Een eenvoudige en snelle protocol bij niet-enzymatisch distantiëren Verse menselijke weefsels voor de Analyse van Infiltrating Lymfocyten

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de snelle niet-enzymatische dissociatie van verse menselijke weefselfragmenten voor kwalitatieve en kwantitatieve beoordeling van CD45⁺ cellen (lymfocyten/leukocyten) aanwezig in verschillende normale en kwaadaardige menselijke weefsels. Bovendien kan het supernatant verkregen uit het primaire weefsel homogenaat worden verzameld en bewaard voor verdere analyse of experimenten.

Samenvatting

Het vermogen van maligne cellen aan het immuunsysteem, gekenmerkt door tumor ontsnappen van zowel aangeboren en adaptieve immuunreacties ontwijken nu aanvaard als een belangrijk kenmerk van kanker. Ons onderzoek op borstkanker richt zich op de actieve rol die tumor-infiltrerende lymfocyten spelen in tumorprogressie en prognose van de patiënt. Naar dit doel hebben we een methode voor de snelle isolatie van intacte lymfoïde cellen van normale en abnormale weefsels in een poging om hen nabij hun natieve toestand te evalueren. Homogenaten bereid met een mechanische dissociator geven beide verhoogde levensvatbaarheid en cel herstel met behoud van oppervlakte receptor expressie in vergelijking met enzym-verteerd weefsels. Bovendien, enzymatische digestie van de overblijvende onoplosbare materiaal geen bijkomende CD45 ⁺ cellen aangeeft dat kwantitatieve en kwalitatieve metingen in de primaire homogenaat waarschijnlijke gezondheidstoestand van infiltrerende subpopulaties in het weefsel Fragm herstellenent. De lymfoïde cellen in deze homogenaten kunnen gemakkelijk worden gekarakteriseerd met behulp van immunologische (fenotype, proliferatie, etc.) en moleculaire (DNA, RNA en / of eiwit) nadert. CD45 ⁺ cellen kunnen ook worden gebruikt voor subpopulatie zuivering, in vitro uitbreiding of cryopreservatie. Een bijkomend voordeel van deze benadering is dat het primaire weefsel supernatant van de homogenaten worden gebruikt om te karakteriseren en te vergelijken cytokinen, chemokinen, immunoglobulinen en antigenen aanwezig in normale en maligne weefsels. Dit protocol functioneert uitstekend voor menselijk borstweefsel en dienen voor een breed scala van normale en abnormale weefsels.

Inleiding

De tumormicro-omgeving bestaat uit verschillende celtypen, waarbij talrijke studies aantonen dat ze allemaal een onderscheidende en belangrijke rol spelen in tumorigenesis^1,2. Deze omvatten, maar zijn niet beperkt tot, infiltrerende immuuncellen, stromale cellen, endotheelcellen en tumorcellen³. Ex vivo studies van tumorinfiltrerende lymfocyten (TIL; CD45⁺ cellen of leukocyten, die voornamelijk lymfocyten zijn in borsttumoren) uit verse menselijke weefselmonsters worden bemoeilijkt door hun lage frequentie, de kleine monstergroottes die vaak beschikbaar zijn voor onderzoek en het potentieel voor verlies van levensvatbaarheid tijdens extractie. Omdat immuuncellen die tumoren infiltreren meestal aanwezig zijn als passagiers in plaats van permanente bewoners, zijn ze over het algemeen gemakkelijker te loslaten uit de weefselmatrix.

Het dissociëren van tumorweefsel terwijl de cellulaire integriteit behouden blijft, is technisch uitdagend en is traditioneel uitgevoerd met behulp van een combinatie van mechanische en enzymatische stappen om enkele celsuspensies te bereiden^4-8. Deze aanpak omvat lange incubatieperioden en gaat gepaard met een significante vermindering van de celviabiliteit evenals het verlies van celoppervlaktereceptoren door enzymatische splitsing. Hoogwaardige flowcytometrische studies die TIL in de tumormicro-omgeving karakteriseren, evenals schone zuiveringen van CD45⁺ subpopulaties door middel van flowcytometrie of antilichaam-gecoate kralen, zijn moeilijker te bereiken uit enzym-gedigesteerd tumorweefsel. Bovendien is het supernatant (SN) van het resulterende tumorhomogenaat niet geschikt voor verdere analyse, inclusief kwantificering van gesecreteerde eiwitten (cytokinen, chemokinen, immunoglobulinen of tumorantigenen) of experimentele behandeling van normale cellen, vanwege het potentieel voor eiwitdegradatie in de enzymatische digests.

In onze zoektocht naar een methode om enkele celhomogenaten uit borstweefsels voor te bereiden [inclusief tumor, niet-aangrenzende niet-tumor (NANT) en normale (van mammaverkleiningen) borstweefsels] zonder enzymatische vertering, hebben we een verscheidenheid aan mechanische homogenisatietechnieken getest. Homogenaten bereid met behulp van een mechanische dissociator hadden een verhoogde celviabiliteit (2-voudig) en totale celherstel (2-voudig) terwijl de expressie van oppervlaktereceptoren behouden bleef. Enzymatische vertering van het resterende onoplosbare materiaal herstelde geen extra CD45⁺ cellen, wat suggereert dat ze allemaal vrijgelaten waren in de initiële homogenisatie. Dus, deze snelle en eenvoudige aanpak maakt zowel kwalitatieve als kwantitatieve beoordeling van de CD45⁺ subpopulaties die aanwezig zijn in verschillende normale en kwaadaardige menselijke weefsels mogelijk. Een extra voordeel van deze aanpak is dat het SN van de initiële homogenisatie (primaire weefsel-SN) kan worden verzameld en opgeslagen voor verdere analyse of experimenten.

Protocol

OPMERKING: Alle specimens verkregen werden met behulp van een protocol dat door de Medisch Ethische Commissie van het Instituut Jules Bordet goedgekeurd met schriftelijke toestemming verkregen van elke patiënt.

1. Bereiding van het weefselhomogenaat

1. Ontleden gereseceerde weefsels (maligne en normaal weefsel weggesneden uit de operatiekamer) zijn in de pathologie lab door opgeleid personeel voor onmiddellijke pickup. Tumor, NANT (die het verst van de tumor mogelijk) en normaal weefsel fragmenten worden routinematig verwerkt binnen 1-3 uur van chirurgische excisie in een BSL2 laboratorium onder toepassing van standaard biologische veiligheid procedures voor menselijke weefsels. Een stroomschema van het protocol is geïllustreerd in figuur 1.
2. Weeg alle weefselfragmenten (normaal, NANT en tumor) en meet de lengte, breedte en hoogte (lengte x breedte x hoogte). Dit is een belangrijke stap voor de verdere normalisatie van cel subpopulaties, geëxtraheerd RNA, etc.
   NOTE: Het bereik van de steekproef is 100 tot 10.000 mm ³ met geen vet, indien mogelijk.
3. Imprint de tumor fragment op een glasplaatje voor H & E kleuring om te controleren of het weefsel is eigenlijk een deel van de tumor.
   1. Doe dit door het indrukken van een glazen microscoop dia op de tumor fragment en het toepassen van lichte druk met de vingers voor een paar seconden.
   2. Bevestig de dia met isopropanol gedurende 2 min gevolgd door een wasstap met water. Tegenkleuring het weefsel gedurende 30 seconden met Mayer's hematoxyline.
   3. Was de dia in zes baden van water. Vlekken in Phloxine B 2% gedurende 15 sec.
   4. Wassen in een bad van water, gevolgd door vier baden van isopropanol en afwerking met een bad van water.
   5. Incubeer in isopropanol gedurende 1 min en afvoer. Duidelijk in twee baden van xyleen.
   6. Monteer met xyleen op basis van montage medium. Onderzoek voor tumor cellulariteit (figuur 2).
      OPMERKING: Hoofdzakelijk, tumorcellen vasthouden aan de bedrukte slide - de stromale, lymfoïde of adipose cellen zelden blijven, waardoor ruimten tussen de tumorcellen (figuur 2).
4. Plaats het weefsel fragment in een kleine kweekschaal die 1 ml chemisch gedefinieerd serumvrij hematopoietische celmedium (hierna gemiddeld) bij kamertemperatuur en snijd het in kleine stukjes (~ 1-2 mm ²⁾ met een steriele scalpel.
5. Transfer alles (weefselfragmenten + gemiddeld) om een ​​mechanische dissociator C buis.
6. Spoel het petrischaaltje scalpel met 2 ml medium met behulp van een Pasteur pipet en voeg deze aan de C buis (volume medium voor dissociatie = 3 ml).
7. Gebruik het mechanische dissociator programma A.01 voor C buizen (de meest zachtaardige programma) om het weefsel fragmenten homogeniseren in een enkele celsuspensie. Plaats de C buis in het apparaat en tweemaal start het programma in elkaar (een cyclus = 25 sec).
   OPMERKING: Deze homogenisering procedure is vastgesteld en gevalideerd voor menselijke borstweefsel, andere tumof of weefsel typen kan nodig zijn om een ​​ander programma te gebruiken en moet eerst worden getest.
8. Verwijder de C buis uit het apparaat en giet het homogenaat direct in een 40 micrometer cel zeef gezeten op een 50 ml buis. Met dezelfde Pasteur pipet als in stap 1.6, overdracht vloeistof die in de C buis naar cel zeef.
9. Breng de gefilterde vloeistof in een buis van 15 ml met behulp van een 1 ml micropipet tip. Tijdelijk houden de cel zeef en haar 50 ml buis.
10. Spoel de C buis met een extra 3 ml medium en breng dit opnieuw met dezelfde Pasteur pipet als in stap 1.6, de cel zeef nog gezeten op de 50 ml buis. Knijp een maximumbedrag van de resterende vloeistof opgesloten in de unhomogenized weefsel in de 50 ml buis door het voorzichtig bewegen rond de zeef met een schone Pasteur pipet of 1 ml tip die vervolgens wordt weggegooid om te voorkomen dat besmetting van het eluaat.
11. Plaats de cel zeef ondersteboven op thij oorspronkelijk C buis en spoel met 3 ml medium zodat de unhomogenized weefsel valt terug in de C buis.
12. Opnieuw homogeniseren zoals in stap 1.7 twee cycli van het A.01 programma.
13. Giet deze tweede homogenaat door de cel zeef gezeten op de 50 ml tube, spoel de C buis opnieuw met 3 ml medium (zoals in stap 1.10) en breng met het Pasteur pipet om de cel zeef gezeten op de 50 ml buis weer knijpen een maximum hoeveelheid vloeistof uit de resterende bindweefsel opgesloten in de cel zeef.
14. Op dit moment, een volume van ~ 2,5 ml in de 15 ml buis ~ 9 ml in de 50 ml buis.

2. Scheiding van de Tissue supernatant en Cellen

1. Centrifugeer de homogenaten in de 15 ml en 50 ml buisjes gedurende 15 min bij 600 xg bij kamertemperatuur.
2. Decanteer de SN van de 15 ml buis in een schone buis en tijdelijk bewaren bij 4 ° C. Dit supernatant = primaire tumor, NANT of normale tissue SN (eindvolume 2,5 ml) wordt vervolgens toegelicht en in porties verdeeld voor opslag bij -80 ° C voor latere analyse (zie hieronder).
3. Verwijder het supernatant van de 50 ml buis.
4. Voorzichtig mengen zowel celpellets in een eindvolume van 1 ml medium. In het kort, eerst voorzichtig breken de celpellet in beide buizen (de buis te tikken op een hard oppervlak). Resuspendeer de losse cel pellet in 50 ml met 500 pl medium en breng deze celsuspensie aan de 15 ml buis de tweede pellet te resuspenderen. Herhaal deze stap een keer met de tweede 500 ul medium voor een maximaal herstel van de cellen.
5. Breng 10 pl van de celsuspensie aan een buisje, meng met 10 ui trypan blauw (verdunning 1: 1) en tel het aantal levensvatbare cellen met een hemocytometer.
   OPMERKING: Op dit punt een fractie van de celsuspensie kan ook worden geanalyseerd door flow cytometrie celgrootte, granulariteit beoordelen en desgewenst een beperkt aantal subpopulatie markers voor meer precise evaluatie van de relatieve celverdeling in het homogenaat voor uitgebreide analyse en experimenten. Alle analyses door flowcytometrie nemen CD45 etikettering voor normalisering van de subpopulaties.
6. Pellet de cellen door centrifugatie bij 300 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. De cellen van de tumor, NANT of normaal weefsel zijn nu klaar voor verdere zuivering of analyse. Deze extra stappen zijn best wanneer uitgevoerd op dezelfde dag als de operatie.
   OPMERKING: Voor flowcytometrische analyse maar niet celsortering de resterende rode bloedcellen dienen na antilichaamidentificatie worden gelyseerd door toevoeging van 0,4 ml van rode bloedcellen lysisbuffer aan de celpellet, onmiddellijk vortexen 1 sec en het incuberen van ten minste 10 minuten bij kamertemperatuur temperatuur (beschermd tegen licht) voor de analyse.

3. Verduidelijking van de Tissue Supernatant

1. Centrifugeer de buisjes van 1,5 ml met weefsel SN bij 15.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C.
2. Verwijder voorzichtig tHij vloeistof zonder te raken of de pellet te verstoren. Over te dragen aan een schone buis (of buizen), afhankelijk van het aantal en de omvang van de porties gewenst.
3. Bewaar het supernatant bij -80 ° C voor toekomstig gebruik.

4. Patiënt Blood

1. Verzamel een bloedmonster uit elke patiënt een controle door venapunctie in gehepariniseerde buizen de dag vóór de operatie. Centrifugeer het bloed bij 400 xg gedurende 10 min bij 20 ° C met de rem van het plasma en een bufferlaag verkrijgen.
2. Verwijder het plasma en verduidelijkt door centrifugatie bij 10.000 xg gedurende 15 min bij 20 ° C. Aliquot en bewaar plasma bij -80 ° C voor toekomstig gebruik. Verdun de buffy coat in middelgrote
3. Scheid de mononucleaire cellen met behulp van standaard Ficoll-Hypaque centrifugatie voor onmiddellijke analyse subpopulatie isolatie, DNA / RNA / eiwit-extractie of cryopreservatie.

5. flowcytometrie

1. Etiket cellen volgens de fabricageinstructies r's bij 4 ° C, beschermd tegen licht. Lyse rode bloedcellen in celsuspensies van weefselfragmenten na antilichaamidentificatie door toevoeging van 0,4 ml lysis buffer op de celpellet.
2. Vortex onmiddellijk gedurende 1 seconde en incubeer ten minste 10 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Steek de gelabelde cellen in een flowcytometer voor gegevensverzameling zonder te wassen.

Resultaten

Enzymatische digestie van weefsel fragmenten met hetzij commercieel verkrijgbaar weefsel dissociatie oplossingen of diverse laboratorium mengsels van collagenase, DNase en / of hyaluronidase remmers, splitsen diverse receptoren op het celoppervlak. Onze studies, richtte zich op CD4 ⁺ T-cellen infiltrerende borsttumoren, werden snel gepresenteerd met een groot technisch probleem door splitsing van het oppervlak CD4 receptoren middels standaard enzymatische digestie protocollen ^4-8. We testten versch...

Discussie

Deze studie beschrijft een geoptimaliseerde werkwijze voor de snelle bereiding van normaal en kwaadaardig borstweefsel homogenaten zonder enzymatische digestie voor daaropvolgende celsortering, extractie, cryopreservatie en / of fenotypische analyse van CD45 ⁺ subpopulaties. Het doel van deze experimentele aanpak is om beelden van de TIL die nauw geven hun in vivo staat en ze te vergelijken met normale weefsels met een minimum aan manipulatie van de weefsels vers van de operatiekamer te produceren. T...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
GentleMacs Dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235	BD Medimachine is enigszins gelijkwaardig
Centrifuge 5810 R	Eppendorf		of andere standaard tafelcentrifuge
Centrifuge 5417 R	Eppendorf		of andere standaard microcentrifuge
Esco Class II A2 Biosafety Cabinet	ESCO global		of andere standaard BSL2-afzuigkap
Inverted Microscope	Nikon eclipse TS100		of andere microscoop compatibel voor een hematocytometers
Bürker Chamber	Marienfield	640210	of andere standaard hematocytometers
Navios Flow Cytometer	Beckman Coulter		of andere flowcytometer (8-10 kleuren aanbevolen)
GentleMacs C-Tube	Miltenyi Biotec	130-096-344	BD Medimachine gebruikt Filcon
Cell Culture Dish	Sarstedt	72,710	of ander niet-pyrogeen kunststof
Disposable Scalpel	Swann-Morton	0510	of standaard eenmalig steriele scalpel
BD Cell Strainer 40 µm	Becton Dickinson	734-0002	of ander niet-pyrogeen kunststof
BD Falcon Tube 50 ml	Becton Dickinson	352070	of ander niet-pyrogeen kunststof
BD Falcon Tube 15 ml	Becton Dickinson	352097	of ander niet-pyrogeen kunststof
BD FACS Tube 5 ml	Becton Dickinson	352008	of ander niet-pyrogeen kunststof
Sterile Pasteur Pipette 5 ml	VWR	612-1685	of ander niet-pyrogeen kunststof
Microfuge Tube 1.5 ml	Eppendorf	7805-00	of ander niet-pyrogeen kunststof
X-Vivo 20	Lonza	BE04-448Q	serumvrij medium aanbevolen
Phosphate buffered saline	Lonza	BE17-516F	standaard fysiologische PBS
Trypan blue	VWR	17942E	of andere vitale kleurstof
VersaLyse	Beckman Coulter	A09777	voor flowcytometrie-experimenten
Fixable viability Dye eFluor 780	eBioscience	65-0865-14	voor flowcytometrie-experimenten
anti-CD3 FITC	BD Biosciences	345763	voor flowcytometrie-experimenten
anti-CD3 Vio Blue	Miltenyi Biotec	130-094-363	voor flowcytometrie-experimenten
anti-CD4 PE	BD Biosciences	345769	voor flowcytometrie-experimenten
anti-CD4 APC	Miltenyi Biotec	130-091-232	voor flowcytometrie-experimenten
anti-CD8 ECD	Beckman Coulter	737659	voor flowcytometrie-experimenten
anti-CD8 PerCP	BD Biosciences	345774	voor flowcytometrie-experimenten
anti-CD19 APC-Vio770	Miltenyi Biotec	130-096-643	voor flowcytometrie-experimenten
anti-CD45 VioGreen	Miltenyi Biotec	130-096-906	voor flowcytometrie-experimenten