Radial Mobiliteit en cytotoxische functie van retrovirale replicerende vector getransduceerde, niet-klevende Alloresponsive T-lymfocyten

Summary

We beschrijven een protocol om de radiale mobiliteit van niet-aderente immuuncellen in vitro te monitoren met behulp van een celsedimentatie manifold/slide apparaat. Celmigratie wordt gevolgd op monolagen van tumorcellen of op extracellulaire matrix-eiwitten. Onderzoek door licht- en fluorescentiemicroscopie maakt observatie van celmobiliteit en cytotoxische functionaliteit mogelijk.

Abstract

Wij rapporteren een nieuwe aanpassing van de radiale monolaag celmigratie analyse, voor het eerst bij de radiale migratie van hechtende tumorcellen op extracellulaire matrixeiwitten maat voor meting van de motiliteit van fluorescent-gelabelde, niet-hechtende menselijke of murine effector immuuncellen. Deze techniek maakt gebruik van een roestvrij stalen spruitstuk en 10 putjes Teflon dia focaal niet-hechtende T-cellen storten putjes bereid met ofwel confluente monolagen tumorcellen of extracellulaire matrixeiwitten. Licht en / of multi-channel fluorescentie microscopie gebruikt om de bewegingen en het gedrag van de effector cellen te volgen in de tijd. Fluorescente kleurstoffen en / of virale vectoren die coderen voor fluorescerende transgenen worden gebruikt om differentieel labelen celtypen voor beeldvorming. Deze methode onderscheidt zich van soortgelijke type in vitro testen die horizontale of verticale migratie / invasie gebruik te maken van dia kamers, agar of transwell borden volgen. De test maakt het mogelijk gedetailleerde beeldvorming gegevens naar be verzameld verschillende celtypen onderscheiden door specifieke fluorescente merkers; zelfs specifieke subpopulaties van cellen (dat wil zeggen getransduceerd / nontransduced) kan worden gecontroleerd. Oppervlakte fluorescentie intensiteit plots worden gegenereerd middels fluorescentie kanalen die overeenkomen met het type migrerende cel. Dit zorgt voor een betere visualisatie van de niet-hechtende immune mobiliteit cel op specifieke tijden. Het is mogelijk om het bewijs van andere effector celfuncties, zoals cytotoxiciteit of overdracht van virale vectoren van effectorcellen verzamelen aan doelcellen, ook. Zo is de methode stelt onderzoekers microscopisch document cel-cel interacties van differentieel gelabelde, niet-hechtende met hechtende cellen van verschillende soorten. Dergelijke informatie kan met name relevant voor de beoordeling van biologisch-gemanipuleerd of geactiveerde immuunsysteem celtypen, waar visueel bewijs van functionaliteit gewenst is met tumordoelcellen cellen vóór het gebruik ervan voor de behandeling van kanker zijn.

Introduction

De radiale monolaag celmigratie assay werd oorspronkelijk ontwikkeld om de infiltrative eigenschappen hechtende tumorcellen ^1-4 meten op objectglaasjes bekleed met extracellulaire matrix (ECM) proteïnen ^5-7 of afzonderlijke ECM componenten zoals fibronectine of laminine ^1,2. De techniek betrokken zaaien een enkele celsuspensie van tumorcellen in het centrum van putjes met een roestvrij stalen cel sedimentatie verdeelstuk (CSM). Na sedimentatie, zou de tumorcellen hechten aan de bodem van de put en de verandering in de diameter van de initiële celpopulatie tijd werd gebruikt om een ​​hoeveelheid van horizontale motiliteit vast. De radiale monolaag celmigratie analyse leverde een visueel voordeel boven andere bestaande methodes die transwell platen om de in vitro migratie capaciteiten van cellen assay toegepast; Deze testen zijn niet bevorderlijk imaging ^8. Als goed, zij ook een grote mate van vrijheid in het kiezen van het tijdstips wanneer de migratie wordt beoordeeld, met geen limiet op het aantal tijdstippen een onderzoeker kon kiezen om het beeld na sedimentatie.

Omdat het vermogen om te migreren een belangrijke functionaliteit voor niet-hechtende cellen, vooral op het gebied van immunotherapie of wanneer deze kunnen worden gebruikt als afgiftevehikels voor virale vectoren, passen wij het gebruik van de CSM om de migratie van niet-hechtende cellen te evalueren types op tumorcel monolagen, naast ECM eiwitten. Het extra voordeel van microscopisch visualiseren migratie van niet-hechtende cellen op levensvatbare tumorcellen monolagen op complexe ECM geïsoleerd uit de tumor, of op afzonderlijke ECM componenten maakt deze assay veelzijdig. Testen die putten gecoat met een enkel extracellulair proteïne in dienst weerspiegelen niet nauwkeurig de ECM weefsel substraat of tumor van de cellen zou door migreren in vivo.

Hier hebben we gebruikt alloreactieve cytotoxische T-lymfocyten (alloCTL), lichtgevoelig tot grote histocompatibility complex (MHC) eiwitten met een enkele gemengde lymfocyt tumorcel reactie (MLTR) of gemengde lymfocyt reactie (MLR) ⁹ onze representatieve niet-hechtende celtype. We testten cellen van zowel menselijke en murine oorsprong. Toen migratie werd gemeten tumor monolagen, de tumorcellen toegepast werden ofwel gedeeltelijk relevant targets, tonen enkele van dezelfde MHC-eiwitten op de celpopulatie gebruikt om de effectoren of volledig relevante doelen sensibiliseren met een volledige set van MHC moleculen die de effectoren werden gesensibiliseerd richting. In sommige experimenten gebruikten we fluorescerende CellTracker Rode CMPTX of celproliferatie kleurstof eFluor 670 om onderscheid te maken tussen effector en doelcellen. Wij gebruikten ook transductie met virale vectoren coderen voor fluorescerende eiwitten als een extra manier om de cellen te visualiseren. Voor bepaalde tests, we getransduceerde de alloCTL met retrovirale replicerende vectoren (RRV) codering voor Emerald Green (EMD) fluorescerend eiwit ^10,11; voor others, tumorcellen getransduceerd met lentivirale vectoren die coderen voor mStrawberry.

De alloCTL werden geënt door een kanaal van het verdeelstuk naar het centrum van beide tumorcel monolagen of ECM geoogst van tumorcellen monolagen. Hechtende en niet-hechtende cel interacties werden gevisualiseerd door licht en / of door fluorescentie microscopie tijd. Verstoring in de tumorcel monolaag bij laag vermogen, of tumorcellen met gefragmenteerde kernen op hoog vermogen waren indicatoren van celschade door lysis en apoptose, respectievelijk. We digitaal gemaakt oppervlak intensiteit fluorescerende kaarten die de migratie van niet-klevende fluorescerende T-cellen in de monolaag culturen. We hebben ook kennis genomen van de cytotoxiciteit veroorzaakt aan de aanhanger glioom celmonolaag na clustervorming van de overlay niet hechtende alloCTL. Als goed, horizontale transductie van RRV-EMD uit de alloCTL aan de glioom monolaag werd waargenomen.

Protocol

1. Schuif Voorbereiding

1. Plaats Cell Sedimentatie Manifold dia's in sterilisatie zakjes en sluit met autoclaaf tape. Het gezicht van de Teflon-gecoate zijde van de schuif het papier-kant van de tas aan plastic afzettingen op de putten te vermijden.
2. Autoclaaf zakjes gedurende 15 minuten bij 121 ° C.
3. Verwijder dia uit sterilisatie zakje binnenin een bioveiligheid kast en plaats in een steriele 150 x 15 mm steriele petrischaal. Er kunnen maximaal vier dia's kunnen passen per gerecht. Plaats een 35 x 10 mm petrischaal naast de dia. Voeg 2-3 ml steriele H ₂ O tot luchtbevochtiging.
4. Pre-coat slides met poly-D-lysine bij 100 ug / ml met voldoende volume om de hele afdekken. Na één uur bij KT, zuigen de oplossing en spoel het oppervlak van de put tweemaal pipetteren 1x PBS over het oppervlak van de putjes.
5. Voeg desgewenst fibronectine of andere ECM componenten sterker tumorcel hechting te garanderen. Fibronectine Opslaan bij 5 ug / ml in voldoende volume that de putjes droogt niet binnen een korte tijdsperiode bij kamertemperatuur.
   1. Na 1 uur, zuig het overgebleven oplossing en tweemaal wassen door en neer te pipetteren met 1x PBS.
6. Houd PBS op de putjes totdat tumor klaar voor plating. Gebruik schuift op dezelfde dag.
7. Oogst een samenvloeiing kolf van het gewenste aanhangend tumorceltype. Count levensvatbare cellen met behulp van trypaanblauw kleurstofuitsluiting met lichtmicroscopie en resuspendeer in 5 x 10 ⁶ cellen / ml in voldoende gebufferd groeimedium, bijvoorbeeld Dulbecco's minimaal essentieel medium (DMEM) met 10% foetaal runderserum (FBS), L- glutamine en natrium- pyruvaat.
8. Als fluorescente beeldvorming van de hechtende celpopulatie gewenst, etiketteren de hechtende celpopulatie een vitale fluorescente kleurstof of celproliferatie kleurstof volgens de protocollen van de fabrikant.
9. Regelmatig Pipetteer 10 ul compleet medium in elk putje van de schuif zorg om te voorkomen dat luchtbellen in de wells, omdat deze uniform tumorcel hechting te voorkomen.
10. Voeg 2,5-5,0 x 10 ⁴ cellen (5-10 pi celsuspensie) aan het medium in elk putje (figuur 1A). Stel het optimale aantal afhankelijk tumor celtype en het aantal dagen groei gewenst. Grotere tumorcellen of snelgroeiende cellen kunnen minder cellen aanvankelijk te eisen. Breng goed volume tot 40 pi door toevoeging medium en pipet op en neer een gelijkmatige verdeling van de cellen te waarborgen.
11. Immers putjes gezaaid, zodat de tumorcellen te hechten bij KT plaats het deksel op de 150 x 15 mm petrischaal en voorzichtig bewegen de schotel naar een 37 ° C / 5% _CO2 bevochtigde incubator gedurende ten minste 24 uur.
12. Veranderen dagelijks het kweekmedium. Pipetteer voorzichtig een gedeelte van het verbruikte medium van de monolaag en vervangen door vers compleet medium.
    Opmerking: Door verdamping, meer volume moeten worden toegevoegd dan werd afgesloten. Wells zal klaar zijn voor de test zijn wanneer een gelijkmatige, confluent laag cellen aanwezig is. Dit is typisch 1-3 dagen na de eerste zaaien.
13. Was monolaag voorzichtig eenmaal met PBS zoals beschreven in stap 1.4 en ofwel verder naar stap 2 als monolagen gewenst of hieronder stap 1.13 ECM eiwitten extraheren van de monolaag.
14. Voeg een 0,5% Triton-X (v / v) oplossing in compleet medium en voeg 30 ul aan elk putje. Laat monolaag verteren kap 2 min, vervolgens tweemaal wassen met volledig medium gepipetteerd zoals hierboven beschreven.
    OPMERKING: De ECM laag kan zichtbaar door lichtmicroscopie (figuur 2) zijn. Gebruik dia's meteen, of in compleet medium te houden in de bevochtigde CO ₂ incubator voor 1-2 dagen. Sta niet toe dat putten uit te drogen.

2. sedimentatie van niet-klevende T-cellen op Slide

1. Als fluorescente beeldvorming van de niet-hechtende celpopulatie gewenst, etiketteren de niet-hechtende celpopulaties met een vitale fluorescerende kleurstof, zoals CFSE, Cell Tracker Rood CMPTX of eFluor670 volgens de protocollen van de fabrikant ten minste 1 uur vóór de test. Als alternatief, manipuleren cellen om fluorescerende eiwitten gecodeerd door virale vectoren te uiten.
2. Autoclaaf de cel sedimentatie spruitstuk in een autoclaaf zakje zoals beschreven in 1.2 hierboven.
3. Verwijder de vochtige kamer met Teflon gecoate glaasjes uit de incubator en plaats in bioveiligheidskast.
4. Was putjes met 1x PBS en neer te pipetteren, voeg 45 ul compleet medium dat ten minste 10% serum.
5. Verwijder het verdeelstuk uit de sterilisatie envelop en schuif in de putjes totdat het "haak aan het einde van het verdeelstuk raakt de onderzijde van de slede (Figuur 1B).
6. Zorg ervoor dat het kweekmedium zichtbaar in elk van de kanalen. Als er geen wordt gezien, neem het spruitstuk en voeg meer medium om de corresponderende goed, dan is vervangen en opnieuw controleren.
7. Herhaal stap 2.5 per Channel van het spruitstuk, of voor zo vele putten zoals gewenst.
8. Graaf niet-hechtende cellen en resuspendeer in liefst 1,0-2,0 x 10 ⁵ / ul. Opstellen van 1 pl van cellen en langzaam pipet ze in het kanaal (figuur 1C). Doe dit voor elke wel gewenst.
9. Laat de gehele cel geladen inrichting, namelijk, spruitstuk en schuif, in de bio-kap gedurende 20-30 minuten om de cellen in het kanaal te regelen.
10. Verwijder het verdeelstuk door op beide uiteinden en voorzichtig recht omhoog te tillen van de glijbaan om de cellen niet focaal uitgezaaid in het midden van de putjes (figuur 1D) verstoren.
11. Inspecteer elk putje zodat de niet-hechtende cellen zijn succesvol gezaaid in het midden van de put blijven binnen de omtrek van het verdeelstuk kanaal. De niet-hechtende cellen zal ideaal enigszins hechten aan de monolaag of ECM en elkaar derhalve voorzichtig bewegen van de slede rond zal niet leiden tot de cel Pellet om zich te verspreiden. Niet verdringen de dia.

3. fluorescentiemicroscopie

1. Met de juiste experimentele apparatuur, voeren de beeldvorming na sedimentatie wordt bevestigd. Gebruik bij voorkeur een microscoop die is uitgerust met een _CO2 en vochtige kamer. Afbeelding bij laag vermogen, bijvoorbeeld, 4X of 10X, om voor meerdere beelden te maken van een groter oppervlak, zodat het geheel van de put te zien.
2. Verwerven van digitale beelden met behulp van image capture software. Voeren helderveld en / of multi-channel fluorescentie beeldvorming.
3. Indien gewenst, het opzetten van een time-lapse beelden in verschillende kanalen op te nemen over een bepaald gebied, of houd de dia bevochtigde en in een 37 ° C / 5% CO ₂ incubator en handmatig te nemen om het beeld op het moment dat de punten gewenste (Figuur 1E & F, aanbevolen voor een langere tijd punten).

4. Analyse en Display

1. Met behulp van software voor beeldbewerking, samenvoegen licht en fluorescerende afbeeldingen in één laag dus meerdere celtypes en merkers kan worden gezien in dezelfde afbeelding. Sleep de beeldbestanden voor elke individuele kleur in het programma en, als daarom wordt gevraagd, selecteert u de optie 'Layer Toevoegen' om een ​​image-bestand met meerdere lagen te creëren.
   1. Bij hogere vergroting, nemen, uit te lijnen, en steek samen beelden over het goed digitaal. Bestanden uitlijnen door naar geconserveerde gebieden tussen twee beelden en een beeld bovenop de andere bedekken totdat een volledig beeld wordt gegenereerd.
2. Voeg micron bars om beelden tijdens acquisitie met behulp van de capture software om afstand individuele cellen zijn gemigreerd te bepalen.
3. Om de cel migratie op verschillende tijdstippen te bepalen, maken oppervlak intensiteit fluorescentie kaarten met afbeelding software, dat wil zeggen, ImageJ, om fluorescerende T-cel aggregatie of gespreid in de tijd te kwantificeren.
   1. Aan de oppervlakte percelen te genereren, neem een ​​gelaagde afbeelding gegenereerd in stap 4.1 en onder het venster Lagen,vinkje bij alle lagen behalve degenen die bij het kanaal gewenst. Bijvoorbeeld, als een oppervlakteplot gewenst EMD expressie visualiseren, alleen de groene lagen overeenkomt met de filter die voor deze marker zichtbaar.
   2. Vlak de afbeelding en sla het op in een bestandsformaat erkend (bv .png) en laadt de afbeelding in het programma. Aan de oppervlakte perceel genereren, wijzigt het type afbeelding om 8-bit, de helderheid / contrast te wijzigen als dat nodig is om de achtergrond te verminderen, en selecteer de 'Analyze / Surface Plot' optie. De beelden in Figuur 5 werden gegenereerd door het controleren van de 'Shade', 'Draw Axis', 'One Polygon Per Line' en 'Smooth' checkboxes.
   3. Of neem metingen met de straal of diameter van de focale cel storting op tijdstip nul en vergelijken met de cellen op het buitenste punt op verschillende tijdstippen. De diameter van de Teflon putjes is 6.0 mm.

Results

Virale vectoren die coderen voor fluorescerende eiwitten kunnen worden gebruikt naast, of in plaats van fluorescente kleurstof. Virale transductie moet worden uitgevoerd vóór de motiliteit assay. Zowel hechtende en niet-hechtende celtypen kunnen verschillend gemerkt. Het protocol voor transductie zal afhangen van het type vector toegepast. Hier hebben we getransduceerd de alloCTL in figuren 3, 5 en 6 met RRV-EMD ten minste twee dagen voor de test met het protocol beschreven ^12.

Discussion

Tumorcellen in een enkele celsuspensie werd gepipetteerd in de putjes van een met teflon gemaskeerd slide. De cellen werden toegestaan ​​te hechten en vervolgens gevormd monolagen in een bevochtigde 5% _CO2, 37 ° C incubator (figuur 1A). Gevestigde monolagen of ECM eiwitten van de monolaag kunnen worden geoogst voor deze testen (Figuur 1B). Effector T lymfocyten gelabeld met fluorescerende vitale kleurstoffen of getransduceerd met vectoren die coderen voor EMD werden gezaaid i...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Teflon-masked microscope slides	Creative Scientific Methods	CSM002
Cell Sedimentation Manifold	Creative Scientific Methods	CSM001
Petri Dish, 150mm	Corning	430597
Petri Dish, 35mm	Corning	430588
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Mediatech	21-040
20 μl Pipetman	Gilson	F123600
200 μl Pipetman	Gilson	F123601
200 μl pipette tips	VWR	89003-060
Gedistilleerde, gedeïoniseerde water (steriele)	Mediatech	25-055
Trypsine	Mediatech	25-054-CL
Celltracker Red CMPTX	Invitrogen	C34552
TrypLE Express (optioneel)	Gibco	12604
Tumor celkweekmedia (bv. DMEM)	Mediatech	10-013
AIM-V serum-vrij media	Invitrogen	12055-083
Foetaal runderserum	Omega Scientific	FB-02
Inverteerde microscoop
SPOT Advanced	Diagnostic Instruments
Poly-D-Lysine	Millipore	A-003-E
Fibronectine	BD	354008
31/2 x 51/4 Autoclaafzakken	Crosstex	SCXS2
Trypan Blue	Mediatech	25-900-CI
Cell Proliferation eFluor 670	eBioscience	65-0840-85
ImageJ	NIH