Muggen die malaria overdragen, hebben een aantal epidemiologisch belangrijke kenmerken die alleen kunnen worden gedetecteerd met behulp van moleculaire technieken. Door gebruik te maken van een MALDI-TOF-gebaseerde SNP-genotyperingsplatform, hebben we een test ontwikkeld voor het gelijktijdig detecteren van meerdere belangrijke eigenschappen (soorten, insecticideresistentie, parasietinfectie en gastheukeuze) van malariavectoren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een Multi-detectie test voor Malaria Zenden Muggen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De Anopheles gambiae soorten complex omvat de grootste malaria overbrengen van muggen in Afrika. Omdat deze soorten zijn van dergelijke medische belang, zijn verschillende karaktertrekken typisch gekenmerkt met behulp van moleculaire tests om te helpen bij epidemiologische studies. Deze eigenschappen zijn onder andere species identificatie, resistentie tegen insecticiden, parasitaire infectie-status, en gastheer voorkeur. Aangezien populaties van Anopheles gambiae complex morfologisch niet te onderscheiden, wordt een polymerase kettingreactie (PCR) traditioneel gebruikt om soorten te identificeren. Als de soort bekend is, worden meerdere downstream assays routinematig uitgevoerd om verdere kenmerken helderen. Zo mutaties bekend als KDR in een para-gen verlenen resistentie tegen DDT en pyrethroïde insecticiden. Daarnaast enzymgekoppelde immunosorbent assays (ELISA) of Plasmodium parasiet DNA detectie PCR assays worden gebruikt om parasieten in muggen weefsels te detecteren. Tot slot, een gecombinen PCR en restrictie-enzym digesties worden gebruikt om gastheer voorkeur (bijvoorbeeld humane versus dierlijke bloed) door screening van de mug bloedmeel voor host-specifieke DNA helderen. We hebben een multi-detectietest (MDA) dat alle voornoemde assays tegelijk combineren in één multiplex reactie genotypering 33SNPs 96 of 384 monsters ontwikkeld. Omdat de MDA bevat meerdere markers voor soorten, Plasmodium detectie, en gastheer bloed identificatie, wordt de kans op het genereren van valse positieven of negatieven sterk verminderd uit eerdere testen die slechts één marker per kenmerk bevatten. Deze robuuste en eenvoudige test kan deze belangrijke mug karaktertrekken kosten-effectief en in een fractie van de tijd van de bestaande tests detecteren.
Inleiding
Anopheles arabiensis, Anopheles coluzzii en Anopheles gambiae zijn de belangrijkste vectoren die verantwoordelijk is voor de overdracht van malaria in Afrika 1. Deze drie soorten zijn morfologisch onderscheiden 2 en kan slechts worden verkregen door moleculaire assays 3-9. Daarnaast zijn er vele stroomafwaarts assays routinematig uitgevoerd epidemiologische en populatiegenetica studies steun. Deze omvatten (1) een genotyperingstest voor speciatie eilanden 10-12, (2) een genotyperingstest erkenning van niet-synoniem SNPs in de 1014 ste aminozuur codon positie para-gen (de weerstand k....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. PCR amplificatie
- Meng alle PCR-primers (zie aanvullende tabel S1) in 1,5 ml microbuisjes. Elke SNP heeft twee primers (voorwaarts en achterwaarts). Zorg ervoor dat de voorraad concentratie van elke PCR-primer bij 100 uM wordt gehouden. Maak genoeg primer mix voor 500-1.000 reacties op pipetteren fouten en tijd op de bank te verminderen (zie aanvullende tabel S2). Desgewenst aliquots per 100-200 reacties per buisje en bewaar bij -20 ° C.
- Bereid PCR cocktail zoals beschreven in protocol van de fabrikant (Tabel 1). Het volume voor 96 reacties omvat een overhang van 20%. Vortex de buis met de PCR cocktail licht en centrifugeer gedurende 30 seconde....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Identificatie van soorten:
De volgende 5 SNPs elkaar onderscheiden drie soorten (A. arabiensis, A. coluzzii en A. gambiae) (tabel 4). Als een monster is niet een van de drie soorten, de drie SNPs (01073-213, 04.679-157 en 10313 -052) niet te versterken.
KDR genotype voor het afleiden van resistentie tegen insecticiden:
De 1014 ste codon van de para volta.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De MDA bestaat uit vijf belangrijke stappen: PCR-amplificatie, garnaal alkalisch fosfatase (SAP) reactie, SNP uitbreiding, uitbreiding productconditionering en matrix-assisted laser desorptie / ionisatie - time of flight (MALDI-TOF) massaspectrometrie 33-37. De eerste PCR-amplificatie stap versterkt DNA flankerende elke SNP zodat er voldoende template DNA beschikbaar zullen zijn bij de SNP extensie stap. De SAP reactie neutraliseert ongebruikte dNTPs die kunnen interfereren met de volgende SNP extensie stap. .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Wij danken Drs. Anthony Cornel en Laura Norris aan UC Davis en Dr. Katharina Kreppel aan de Universiteit van Glasgow voor het verstrekken van mosquito exemplaren uit Tanzania. Wij danken mevrouw Smita Das en Dr. Douglas Norris van de Johns Hopkins School of Public Health voor het delen van mosquito monsters uit Zambia. We danken ook de heer Lee V. Millon bij het Veterinary Genetics Laboratory voor het trainen op assay ontwerp. Dit werk werd ondersteund door het National Institute of Health verlenen R01AI 078.183 en R21AI062929.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| MassARRAY Analyzer Compact | Sequenom | MT9 | MALDI-TOF massaspectrometrie voor genomische toepassingen om nucleïnezuren te analyseren. |
| MassARRAY Nanodispenser | Sequenom | RS1000 | Transfereert voltooide iPLEX-reactieproducten naar de SpectroCHIP |
| iPLEX Gold Genotyping Reagent Set | Sequenom | 10158 | Reagentia gebruikt voor iPLEX-assay inclusief SAP-kit. |
Referenties
- Ayala, F. J., Coluzzi, M. Chromosome speciation: humans, Drosophila, and mosquitoes. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, Suppl 1. 6535-6542 (2005).
- Coetzee, M., Craig, M., le Sueur, D. Distribution of African malaria mosquitoes belonging to the Anopheles gamb....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
