Dit protocol beschrijft de snelle niet-enzymatische dissociatie van verse menselijke weefselfragmenten voor kwalitatieve en kwantitatieve beoordeling van CD45+ cellen (lymfocyten/leukocyten) aanwezig in verschillende normale en kwaadaardige menselijke weefsels. Bovendien kan het supernatant verkregen uit het primaire weefsel homogenaat worden verzameld en bewaard voor verdere analyse of experimenten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een eenvoudige en snelle protocol bij niet-enzymatisch distantiëren Verse menselijke weefsels voor de Analyse van Infiltrating Lymfocyten
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het vermogen van maligne cellen aan het immuunsysteem, gekenmerkt door tumor ontsnappen van zowel aangeboren en adaptieve immuunreacties ontwijken nu aanvaard als een belangrijk kenmerk van kanker. Ons onderzoek op borstkanker richt zich op de actieve rol die tumor-infiltrerende lymfocyten spelen in tumorprogressie en prognose van de patiënt. Naar dit doel hebben we een methode voor de snelle isolatie van intacte lymfoïde cellen van normale en abnormale weefsels in een poging om hen nabij hun natieve toestand te evalueren. Homogenaten bereid met een mechanische dissociator geven beide verhoogde levensvatbaarheid en cel herstel met behoud van oppervlakte receptor expressie in vergelijking met enzym-verteerd weefsels. Bovendien, enzymatische digestie van de overblijvende onoplosbare materiaal geen bijkomende CD45 + cellen aangeeft dat kwantitatieve en kwalitatieve metingen in de primaire homogenaat waarschijnlijke gezondheidstoestand van infiltrerende subpopulaties in het weefsel Fragm herstellenent. De lymfoïde cellen in deze homogenaten kunnen gemakkelijk worden gekarakteriseerd met behulp van immunologische (fenotype, proliferatie, etc.) en moleculaire (DNA, RNA en / of eiwit) nadert. CD45 + cellen kunnen ook worden gebruikt voor subpopulatie zuivering, in vitro uitbreiding of cryopreservatie. Een bijkomend voordeel van deze benadering is dat het primaire weefsel supernatant van de homogenaten worden gebruikt om te karakteriseren en te vergelijken cytokinen, chemokinen, immunoglobulinen en antigenen aanwezig in normale en maligne weefsels. Dit protocol functioneert uitstekend voor menselijk borstweefsel en dienen voor een breed scala van normale en abnormale weefsels.
Inleiding
De tumormicro-omgeving bestaat uit verschillende celtypen, waarbij talrijke studies aantonen dat ze allemaal een onderscheidende en belangrijke rol spelen in tumorigenesis1,2. Deze omvatten, maar zijn niet beperkt tot, infiltrerende immuuncellen, stromale cellen, endotheelcellen en tumorcellen3. Ex vivo studies van tumorinfiltrerende lymfocyten (TIL; CD45+ cellen of leukocyten, die voornamelijk lymfocyten zijn in borsttumoren) uit verse menselijke weefselmonsters worden bemoeilijkt door hun lage frequentie, de kleine monstergroottes die vaak beschikbaar zijn voor onderzoek en het potentieel voor verlies van levensvatbaarheid t....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
OPMERKING: Alle specimens verkregen werden met behulp van een protocol dat door de Medisch Ethische Commissie van het Instituut Jules Bordet goedgekeurd met schriftelijke toestemming verkregen van elke patiënt.
1. Bereiding van het weefselhomogenaat
- Ontleden gereseceerde weefsels (maligne en normaal weefsel weggesneden uit de operatiekamer) zijn in de pathologie lab door opgeleid personeel voor onmiddellijke pickup. Tumor, NANT (die het verst van de tumor mogelijk) en normaal weefsel fragmenten worden routinematig verwerkt binnen 1-3 uur van chirurgische excisie in een BSL2 laboratorium onder toepassing van standaard biologisch....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Enzymatische digestie van weefsel fragmenten met hetzij commercieel verkrijgbaar weefsel dissociatie oplossingen of diverse laboratorium mengsels van collagenase, DNase en / of hyaluronidase remmers, splitsen diverse receptoren op het celoppervlak. Onze studies, richtte zich op CD4 + T-cellen infiltrerende borsttumoren, werden snel gepresenteerd met een groot technisch probleem door splitsing van het oppervlak CD4 receptoren middels standaard enzymatische digestie protocollen 4-8. We testten versch.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Deze studie beschrijft een geoptimaliseerde werkwijze voor de snelle bereiding van normaal en kwaadaardig borstweefsel homogenaten zonder enzymatische digestie voor daaropvolgende celsortering, extractie, cryopreservatie en / of fenotypische analyse van CD45 + subpopulaties. Het doel van deze experimentele aanpak is om beelden van de TIL die nauw geven hun in vivo staat en ze te vergelijken met normale weefsels met een minimum aan manipulatie van de weefsels vers van de operatiekamer te produceren. T.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat er geen belangenconflict bestaat.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door subsidies fromthe Belgisch Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FNRS), Les Amis de l'Institut Bordet, FNRS-Opération Televie, Plan Cancer van België, Fonds Lambeau-Marteaux, Fonds JC Heuson en Fonds Barsy.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| GentleMacs Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | BD Medimachine is enigszins gelijkwaardig |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | of andere standaard tafelcentrifuge | |
| Centrifuge 5417 R | Eppendorf | of andere standaard microcentrifuge | |
| Esco Class II A2 Biosafety Cabinet | ESCO global | of andere standaard BSL2-afzuigkap | |
| Inverted Microscope | Nikon eclipse TS100 | of andere microscoop compatibel voor een hematocytometers | |
| Bürker Chamber | Marienfield | 640210 | of andere standaard hematocytometers |
| Navios Flow Cytometer | Beckman Coulter | of andere flowcytometer (8-10 kleuren aanbevolen) | |
| GentleMacs C-Tube | Miltenyi Biotec | 130-096-344 | BD Medimachine gebruikt Filcon |
| Cell Culture Dish | Sarstedt | 72,710 | of ander niet-pyrogeen kunststof |
| Disposable Scalpel | Swann-Morton | 0510 | of standaard eenmalig steriele scalpel |
| BD Cell Strainer 40 µm | Becton Dickinson | 734-0002 | of ander niet-pyrogeen kunststof |
| BD Falcon Tube 50 ml | Becton Dickinson | 352070 | of ander niet-pyrogeen kunststof |
| BD Falcon Tube 15 ml | Becton Dickinson | 352097 | of ander niet-pyrogeen kunststof |
| BD FACS Tube 5 ml | Becton Dickinson | 352008 | of ander niet-pyrogeen kunststof |
| Sterile Pasteur Pipette 5 ml | VWR | 612-1685 | of ander niet-pyrogeen kunststof |
| Microfuge Tube 1.5 ml | Eppendorf | 7805-00 | of ander niet-pyrogeen kunststof |
| X-Vivo 20 | Lonza | BE04-448Q | serumvrij medium aanbevolen |
| Phosphate buffered saline | Lonza | BE17-516F | standaard fysiologische PBS |
| Trypan blue | VWR | 17942E | of andere vitale kleurstof |
| VersaLyse | Beckman Coulter | A09777 | voor flowcytometrie-experimenten |
| Fixable viability Dye eFluor 780 | eBioscience | 65-0865-14 | voor flowcytometrie-experimenten |
| anti-CD3 FITC | BD Biosciences | 345763 | voor flowcytometrie-experimenten |
| anti-CD3 Vio Blue | Miltenyi Biotec | 130-094-363 | voor flowcytometrie-experimenten |
| anti-CD4 PE | BD Biosciences | 345769 | voor flowcytometrie-experimenten |
| anti-CD4 APC | Miltenyi Biotec | 130-091-232 | voor flowcytometrie-experimenten |
| anti-CD8 ECD | Beckman Coulter | 737659 | voor flowcytometrie-experimenten |
| anti-CD8 PerCP | BD Biosciences | 345774 | voor flowcytometrie-experimenten |
| anti-CD19 APC-Vio770 | Miltenyi Biotec | 130-096-643 | voor flowcytometrie-experimenten |
| anti-CD45 VioGreen | Miltenyi Biotec | 130-096-906 | voor flowcytometrie-experimenten |
Referenties
- Chen, D. S., Mellman, I. Oncology meets immunology: the cancer-immunity cycle. Immunity. 39 (1), 1-10 (2013).
- Boudreau, A., van't Veer, J. L., Bissell, M. J. An 'elite hacker': breast tumors exploit the normal microenvironment pr....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
