meting van het fenotype van de long, is er geen gestandaardiseerde manier om deze meting uit te voeren. Het is gewoon gedaan door het opblazen en leeg laten lopen van de long met discrete stappen (wacht een variabele tijd evenwichtstoestand na elk) of met pompen diekan continu opblazen en leeglopen van de long. De PV kromme wordt vaak gedaan via een volumebereik tussen nul en enkele door de gebruiker te definiëren longcapaciteit, maar de tijdsduur van elke druk volume curve gerapporteerd door verschillende laboratoria is zeer wisselend, variërend van enkele seconden tot 8 uur 2. Sommige onderzoekers verwijzen naar dit totaal long PV-curve als statische of quasi-statische, maar deze zijn kwalitatieve termen die weinig inzicht bieden, en ze zijn hier niet gebruikt. Bovendien, de PV curve niet uitgebreid in de muis, hoewel zij nuttige informatie over de macroscopische effecten van structurele veranderingen in de longen kan bieden.
Verschillende problemen hebben geleid tot variabiliteit in PV curve verwerven, waaronder: 1) de inflatie en deflatie; 2) de druk excursies voor inflatie en deflatie; en 3) middelen om een absolute longvolume gemeten bepalen. In de onderhavige hier werkwijze een snelheid van 3 ml / min werd gekozen als een compromise, het zijn niet te kort om de dynamische elasticiteit geassocieerd met normale ventilatie en niet te langzaam weerspiegelen met betrekking tot de meting onpraktisch maken, in het bijzonder bij het bestuderen van grote cohorten. Aangezien een nominale totale longcapaciteit in een C57BL / 6 gezonde muis in de orde van 1,2 ml 9 Dit percentage kan typisch twee volledig gesloten PV lussen worden gedaan in ongeveer 1,5 minuten.
In de uitgebreide literatuur waarin PV curves gemeld, is de piek bandenspanning gebruikt uiterst variabel zijn, variërend van zo laag als 20 tot meer dan 40 cm H2O Een deel van deze variabiliteit kan worden gerelateerd aan soorten, maar een primair doel van het instellen van de bovenste druklimiet voor PV krommen de long totale longcapaciteit (TLC) of maximale longvolume blazen. De TLC bij mensen wordt bepaald door de maximale vrijwillige inspanning een individu, maar helaas kan nooit worden gedupliceerd in een diermodel. Zo is het maximale volume experimentele PV krommen afschrikkenbepaald door een maximale druk willekeurig door de onderzoeker ingesteld. Het doel is om een druk waar de PV-curve vlak ingesteld, maar helaas is de inflatie onderdeel van een zoogdier long PV-curve is nooit vlak. Dus de meeste onderzoekers stellen een druk waar de inflatie curve begint te substantieel plat, meestal 30 cm H 2 O. In de muis, maar de PV curve nog ingewikkelder met dubbele bult op de inflatie lidmaat, en indien inflatie onderdeel wordt vaak nog sterk stijgende 30 cm H2O 10, dus 30 geen goed eindpunt voor de PV curve. Daarom gebruiken we 35 cm H2O als de druk voor de muis PV curve, een druk waarbij de inflatie ledematen van alle stammen we onderzocht beginnen te vlakken.
Aangezien de PV curve zelf is zeer lineair, het uiterlijk van een PV lus afhankelijk van het volume waar de curve begint. Sommige commerciële ventilatoren gebruikers in staat om grote PV lussen doen, te beginnen met FRC, maar als de FRC volume bekend is het onmogelijk om veranderingen in zulke PV kromme met elke pathologie interpreteren, aangezien deze veranderingen eenvoudig kan resulteren uit een verandering in startvolume en niet structurele veranderingen in de longen. Dus zonder een absolute volume meting, PV curves zijn bijna onmogelijk te interpreteren en hebben dus weinig nut. Hoewel er verschillende manieren om longvolumes meten, deze vaak omslachtig en vereisen speciale uitrusting. In de eenvoudige benadering beschreven, de PV curve begint bij nul volume na een in vivo ontgassingsprocedure.
Kortom, dit document toont een eenvoudige methode long PV curve meting standaardiseren in de muizenlong en definieert verschillende metrieken die kunnen worden berekend uit deze curve die verband houden longstructuur. De PV kromme verschaft aldus een longfunctie test die rechtstreeks in het te kunnen fenotypische structurele veranderingen te detecteren in muizen met comm heefton long ziekten zoals emfyseem en fibrose.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De Johns Hopkins University Animal Care en gebruik Comite alle dierlijke protocollen.
1. apparatuur
Het samengestelde opgezet, klaar om de PV curve meten wordt getoond in figuur 1.
- Volume meting:
- Genereer een constante snelheid van inflatie en deflatie met behulp van een injectiespuit pomp met een schakelaar die het mogelijk maakt de gebruiker snel achteruit de pomp na het bereiken van de druk grenzen. Voor muis PV curves, gebruik maken van een zeer licht ingevette 5 ml glazen injectiespuit met het oorspronkelijke volume (voorafgaand aan de inflatie), vastgesteld op 3 ml lucht. 3 ml voldoende grote volumes in bijna alle muizen PV curves meten.
- Meet het volume van de pomp door het aanbrengen van een lineaire differentiaal transformator op het pomphuis, met een kleine sensor stang verbonden met de bewegende zuiger.
Opmerking: Een empirische middelen voor het corrigeren van gascompressoren in het systeem beschreven onder PV curve opname afdeling.
- Drukmeting:
- Gebruik een standaard goedkope manometer met een bereik van 0-60 cm H 2 O (0-1 PSI).
- Het opnemen van de meting:
- Om op te nemen van de PV-curve gebruik een digitale recorder met XY-mogelijkheden (bijv PowerLab). Stel de ene kanaal naar het gecorrigeerde volume signaal en een ander kanaal om de transpulmonaire druk (Ptp) opnemen, zodat de PV curve grafiek opgenomen. Gebruik een brug voorversterker die verbinding maakt met de belangrijkste Powerlab om de druk te meten. Kalibreer het perskanaal 0-40 cm H2O en kalibreren het volume kanaal 0-3 ml.
2. Correctie voor Gas Compression
Opmerking: Dit is een belangrijke eerste stap bij het opzetten, aangezien de druk toeneemt, het volume gas afneemt en daarmee de hoeveelheid lucht geleverd aan de muis steeds minder dan de verplaatsing van de Syr zijninge vat.
- Sluit de kraan die de PV-systeem maakt verbinding met de longen, zodat geen gas kan het systeem te verlaten. Start de infusie en observeren als de gecorrigeerde Volume kanaal op de recorder geeft geen meetbare veranderingen als de druk toeneemt tot ongeveer 40 cm H 2 O. Zo ja, dan correct in de volgende stappen.
- Correct zijn voor gas compressie empirisch door het aftrekken van de zuiger verplaatsing meting (dwz, de ongecorrigeerde volume) een term evenredig met de bandenspanning. Doe dit op Powerlab kanaal (genaamd Vc) om het volume signaal minus een coëfficiënt maal de druk vertonen.
- Bepaal de coëfficiënt in de vergelijking. Maak eerst een initiële gok, draai de grafiek opname op, en start de pomp. Aangezien de inflatie buis wordt afgedicht, passen de druk coëfficiëntvermenigvuldiger om de Vc kanaal gelezen nul als de druk stijgt 0-40 cm H 2 O. Als het omhoog of omlaag gaat, gewoon de correctiefactor toe te passen totdat hetblijft vlak boven dit drukgebied. Deze correctiefactor wordt altijd dezelfde zijn als dezelfde 3 ml startvolume in de spuit niet is veranderd.
3. Experimentele Tests in Muizen
- Procedure voor het meten van de PV curve bij muizen. Alle dierlijke protocollen werden goedgekeurd door de Johns Hopkins University Animal Care en gebruik Comite.
- Verdoven muizen (C57BL / 6 muizen van 6-12 weken oud) met ketamine (90 mg / kg) en xylazine (15 mg / kg), en bevestig verdoofd door de afwezigheid van reflex beweging.
Opmerking: De PV curve kan in verdoofde muizen worden voltooid in minder dan 10 min en een terminal procedure. - Tracheostomize de muizen met een 18 G stomp naaldcanule. Doe dit door een kleine incisie in de huid die over de trachea, lokaliseren de luchtpijp, dan een kleine spleet in de luchtpijp, waarbij de stomp naald worden ingebracht. Zet de canule door koppelverkoop met schroefdraad.
- Laat de muizen om te ademen 100% zuurstof gedurende ten minste 4 minuten. Dit kan via spontane ademhaling uit een zak of een ventilator nominaal set met een tidal volume van 0,2 ml 150 ademhalingen / min.
- Sluit de tracheale canule en laat 3-4 minuten voor de muis om alle zuurstof te absorberen. Dit zuurstofopname procedure leidt de dood van de dieren en in een vrijwel volledige ontgassing van de long 11. Bevestigen de dood van de muis door het meten van de stopzetting van de hartslag met ECG-elektroden of directe waarneming.
- Zodra de ontgassing van de long is voltooid en het longvolume nul, begint het opblazen van de long met kamerlucht in de injectiespuit pomp met een snelheid van 3 ml / min. Controleer de druk sporen op de digitale recorder, en wanneer het 35 cm H2O bereikt, keren de pomp.
- Volg de deflatie curve tot de druk negatief 10 cm H 2 O, en tegen die tijd de luchtwegen zijn ingestort, het opsluiten lucht in alveoli voorkomen van verdere verlaging van het volume bereikt. Reverse onmiddellijk thij weer te pompen, waardoor de long naar reinflate als de ingestorte luchtwegen te openen. Deze heterogene opening normaal blijkt de luidruchtige kijken inflatie onderdeel naar het eerste gedeelte van deze 2 inflatie.
- Wanneer de druk weer 35 cm H2O bereikt, omgekeerde pomprichting en blijven de longen leeglopen totdat deze 2 deflatie onderdeel 0 cm H2O bereikt Stop dan met de pomp.
- Bekijk de PowerLab grafiek record van druk en debiet en de PV-curve. Analyseert vervolgens de PV curve fenotypische veranderingen in longparenchym die optreden bij verschillende long pathologieën detecteren.
- Verdoven muizen (C57BL / 6 muizen van 6-12 weken oud) met ketamine (90 mg / kg) en xylazine (15 mg / kg), en bevestig verdoofd door de afwezigheid van reflex beweging.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Hoewel de procedure voor de PV curves blijkt in de video alleen gezonde controle muizen onderzochten we het vermogen van de PV curve functionele en pathologische veranderingen bij muizen sporen met twee gemeenschappelijke pathologieën, emfyseem en fibrose. Details van deze traditionele modellen beschreven elders 12,13. Zeer kort na anesthesie met 3% isofluraan het emfyseem veroorzaakt door 3 of 6 U varkens elastase instillatie in de trachea en bestudeerde 3 weken later, en fibrose veroorzaakt door 0,05 U bleo...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In dit artikel een eenvoudige reproduceerbare methode is beschreven te meten muizen een klassieke methode van fenotypering longelasticiteit, de totale long PV curve. Dergelijke krommen droegen bij de ontdekking van pulmonair surfactant en het belang verstrekken long stabiliteit. Hier wordt getoond hoe de PV kromme is ook nuttig in een middel om meerdere variabelen in verband met longelasticiteit bij volwassen muizen longen meten. Er zijn zeer significante veranderingen in alle variabelen van twee veelgebruikte muismodel...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen van de auteurs heeft financiële belangen die in conflict zouden kunnen zijn met de in deze publicatie gepresenteerde materiaal.
Dankbetuigingen
Dit werk is ondersteund door NIH HL-1034.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Spuitpomp | Harvard Apparatus | 55-2226 | Spuitpomp voor infusie/terugtrekking |
| Omkeerschakelaar pomp 22 | Harvard Apparatus | 552217 | Meegeleverd bij de pomp |
| Lineaire verplaatsingstransformator | Trans-Tek, Inc. | 0244-0000 | |
| 5 ml glazen spuit | Becton Dickenson | Verschillende andere mogelijke leveranciers | |
| Digitaal recorder | ADInstruments | PL3504 | Verschillende andere mogelijke leveranciers |
| Brugversterker signaalconditioner | ADInstruments | FE221 | |
| Gastank, 100% zuurstof | Airgas, Inc | Elke leverancier of ziekenhuisbron zal werken | |
| Druktransducer: 0 - 1 psi mV uitgang | Omega Engineering | PX-137 | Bereik ≈ 0 - 60 cm H2O |
Referenties
- Neergaard, K. v Neue Auffasungen über einn Grundbergriff der Atemtechnik. Die Retraktionskraft der unge, abhangig von den Oberflachenspannung in den Alveolen. (New interpretations of basic concepts of respiratory mechanics. Correlation of pulmonary recoil force with surface tension in the alveoli.). Zeitschrift Fur Gesamte Experi Medizin. 66, 373-394 (1929).
- Hildebrandt, J. Pressure-volume data of cat lung interpreted by a plastoelastic, linear viscoelastic model. J. Appl. Physiol. 28, 365-372 (1970).
- West, J. B. Bioengineering Aspects of the Lung. , Marcel Dekker. New York, NY. 83-162 (1977).
- Avery, M. E., Mead, J. Surface properties in relation to atelectasis and hyaline membrane disease). AMA. J. Dis. Child. 97, 517-523 (1959).
- Clements, J. A., Hustead, R. F., Johnson, R. P., Gribetz, I. Pulmonary surface tension and alveolar stability. Tech Rep CRDLR US Army Chem. Res. Dev. Lab. 3052, 1-24 (1961).
- Radford, E. P. Tissue Elasticity. Remington, J. W. , American Physiological Society. Bethesda, MD. 177-190 (1957).
- Mitzner, W., Johnson, J. W. C., Scott, R., London, W. T., Palmer, A. E. Effect of betamethasone on the pressure-volume relationship of fetal rhesus monkey lung. Journal of Applied Physiology. 47, 377-382 (1979).
- Smaldone, G. C., Mitzner, W., Itoh, H. The role of alveolar recruitment in lung inflation: Influence on pressure-volume hysteresis. Journal of Applied Physiology. 55, 1321-1332 (1983).
- Tankersley, C. G., Rabold, R., Mitzner, W. Differential lung mechanics are genetically determined in inbred murine strains. Journal of Applied Physiology. 86, 1764-1769 (1999).
- Soutiere, S. E., Mitzner, W. On defining total lung capacity in the mouse. J. Appl. Physiol. 96, 1658-1664 (2004).
- Stengel, P. W., Frazer, D. G., Weber, K. C. Lung degassing: an evaluation of two methods. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 48, 370-375 (1980).
- Limjunyawong, N., Mitzner, W., Horton, M. A mouse model of chronic idiopathic pulmonary fibrosis. Physiol Rep. 2, e00249(2014).
- Fallica, J., Das, S., Horton, M. R., Mitzner, W. Application of Carbon Monoxide Diffusing Capacity in the Mouse Lung. J. Appl. Physiol. 110, 1455-1459 (2011).
- Brown, R. H., et al. The structural basis of airways hyperresponsiveness in asthma. J. Appl. Physiol. 101 (1), 30-39 (2006).
- Smargiassi, A., et al. Ultrasonographic Assessment of the Diaphragm in Chronic Obstructive Pulmonary Disease Patients: Relationships with Pulmonary Function and the Influence of Body Composition - A Pilot Study. Respiration: International Review of Thoracic Diseases. 87 (5), 364-371 (2014).
- Mitzner, W. Airway-parenchymal interdependence. Comprehensive Physiol. 2, 1921-1935 (2012).
- Johnson, J. W., Permutt, S., Sipple, J. H., Salem, E. S. Effect of Intra-Alveolar Fluid on Pulmonary Surface Tension Properties. J. Appl. Physiol. 19, 769-777 (1964).
- Palmer, S., Morgan, T. E., Prueitt, J. L., Murphy, J. H., Hodson, W. A. Lung development in the fetal primate, Macaca nemestrina. II. Pressure-volume and phospholipid changes. Pediatr. Res. 11, 1057-1063 (1977).
- Lum, H., Mitzner, W. A species comparisonof alveolar size and surface forces. Journal of Applied Physiology. 62, 1865-1871 (1987).
- Faridy, E. E. Effect of distension on release of surfactant in excised dogs' lungs. Respir. Physiol. 27, 99-114 (1976).
- Faridy, E. E., Permutt, S., Riley, R. L. Effect of ventilation on surface forces in excised dogs' lungs. J. Appl. Physiol. 21, 1453-1462 (1966).
- Comroe, J. H., Forster, R. E., Dubois, A. B., Briscoe, W. A., Carlsen, E. The Lung: Clinical Physiology and Pulmonary Function Tests. , Year Book Medical Publishers, Inc. New York, NY. (1962).
- Martinez, F. J., et al. The clinical course of patients with idiopathic pulmonary fibrosis. Ann. Intern. Med. 142, 963-967 (2005).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
