Opname Light-evoked Postsynaptische Reacties in Neuronen in Dark-aangepaste, Mouse retinale Slice Voorbereidingen Gebruik Patch Clamp technieken

Samenvatting

We zullen demonstreren hoe retinale plakjes van het muizenoog worden bereid en lichtreacties in retinale neuronen worden opgenomen. De hele procedure wordt uitgevoerd in donker-aangepaste omstandigheden.

Samenvatting

Het netvlies is de toegangspoort tot het visuele systeem. Om visuele signaalverwerking mechanismen te begrijpen, onderzoeken we het netvlies neuraal netwerk functies. Retinale neuronen in het netwerk omvatten van talrijke subtypes. Meer dan 10 subtypen van bipolaire cellen ganglioncellen en amacrine cellen zijn door morfologische studies. Meerdere subtypes van retinale neuronen worden gedacht aan duidelijke kenmerken van zichtbare signalen, zoals beweging en kleur te coderen, en vormen meerdere zenuwbanen. Echter, de functionele rol van elk neuron in de visuele signaalverwerking niet volledig begrepen. De patch clamp methode is nuttig om deze fundamentele vraag te beantwoorden. Hier, een protocol aan het licht opgewekte synaptische responsen in de muis retinale neuronen met behulp van patch clamp opnamen in donker aangepaste voorwaarden op te nemen wordt verstrekt. De muis ogen zijn donker aangepaste O / N, en het netvlies slice bereidingen worden ontleed in een donkere kamer met behulp van infrarood verlichting en kijkers. Infrarood licht nietactiveren muis fotoreceptoren en behoudt daarmee hun licht responsiviteit. Patch clamp wordt gebruikt om het licht-reacties van de consument in retinale neuronen opnemen. Een fluorescerende kleurstof wordt geïnjecteerd tijdens opnames neuronale subtypes morfologische kenmerken. Deze procedure maakt het mogelijk om de fysiologische functies van elk neuron te bepalen in de muis netvlies.

Inleiding

De retina is een van de unieke delen van het zenuwstelsel. Als een toegankelijk deel van de hersenen is de synaptische architectuur ervan goed gekarakteriseerd. Bovendien kunnen de functies van dit neurale netwerk worden onderzocht met een fysiologische stimulus: licht. Als het retinale weefsel wordt geïsoleerd in een donkere kamer met geschikte procedures, zullen neuronen in het weefsel op licht reageren. Deze voorbereiding is gebruikt om visuele signaalverwerking te bestuderen en verschillende synaptische mechanismen en neurale netwerkfuncties te verduidelijken, evenals ziektemechanismen.

Lichtreacties in retinale neuronen worden al decennia lang geregistreerd. Vroege studies gebruikten scherpe elektroden om intracellulaire opnames te maken van mudpuppy retinale neuronen¹. In de jaren tachtig werd de patch clamp-techniek uitgevonden², en werd al snel een populaire methode onder onderzoekers op het gebied van visie^3,4. Enkele celopnames van lagere gewervelden, inclusief mudpuppy en visretinale neuronen, waren populaire methoden die bijdroegen tot de verduidelijking van visuele signaalverwerkingsmechanismen^5,6.

Nadat genetische mutatietechnieken waren ontwikkeld, werd de muisretina een populairder model voor onderzoekers op het gebied van visie^7-9. Het zoogdierretina is aantrekkelijker dan dat van lagere gewervelden omdat het evolutionair dichter bij de menselijke retina staat, en er is een mogelijkheid om ziektemodellen te gebruiken. Echter, muisretinale cellen zijn klein en kwetsbaar¹⁰, en het maken van retinale preparaten en het uitvoeren van patch clamp-opnames in een donkere kamer is een uitdaging. Naarmate de technologie is verbeterd, zijn er diverse benaderingen beschikbaar gekomen om visuele signaalmechanismen te bestuderen, zoals beeldvormingsstudies¹¹ en het elektroretinogram (ERG)¹². Desalniettemin is enkelcelregistratie met de patch clamp-methode nog steeds belangrijk omdat deze zeer tijdelijk en ruimtelijk gevoelig is in vergelijking met andere methoden. Daarom hebben we continu patch clamp-opnames uitgevoerd en onze methoden verbeterd om visuele signaalverwerking in muisretinale plaaspreparaten te onderzoeken^13-15.

In deze video-tutorial worden de protocollen gepresenteerd met belangrijke tips. Goede opnames kunnen alleen worden bereikt met goede voorbereiding. Het oefenen van dierdissocatie en het bouwen van een stevige patch clamp-installatie zal de meeste onderzoekers in staat stellen om succesvolle opnames te bereiken.

Protocol

Ethiek Verklaring: Procedures met dierlijke proefpersonen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan de Wayne State University.

1. Voorbereiding van de Experimentele Solution

1. Bereid de dissectie oplossing 1 dag tot 1 week voor het eigenlijke experiment. Gebruik een HEPES bufferoplossing voor retinale dissectie vanwege zijn sterke bufferende vermogen bij lagere temperaturen ^16. Meng alle chemicaliën als volgt (in mM): 115 NaCl, 2,5 KCI, 2,5 _CaCl2, 1,0 _MgCl2, 10 HEPES, 28 glucose. Stel de pH tot 7,4 met NaOH. Bewaar de oplossing in een koelkast tot 1 week.
2. De opname oplossing Ames medium, dat een kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF) ontworpen voor retinale preparaten ^17. Door de dag van het experiment, wegen uit Ames 'poeder (4,4 g voor 500 ml oplossing) in een buis. Ook afgewogen _NaHCO3 (0,95 g 500 ml oplossing) en meng met de Ames 'poeder.
3. Bereid de intracellulaire pipet oplossing patch clamp de dag van het experiment. Meng alle chemicaliën als volgt (in mM): 111 K-gluconaat, 1,0 _CaCl2, 10 HEPES, 1,1 EGTA, 10 NaCl, 1,0 _MgCl2, 5 ATP-Mg en 1,0 GTP-Na. Stel de pH tot 7,2 met KOH. Filtreer de oplossing pipet met een conventionele injectiespuit filter. Maak ~ 500 ul porties en bewaar ze in de vriezer of een diepvriezer.

2. Voorbereiding van de Dag van Experiment

1. De nacht vóór het experiment plaats een muis in een kooi (C57BL / 6J of soortgelijke achtergrond, 4 - 8 weken oud, mannelijk) in een donkere ruimte voor O / N aanpassing aan het donker.
2. Voorbereiding voor dissectie:
   1. Vul ontleden oplossing (100-200 ml) in een bekerglas, plaats het op ijs en bel met zuurstof gedurende ten minste 10 minuten.
   2. Start zuurstofvoorziening van het donkere vakje voor retinale voorbereiding opslag.
   3. Bereid plastic dekglaasjes met vet rails voor hergebruiktinal slice voorbereidingen en leg elk van hen in een 35 mm plastic schaaltje.
   4. Bevestig een nieuw scheermesje om een ​​chopper (weefsel snijmachine).
   5. Snijd een filter membraan in twee helften. Dit is netvlies snijden.
   6. Lijn de ontleden gereedschappen en overdracht pipetten in de buurt van de dissectiemicroscoop. Het werkgebied moet goed worden georganiseerd, zodat elk gereedschap gemakkelijk kunnen worden geopend in het donker.
3. Voorbereiding voor patch clamp opnamen:
   1. Ontbinden Ames 'poeder en _NaHCO3 in gedestilleerd water (Ames 4,4 g en _NaHCO3 0,95 g / 500 ml DDH ₂ O). Bubble de Ames-medium met gemengde zuurstof (95% _O2 en 5% _CO2) gedurende ten minste 30 minuten onder verwarmen tot een opname temperatuurniveau (~ 35 ° C). Breng de pH op 7,4 met _NaHCO3 terwijl nog borrelen.
   2. Ontdooi de interne pipet oplossing tijdens de dissectie. Nadat het ontdooid, voeg 0,01% sulforhodamine B intracellulaire kleuring.

3. Retina Dissection

1. In een donkere kamer, euthanaseren de muis met behulp van kooldioxide en bilaterale pneumothorax. Na 2 - 3 min met kooldioxide, zal de muis bewustzijn verliezen.
2. Wanneer de muis niet meer reageert op een staartknijptest snel ophelderen ogen en plaats ze in een koude dissectie oplossing in een plastic schaaltje. Voer de bilaterale pneumothorax dood van het dier te garanderen. Snel op te slaan in het oog in de schotel in het donker doos. Gebruik een infrarood kijker om de procedure uit te voeren in het donker.
   OPMERKING: U isofluraan, onthoofding of cervicale dislocatie kan voor euthanasie. De methode van euthanasie dient de richtlijnen van het National Institute of Health (NIH) en / of de Institutional Animal Care en gebruik Comite volgen.
3. In een donkere kamer, stel de dissectiemicroscoop en infrarood verlichting. Onder de microscoop overbrengen gaten van de schaal in een 10 cm plastic schaaltje wet de afgekoelde oplossing ontleden. Continu bubble zuurstof door buis op de bodem van de plastic schaaltje. Stel het debiet zodat het niet te laag, maar zorgen dat het niet hoog genoeg om de dissectie verstoren.
4. Hoornvlies en de lens te verwijderen:
   1. Een insnijding op de top van het hoornvlies met een micro-chirurgisch mes. Houd de oogzenuw aan het andere uiteinde van de oogbol verhindert het oog beweegt. Verleng de cut met behulp van een paar van chirurgische schaar. Knip de cornea met enkele sclera omheen.
   2. Pak de lens met een fijn pincet en trek de lens uit. Als het glasvocht te kleverig lens te verwijderen, snijd het glaslichaam met een schaar.
   3. Zodra de eye-beker is gemaakt, voorzichtig giet koude, zuurstofrijke ontleden oplossing in de oogschelp met een kleine transferpipet.
      OPMERKING: De oogbol leeglopen snel na een incisie in het hoornvlies. Het is belangrijk om de vorm van het oog handhaven vervormen het oog tijdens deze proprocedure zal het netvlies beschadigen en netvliesloslating.
5. Het identificeren van de dorsale en ventrale zijden van het netvlies:
   Opmerking: Door ongelijke verdeling van de groene en ultraviolet (UV) kegels ¹⁸ identificeren van een specifiek netvliesgebied belangrijk voor lichte reactie opnames.
   1. Identificeer de lijn die dwars over het netvlies oog beker passeren in de buurt van de oogzenuw. Deze lijn loopt grotendeels over de ventrale zijde van de oogzenuw; de zijkant inclusief de oogzenuw is de dorsale zijde, terwijl de andere ventrale ^19. Zie deze mijlpaal duidelijk onder infrarood kijkers.
   2. Afhankelijk van het doel van het experiment maakt een snede aan onnodige zijde. Dit zal nuttig na het isoleren van de retina van het oog beker.
6. Glasvocht te verwijderen:
   1. Eventueel incubeer de oogschelp met hyaluronidase (0,5 mg / ml) gedurende 15 min.
   2. Verwijder het glasvocht met extra-fijne pincet. Het glasachtige voornamelijknaar de bodem en de buitenrand van de oogschelp bevestigd. Verwijder het voorzichtig, zonder te raken of te porren het netvlies. Als het glasvocht stevig kan worden bevestigd aan de oogschelp voorzichtig verwijderen retinale onthechting van de oogschelp vermijden. Blijven trekken tot er geen spanning wordt gevoeld.
      Opmerking: Deze stap is bijzonder belangrijk voor het ontleden van de muis netvlies; het is echter geen probleem voor de netvliezen van andere soorten, zoals de rat of salamander.
7. Isoleer het netvlies van het oog-cup. Pak de sclera en voorzichtig trek het netvlies met de achterkant van een tang.
   OPMERKING: Whole-mount netvlies preparaten kunnen worden van de geïsoleerde netvlies. Maak 03:57 bezuinigingen aan de randen en plat het netvlies, of snijd het netvlies in verschillende stukken.
8. Trim het netvlies en de onnodige helft van het netvlies weggooien (stap 3.5). In dezelfde plastic schaaltje, snijd de resterende netvlies in twee stukken. Voor elk stuk van het netvlies, afgesneden van de randen om een ​​te makennetvlies plakken, en trim de vouwen randen.
9. Breng een retinale plaat op een glasplaat met een grote transferpipet (~ 2 ml). Zuig de overmaat oplossing met een kleine pipet, gebruik een stuk filtreerpapier de plaat plat, en wordt snel een stuk van het filtermembraan bovenop het weefsel.
   1. Met behulp van een kleine transferpipet, plaats een druppel ontleden oplossing op het filter membraan. Wacht ~ 15 seconden totdat de oplossing verspreidt zich over het membraan. Gedurende deze tijd zal het retinale weefsel vasthouden aan het filtermembraan.
   2. Pour meer koude ontleden oplossing onder en rondom het filter. De retinale weefsel met het filtermembraan drijven. Pak het filter membraan met een pincet en plaats deze in de slicing kamer. Giet ontleden oplossing over het weefsel, en bewaar de voorbereiding in de donkere doos.
      OPMERKING: De hier beschreven procedure is van cruciaal belang. Het is belangrijk deze stappen snel uit te voeren opdat het retinale weefsel kleeft aan de filter membraan en droogt niet uit.
10. Met behulp van een helikopter, snijd de netvliesweefsel in plakjes. Rond 200 micrometer dik haalbaar is voor patch clamp studies.
11. Plaats een plastic dekglaasje met vet rails in de slicing kamer. Breng een netvlies slice op de top van het vet rails op een plastic dekglaasje. Draai het segment van 90 ° zodat de dwarsdoorsnede zichtbaar. Druk het filtermembraan beneden op het dekglaasje dan betrekking op de zijkanten van het filtreerpapier met vet.
    1. Nadat het segment wordt geïmmobiliseerd op een plastic dekglaasje, pak het dekglaasje en overbrengen naar een 35 mm plastic schaaltje. Giet koud ontleden oplossing op het netvlies voorbereiding en dompel de voorbereiding. Bewaar elk gerecht in het donker doos, die continu moet worden zuurstofrijk.
       OPMERKING: De gehele procedure moet zorgvuldig gebeuren zodat het filtermembraan niet vervormd. Anders, de retinale plak gemakkelijk scheidt van het filtermembraan.

4. Patch Clamp Opnames van het netvlies Slice Voorbereiding

1. Het opnemen van het preparaat:
   1. Prime de perfusie buizen met Ames 'medium. Laat alle bellen door te laten bij het vullen van de slang.
   2. Maak patch clamp opname pipetten met een trekker. Om een ​​pipet met de pipet oplossing, duik in de achterkant van een pipet te vullen voor 1 min tot het pipet wordt opgevuld. Vervolgens vult ~ 1/3 van de pipet met een micro-pipetvuller. Bewaar elke pipet in een vochtige pipet doos.
   3. Draai aan de apparatuur voor patch clamp opnamen; waaronder de computer, versterker, CCD camera en microscoop.
2. Schakel het licht in de kamer. Plaats een netvlies slice voorbereiding op de microscoop fasekamer behulp van een infrarood kijker. Nadat het is geïmmobiliseerd, beginnen continue perfusie. Stel de perfusie temperatuur op 33-37 ° C.
3. Bekijk de slice oppervlak met de CCD-camera. Focus op de doellocatie waar de doelgroep cell soorten verblijven. Selecteer een gezond uitziende cel voor patch clamp opname (dat wil zeggen, moet het glad uitziende oppervlak en een goede mobiele vorm hebben).
4. Plaats een opname pipet in een pipet houder. Vooraf de pipet om de slice voorbereiding. Wanneer het dichtbij de slice preparaat (~ 2 mm boven), vindt de punt van de pipet met de microscoop. Zodra de pipet tip is zichtbaar onder de microscoop, beweeg de punt naar beneden in de richting van de doelcel.
5. Stel de versterker. Pas de pipet op 0 mV / 0 Pa (nul stellen) en start een continue elektrische puls van ~ 5 mV bij ~ 10 Hz. Controleer de pipet weerstand; ideaal weerstand tussen 5 en 10 MQ meeste retinale neuronen.
6. Begin uitblazen van de tip. Gebruik een mondstuk, of gebruik een spuit, om positieve druk uit te oefenen wanneer de pipet dips in het bad oplossing. Continu blaas de interne oplossing totdat de punt op het oppervlak van de doelcel.
   1. Wanneer de positieve druk maakt een klein kuiltje op the celoppervlak, vooraf de tip lichtjes en stop uitblazen. Controleer de pipet weerstand, die moet toenemen. Alsof deze gestaag toe, laat het en controleren de weerstand totdat het> 1 GQ (gigaseal) bereikt. Als de weerstand niet spontaan te verhogen, zachtjes toe te passen negatieve druk tot het een gigaseal.
7. Na de gigaseal wordt bereikt, verandert de holding potentieel om -70 mV. Vervolgens intermitterend toepassen negatieve druk op het membraan in de pipetpunt scheuren. Wanneer de whole-cell configuratie is gemaakt, kan de pipet weerstand tussen 500 MQ en 1 GQ, en de capacitieve stroom wordt gezien. Soms spontane postsynaptische stromingen waar te nemen.
8. Noteer de IV relatie van -80 tot +40 mV. Verschillende types van spanningsafhankelijke kanalen worden geactiveerd afhankelijk van het celtype.
9. Record licht opgewekte synaptische stromen of spanningen.

Resultaten

Een representatieve slice preparaat wordt getoond in figuur 1. De slice preparaat in een rechte stand, met fotoreceptoren te ganglion cellen in een plat vlak en geen onthechting van het filterpapier. Wanneer een segment wordt gekanteld, slechts een deel van het preparaat in focus, waardoor het moeilijk een geschikte cel identificeren patchklemmen. Voor opnamen is het belangrijk om een ​​goede soma, die meestal een glanzend oppervlak, een gelijkmatige ronde vorm, en geen zichtbare donkere plaques te sele...

Discussie

Goede opnames kunnen alleen worden bereikt met goede retinale preparaten en goed ontworpen patch clamp-opstellingen. Hoewel alle hierboven beschreven stappen belangrijk zijn, benadrukt de discussie enkele cruciale stappen zowel voor de dissectie als de opnames.

Voor de dissectie zijn twee dingen bijzonder belangrijk: koeling en oxygenatie. Nadat het oog is geënucleeerd, verwijdert u snel het voorste deel van het oog in een dissectiekamer met zuurstofgebeurbelde, gekoelde dissectieoplossing, en...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Muizen (28-60 dagen oud, mannelijk)	Jackson laboratory	C57BL/6J-stam
Ames' medium poeder	Sigma	A1420	uitstekend
Stereomicroscoop	Nikon	SMZ745	uitstekend
Dissectie-instrument: pincet	Dumont	#4, #5, #55	uitstekend
Dissectie-instrument: schaar	Roboz	RS-5605	uitstekend
Dissectie-instrument: operatiemes	Surgistar	7514	uitstekend
Scheermesje (voor chopper)	EMS	71970	uitstekend
Chopper	handgemaakt
Infrarood viewer	Night Owl Optics	NOBG1	Het toont een helder beeld. Het scherpstellen van kleine objecten is een probleem.
Puller	Sutter	P-1000	uitstekend; maakt consistente grootte pipetten.
Donkere doos	Pelican	donkere doos	uitstekend
Patch clamp systeem	Scientifica	slice scope 2000	Uitstekende setup. De meeste belangrijke componenten zijn inbegrepen in één pakket. Micromanipulatoren zijn uitstekend.
Versterker	Molecular Devices	multiclamp 700B	Uitstekend en eenvoudig te bedienen.
Software voor acquisitie	Molecular Devices	pClamp software	Uitstekend en eenvoudig te bedienen.
Lichtbron (LED)	Cool LED	pE-2 4-kanaals systeem	Uitstekend
CCD camera	Q-imaging	Retiga 2000	Uitstekend
Faraday kooi	handgemaakt