Methodenartikel

-Groei op basis Vaststelling en Biochemische Bevestiging van Genetische Eisen voor de afbraak van eiwitten in Saccharomyces cerevisiae

DOI:

10.3791/52428

⸱

16 februari 2015

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Ball State University, 2Division of Nephrology, Cincinnati Children's Hospital

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel beschrijft een op groei gebaseerde gisttest voor de bepaling van genetische vereisten voor eiwitafbraak. Het demonstreert ook een methode voor snelle extractie van gisteiwitten, geschikt voor western blotting om biochemisch de afbraakvereisten te bevestigen. Deze technieken kunnen worden aangepast om de afbraak van een verscheidenheid aan eiwitten te monitoren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gereguleerde eiwitafbraak is cruciaal voor vrijwel elke cellulaire functie. Veel van wat bekend is over de moleculaire mechanismen en genetische eisen voor eukaryotische eiwitafbraak werd aanvankelijk opgericht in Saccharomyces cerevisiae. Klassieke analyses van eiwitafbraak hebben vertrouwd op biochemische pulse-chase en cycloheximide-chase methodieken. Hoewel deze technieken gevoelige middelen voor het observeren van afbraak van eiwitten, ze zijn omslachtig, tijdrovend, en een laag-throughput. Deze benaderingen zijn niet vatbaar voor snelle en grootschalige screening van mutaties die eiwitafbraak voorkomen. Hier wordt een gistgroei gebaseerde bepaling voor gemakkelijke identificatie van genetische eisen eiwitafbraak beschreven. In deze bepaling wordt een reporterenzym vereist groei onder bepaalde selectieve omstandigheden gefuseerd aan een instabiele eiwit. Cellen ontbreekt het endogene reporter enzym, maar de uiting van de fusie-eiwit kan groeien onder selective omstandigheden wanneer het fusie-eiwit wordt gestabiliseerd (bijvoorbeeld bij eiwitafbraak gecompromitteerd). In de groei assay beschreven, worden seriële verdunningen van wildtype en mutante gist cellen die een plasmide dat codeert voor een fusie-eiwit gespot op selectieve en niet-selectieve medium. Groei onder selectieve omstandigheden, verenigbaar is met de afbraak bijzondere waardevermindering door een bepaalde mutatie. Verhoogde eiwit overvloed moet biochemisch worden bevestigd. Een werkwijze voor snelle extractie van gisteiwitten in een vorm geschikt voor elektroforese en Western blotting is eveneens aangetoond. Een groei gebaseerde uitlezing voor eiwitstabiliteit, gecombineerd met een eenvoudig protocol voor eiwitextractie voor biochemische analyse, maakt snelle identificatie van genetische eisen eiwitafbraak. Deze technieken kunnen worden aangepast om afbraak van verschillende kortstondige eiwitten volgen. In de gepresenteerde voorbeeld, het HIS3 enzym dat nodig is voor histidine biosynthese werd gefuseerdnaar ° 1 -Sec62. ° 1 -Sec62 is bedoeld voor degradatie na het afwijkend grijpt het endoplasmatisch reticulum translocon. Cellen die ° 1 -Sec62-his3 konden groeien onder selectieve omstandigheden wanneer het eiwit werd gestabiliseerd.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Selectieve eiwitafbraak essentieel voor eukaryotische leven en veranderde eiwitafbraak bij tot een aantal medische aandoeningen, waaronder verschillende vormen van kanker, neurodegeneratieve ziekte, cardiovasculaire ziekte, en cystische fibrose 1-5. De ubiquitine-proteasoom-systeem (UPS) die selectieve afbraak van eiwitten katalyseert, is een opkomende therapeutisch doelwit voor deze omstandigheden 6-10. Ubiquitine ligasen covalent polymeren van de 76-aminozuur ubiquitine eiwitten 11. Eiwitten die zijn gemarkeerd met polyubiquitine ketens worden erkend en geproteolyseerd door de ~ 2,5 megadalton 26S-proteasoom 12. Studies gestart in het model eukaryoot organisme Saccharomyces cerevisiae (gist) zijn fundamenteel in de ontrafeling van de mechanismen afbraak van eiwitten in eukaryote cellen geweest. De eerste toonde fysiologische substraat van de UPS is de gist transcriptionele repressor MATα2 1314, en vele sterk geconserveerde delen van de UPS werden eerst geïdentificeerd of gekenmerkt in gist (bijvoorbeeld 15-26). Ontdekkingen gedaan in deze veelzijdige en genetisch handelbaar modelorganisme zijn waarschijnlijk blijven belangrijke inzichten verschaffen in geconserveerde mechanismen van ubiquitine gemedieerde afbraak.

Erkenning en degradatie van de meeste UPS ondergronden vereisen een gecoördineerde actie van meerdere eiwitten. Daarom is een belangrijk doel bij het karakteriseren van de geregelde afbraak van een bepaalde instabiele eiwit de genetische vereisten voor proteolyse bepalen. Klassieke benaderingen (bijv pulse-chase en cycloheximide-chase experimenten 27) voor het controleren eiwitafbraak bij zoogdier- of gistcellen zijn omslachtig en tijdrovend. Hoewel deze soorten methodologie gevoelige middelen voor het detecteren van eiwitafbraak, ze zijn niet geschikt voor snelle analyse van eiwitafbraak of grootschalige screening voor mutaties die eiwitafbraak voorkomen. Hier wordt een gistgroei-gebaseerde assay voor de snelle identificatie van genetische eisen voor de afbraak van instabiele eiwitten gepresenteerd.

In de gistgroei-methode voor het analyseren van eiwitafbraak, een instabiel eiwit van belang (of afbraak signaal) gefuseerd in frame, een eiwit dat nodig is voor groei van gist onder bepaalde omstandigheden. Het resultaat is een kunstmatig substraat dat als een krachtig instrument voor de genetische eisen van eiwitafbraak van het instabiele eiwit van belang te bepalen kan dienen. Gunstig, meest gebruikte laboratorium giststammen bevatten een paneel van mutaties in genen die coderen voor metabole enzymen betrokken bij de biosynthese van bepaalde aminozuren of stikstofhoudende basen (bv 20,28-30). Deze enzymen zijn essentieel voor cellulaire proliferatie in afwezigheid van exogeen geleverd metabolieten in de synthese waarvan de enzymen deelnemen. Zodanigmetabolische enzymen kunnen derhalve fungeren als groei gebaseerde reporters voor de afbraak van onstabiele eiwitten waaraan zij gefuseerd. De genetische eisen voor eiwitafbraak kunnen gemakkelijk worden toegelicht, aangezien mutaties die proteolyse voorkomen zal cellen die de afbraak reporter groeien onder selectieve omstandigheden.

Een groei voordeel is een indirecte indicatie dat een bepaalde mutatie verhoogt de overvloed van het eiwit van interesse. Echter, wordt direct biochemische analyse vereist om te bevestigen dat een mutatie maakt groei door verhoogde eiwitgehaltes in plaats van via indirecte of artefactuele oorzaken. Het effect van een mutatie op proteïne overvloed kan worden bevestigd door western blot analyse van steady-state eiwit niveaus in cellen die wel en niet haven de specifieke mutatie. Een werkwijze voor snelle en efficiënte extractie van gisteiwitten (sequentiële incubatie van gistcellen met natriumhydroxide en monsterbuffer) in een vorm geschiktvoor analyse door western blotting wordt ook gepresenteerd 31. Samen vormen deze experimenten te vergemakkelijken de snelle identificatie van kandidaat-regulatoren van eiwitafbraak.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Gist Groei Assay om Kandidaat Mutants Defecte in eiwitafbraak Identificeer

  1. Transformeer wild-type en mutant gistcellen met een plasmide dat codeert voor een instabiel eiwit gefuseerd in frame aan een reporter metabole enzym.
  2. Inoculeer transformanten in 5 ml synthetische gedefinieerd (SD) minimaal medium dat selectief is voor cellen die plasmide moleculen. Incubeer overnacht bij 30 ° C, roteren.
  3. Meet de optische dichtheid bij 600 nm (OD600) van elke overnacht kweek.
    OPMERKING: Na overnacht incubatie, kunnen cellen in kweek in logaritmisch of stationaire groeifase maar moeten tot een minimum OD600 van 0,2. Zeer traag groeiende giststammen kunnen incubatietijden vereisen meer dan een nacht of inoculatie van een groter aantal cellen, zoals empirisch.
  4. Neem zes-voudige seriële verdunningen van de getransformeerde gistcellen in een steriele 96-well plaat, beginnend met cellen verdund tot eenn OD600 van 0,2. Plaats elke gist transformant wordt geanalyseerd in een andere rij in de 96-well plaat.
    1. Voor elke transformant Bereken het volume overnachtkweek nodig om cellen te verdunnen tot een OD600 van 0,2 in een eindvolume van 200 ul. Voeg dit volume van overnachtcultuur de overeenkomstige put in kolom 1. Voeg de juiste hoeveelheid steriel water om het volume op 200 ui te brengen.
    2. Voor elke rij van gist, voeg 125 ul steriel water aan de putjes in kolommen 2, 3 en 4.
      OPMERKING: Individueel verpakte steriele 96-putjesplaten worden verpakt met steriele deksels. Het deksel kan worden gebruikt als reservoirs voor het steriele water wordt via deze stap. Dit maakt gelijktijdige overdracht steriel water aan alle putjes in een bepaalde kolom een ​​multichannel pipet.
    3. Meng de inhoud van de eerste kolom (gist verdund tot een OD600 van 0,2) door op en neer pipetteren met een multichannel pipet.
    4. Transfer 25 pl gist van kolom 1 tot kolom 2, met een multichannel pipet. Meng door en neer te pipetteren. Breng 25 ul van kolom 2 naar kolom 3 en 25 ul van kolom 3 kolom 4 (goed mengen bij elke stap).
  5. Meng elk monster met een multichannel pipet. Vanuit meeste verdund tot minst kolommen gist, pipet 4 pl van elk monster verdund op twee platen met het geschikte selectieve medium. Gebruik een plaat met medium dat plasmide selectie (deze plaat dient als een gist spotten en groei controle) onderhoudt. Gebruik een tweede plaat met medium dat selecteert voor plasmide onderhoud en expressie van het instabiele eiwit gefuseerd aan het reporterenzym. Omdat gist vestigen zich snel, meng cellen door en neer te pipetteren op regelmatige tijdstippen.
    OPMERKING: Droger platen zullen gemakkelijker absorberen vloeistof dan vers bereide schotels en worden daarom aanbevolen voor deze experimenten. Damp plaatjes worden gedroogd door incubatie bij kamertemperatuur in low vochtigheid gedurende 1-2 dagen of korter incubaties in een laminaire stroming kap. Platen kunnen ongelijkmatig drogen wanneer de laminaire luchtstroom parallel aan de bank. Toepassing van een sjabloon vergemakkelijkt gistcellen plek op regelmatige afstanden. Twee voorbeeldsjablonen worden verschaft in Figuur 1. Deze kunnen worden afgedrukt, uitgesneden en aangebracht op de binnenkant van een petrischaal deksel.
  6. Laat platen te drogen op de bank top.
  7. Incubeer de platen bij 30 ° C gedurende 2-6 dagen.
  8. Fotografeer elke plaat na incubatie.

figure-protocol-1
Figuur 1. Templates voor het spotten gistcellen op 100 mm agarplaten. Deze sjablonen kunnen worden gebruikt voor het vergemakkelijken spotten gist op regelmatige afstanden een multichannel pipet. Sjablonen worden afgedrukt, uitgesneden en aangebracht op de binnenkant van een petrischaal deksel. Plaats petrischaal met groeimedium binnenkant deksel met sjabloon aangebracht. Sjablonen worden gemarkeerd met een inkeping oriëntatie volgen. Aanbevolen wordt platen in groei assays eveneens worden voorzien van een inkeping oriëntatie volgen. Sjablonen voor het spotten van vier (A) of vijf (B) seriële verdunningen van gistcellen zijn aanwezig. Klik hier om een printbare versie van deze figuur met 100-mm templates te bekijken.

2. Biochemische Bevestiging van Gist Groei Assay

  1. De groei van gistcellen en na Alkaline Eiwitextractie (gewijzigd van 31)
    1. Transformeer wild-type en mutant gistcellen met een plasmide dat codeert voor het eiwit instabiel.
    2. Inoculeer transformanten in 5 ml SD medium dat selectief is voor cellen die plasmide moleculen. Incubeer overnacht bij 30 ° C, roteren.
    3. Meet de OD 600 van elke overnachting culture.
      OPMERKING: Na incubatie overnacht, kunnen cellen worden in ofwel logaritmische of stationaire groeifase, maar moet een OD 600 dat verwatering zal toelaten om een OD 600 van 0,2 in 10 ml vers selectief medium (stap 2.1.4) hebben bereikt. Zeer traag groeiende giststammen kunnen incubatietijden vereisen meer dan een nacht of inoculatie van een groter aantal cellen, zoals empirisch.
    4. Verdun gistcellen tot een OD600 van 0,2 in 10 ml vers selectief medium.
    5. Blijf cellen geïncubeerd bij 30 ° C, het roteren of schudden totdat kweken bereiken een OD600 van 0,8 en 1,2 (oftewel in mid-logaritmische groei).
      Opmerking: Als het instabiele eiwit van belang onder controle van een reguleerbare promotor, kan de optimale tijdstip van inductie van eiwitexpressie en celoogst afhankelijk eerdere studies of empirische observaties.
    6. Verzamel 2,5 OD 600 eenheden van cultuur in een 15-ml conischeal buis door centrifugeren bij 5000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder supernatant door pipetteren of aspiratie.
      OPMERKING: Een OD600 eenheid wordt gedefinieerd als de hoeveelheid gist aanwezig in 1 ml kweek bij OD600 van 1,0. Het volume van de kweek (in ml) nodig om oogsten 2,5 OD 600 eenheden (V) kan worden bepaald met de volgende vergelijking: V = 2,5 OD 600 eenheden / Gemeten OD600
    7. Resuspendeer cellen in 1 ml gedestilleerd water. Overdracht gesuspendeerde cellen een microcentrifugebuis.
    8. Pellet cellen door centrifugeren bij 6500 xg gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur. Verwijder supernatant door pipetteren of aspiratie.
    9. Resuspendeer cellen in 100 pl gedestilleerd water door en neer te pipetteren of vortexen, en voeg 100 ul 0,2 M NaOH. Meng door en neer te pipetteren. Incubeer de monsters gedurende 5 min bij kamertemperatuur.
    10. Pellet cellen (waarvan de meeste zijn nog niet vrijgegeven eiwitten en zijn nog steeds levensvatbaar) door centrifugeren bij 18.000 xg gedurende 5 min. Verwijder supernatant door pipetteren of aspiratie.
    11. Resuspendeer pellet in 50 - 100 gl 1 x Laemmli-monsterbuffer, die lyseren cellen, door op en neer pipetteren of vortexen.
      OPMERKING: Verwijdering van de alkalische supernatant na centrifugeren en vervolgens opnieuw suspenderen van cellen in Laemmli monsterbuffer onttrekt eiwitten bij een pH compatibel met natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) met een Tris-glycine-loopbuffer systeem en western blotting.
    12. Om volledig denatureren eiwitten, incubeer lysaten bij 95 ° C gedurende 5 min.
      OPMERKING: Aggregation-gevoelig eiwitten (bijvoorbeeld eiwitten met meerdere transmembraansegmenten) kan onoplosbaar worden wanneer geïncubeerd bij 95 ° C. Daarom moet lysaten worden geïncubeerd bij lagere temperaturen (bijvoorbeeld 37 ° C - 70 ° C) gedurende 10 - 30 minuten, zoals empirisch bepaald voor de analyse van dergelijke eiwitten.
    13. Cool lysaten door het op ijs gedurende 5 minuten.
    14. Centrifugeer lysaten bij 18.000 xg gedurende 1 min bij kamertemperatuur onoplosbaar materiaal te pelletiseren. Scheid de supernatant (oplosbaar geëxtraheerd eiwit) door SDS-PAGE vóór verder western blot analyse (paragraaf 2.2). Alternatief opslag lysaten bij -20 ° C.
  2. Representatieve Western Blotting Protocol
    1. Laad empirisch bepaalde hoeveelheid lysaten in een SDS-PAGE gel.
    2. Run gel bij 200 V tot kleurstoffront heeft de onderkant van de gel bereikte.
    3. Transfer eiwitten van gel tot polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan door natte overdracht bij 20 V gedurende 60-90 min bij 4 ° C.
    4. Blok membraan door incuberen in 5% magere melk in Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS), schommelen, gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C.
    5. Decanteren blokkeren oplossing.
    6. Incubeer membraan met primair antilichaam specifiek voor eiwit van belang (of epitoop tag daarvan) in 1% afgeroomde melk in TBS met 0,1% Tween-20 (TBS / T) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur temperature, schommelen.
    7. Decanteer antilichaamoplossing en wassen membraan 3 x 5 min met TBS / T bij kamertemperatuur schommelen.
    8. Incubeer het membraan met geschikte fluorofoor geconjugeerd secundair antilichaam in 1% afgeroomde melk in TBS / T gedurende 1 uur bij kamertemperatuur schommelen.
      OPMERKING: Omdat fluoroforen zijn lichtgevoelig, moet verdunningen van fluorofoor-geconjugeerde antilichamen worden voorbereid in het donker. Bovendien moet incubatie van membranen in aanwezigheid van fluorofoor-geconjugeerde antilichamen voorkomen in lichtdichte verpakking. Dit kan worden bewerkstelligd door het wikkelen incubatie trays aluminiumfolie.
    9. Decanteer antilichaamoplossing en wassen membraan 3 x 5 min met TBS / T bij kamertemperatuur schommelen.
    10. Verwerven beeld van membraan met behulp van Li-Cor Odyssey CLX en Image Studio-software (of vergelijkbare imaging apparatuur en software), volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
    11. Na beeldvorming membraan, incubeer de membraan met een primair antilichaam specifiek voor een lasting controle-eiwit in 1% afgeroomde melk in TBS / T gedurende 1 uur bij kamertemperatuur schommelen.
    12. Decanteer antilichaamoplossing en wassen membraan 3 x 5 min met TBS / T bij kamertemperatuur schommelen.
    13. Incubeer het membraan met geschikte fluorofoor geconjugeerd secundair antilichaam in 1% afgeroomde melk in TBS / T gedurende 1 uur bij kamertemperatuur schommelen.
    14. Decanteer antilichaamoplossing en wassen membraan 3 x 5 min met TBS / T bij kamertemperatuur schommelen.
    15. Verwerven beeld van membraan met behulp van Li-Cor Odyssey CLX en Image Studio-software (of vergelijkbare imaging apparatuur en software), volgens de aanbevelingen van de fabrikant.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om deze methode te illustreren, is het HIS3 enzym werd gefuseerd aan het carboxy-uiteinde van het model endoplasmatisch reticulum (ER) geassocieerde afbraak (ERAD) substraat ° 1 -Sec62 (Figuur 2A) om ° 1 -Sec62-HIS3 is (Figuur 3) . ° 1 -Sec62 vertegenwoordigt een van de oprichters van een nieuwe klasse van ERAD substraten die zijn gericht volgende persistent, afwijkende associatie met de translocatie, het kanaal primair verantwoordelijk voor het verplaatsen va...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De hier gepresenteerde methode laat een snelle bepaling en biochemische bevestiging van genetische eisen eiwitafbraak in gistcellen. Deze experimenten benadrukken het nut en de kracht van gist als model eukaryoot organisme (meerdere uitstekende recensies van gist biologie en compilaties van protocollen voor de behandeling, de opslag en het manipuleren van gistcellen (bijvoorbeeld 41-44) zijn beschikbaar voor nieuwe onderzoekers het organisme). De technieken kunnen gemakkelijk worden toegepast voor de...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken de huidige en voormalige leden van de Rubenstein lab voor het verstrekken van een ondersteunende en enthousiaste onderzoeksomgeving. Wij danken Ryan T. Gibson voor hulp bij het protocol optimalisatie. Wij danken Mark Hochstrasser (Yale University) en Dieter Wolf (Universität Stuttgart) voor giststammen en plasmiden. Wij danken onze anonieme reviewers voor hun hulp bij het verbeteren van de duidelijkheid en het nut van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door een onderzoek award van het hoofdstuk Ball State University van Sigma Xi naar SGW, een National Institutes of Health subsidie ​​(R15 GM111713) aan EMR, een Ball State University ASPiRE onderzoek award voor EMR, en fondsen van de Ball State University Provost's Office en het Departement Biologie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Gewensen schimmelstammen, plasmiden, standaard medium en buffercomponentenSchimmelstammen met gewenste mutaties kunnen worden gegenereerd in het laboratorium van de onderzoeker. Wild-type schimmel en een verscheidenheid aan mutanten zijn ook commercieel verkrijgbaar (bijv. van GE Healthcare). Plasmiden die fusie-eiwitten coderen kunnen worden gegenereerd in het laboratorium van de onderzoeker.
3-amino-1H-1,2,4-triazoolFisher ScientificAC264571000Competitive inhibitor van His3 enzym. Kan worden opgenomen in medium om de strengheid van groeionderzoek met His3 reporter constructen te verhogen.
Endoglycosidase H (recombinante vorm van Streptomyces plicatus)Roche11088726001Kan worden gebruikt om N-glycosylering van eiwitten te beoordelen; compatibel met SDS en beta-mercaptoethanol concentraties gevonden in 1x Laemmli monster buffer.
Weggeef borosilicaat glazen buizenFisher Scientific14-961-32Beschikbaar van een verscheidenheid aan fabrikanten
Temperatuurgeregelde incubator (bijv. Heratherm Incubator Model IMH180)Dot Scientific51028068Beschikbaar van een verscheidenheid aan fabrikanten
New Brunswick Interchangeable Drum voor 18 mm buizen (buis roller)New BrunswickM1053-0450Buis roller wordt aanbevolen om overnachting starter culturen van schimmelcellen in suspensie te houden. Een platform shaker of buis roller kan worden gebruikt om grotere culturen in suspensie te houden.
New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 HNew BrunswickM1053-4004Voor gebruik met buis roller
SmartSpec Plus SpectrofotometerBio-Rad170-2525Beschikbaar van een verscheidenheid aan fabrikanten
Steriele 96-well platte bodem microtest platen met individueel verpakt dekselSarstedt82.1581.001Beschikbaar van een verscheidenheid aan fabrikanten
Pipetman Neo P8x20N, 2-20 μlGilsonF14401Beschikbaar van een verscheidenheid aan fabrikanten
 
 
 

 
[header]
Pipetman Neo P8x200N, 20-200 μlGilsonF14403Single-channel en multi-channel pipettors worden gebruikt in verschillende stadia van het protocol. Terwijl multi-channel pipettors de pipettasklast op verschillende stappen verminderen, kunnen single-channel pipettors door het hele protocol heen worden gebruikt. Beschikbaar van een verscheidenheid aan fabrikanten.
Centrifuge 5430Eppendorf5427 000.216Rotor die met eenheid wordt verkocht houdt 1,5 en 2,0 ml microcentrifuge buizen. Rotor kan worden verwisseld voor een die 15 ml en 50 ml kegelbuizen houdt.
Plate beeldvorming systeem (bijv. Gel Doc XR+ Systeem)Bio-Rad170-8195Een verscheidenheid aan systemen kan worden gebruikt om platen te beeldvormen, inclusief geavanceerde beeldvormingssystemen, computerscanners en camera telefoons.
Vaste-hoek Rotor F-35-6-30 met deksel en adapters voor Centrifuge Model 5430/R, 15/50 ml kegelbuizen, 6-plaatsEppendorfF-35-6-30
15 ml screen geprinte schroefdopbuis 17 x 20 mm kegel, polypropyleenSarstedt62.554.205Beschikbaar van een verscheidenheid aan fabrikanten
1,5 ml flex-buis, PCR schoon, Natuurlijke microcentrifugebuizenEppendorf22364120Beschikbaar van een verscheidenheid aan fabrikanten
Analoge Dri-Bath HeaterFisher Scientific1172011AQKookwater bad met hot plate kan ook worden gebruikt om eiwitten te denatureren
SDS-PAGE loop- en overdrachtapparaten, voedingen en beeldvormingsapparatuur of donkere kamers voor SDS-PAGE en overdracht naar membraanZal variëren per lab en toepassing
Western blot beeldvorming systeem (bijv. Li-Cor Odyssey CLx scanner en Image Studio Software)Li-Cor9140-01Zal variëren per lab en toepassing
EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer MembranesFisher ScientificIPFL00010Zal variëren per lab en toepassing
Primaire antilichamen (bijv. Fosfoglyceraat Kinase (Pgk1) Monoklonaal antilichaam, muis (clone 22C5D8))Life Technologies459250Zal variëren per lab en toepassing
Secundaire antilichamen (bijv. Alexa-Fluor 680 Konijn Anti-Muis IgG (H+L))Life TechnologiesA-21065Zal variëren per lab en toepassing

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426, 895-899 (2003).
  2. Guerriero, C. J., Brodsky, J. L. The delicate balance between secreted protein folding and endoplasmic reticulum-associated degradation in human physiology. Physiological Reviews. 92, 537-576 (2012).
  3. Pagan, J., Seto, T., Pagano, M., Cittadini, A. Role of the ubiquitin proteasome system in the heart. Circulation Research. 112, 1046-1058 (2013).
  4. Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443, 780-786 (2006).
  5. Turnbull, E. L., Rosser, M. F., Cyr, D. M. The role of the UPS in cystic fibrosis. BMC Biochemistry. 8, Suppl 1. S11(2007).
  6. Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 29-46 (2011).
  7. Kar, G., Keskin, O., Fraternali, F., Gursoy, A. Emerging role of the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Current Pharmaceutical Design. 19, 3175-3189 (2013).
  8. Paul, S. Dysfunction of the ubiquitin-proteasome system in multiple disease conditions: therapeutic approaches. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 30, 1172-1184 (2008).
  9. Shen, M., Schmitt, S., Buac, D., Dou, Q. P. Targeting the ubiquitin-proteasome system for cancer therapy. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 17 (9), 1091-1108 (2013).
  10. Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 192, 319-360 (2012).
  11. Scheffner, M., Nuber, U., Huibregtse, J. M. Protein ubiquitination involving an E1-E2-E3 enzyme ubiquitin thioester cascade. Nature. 373, 81-83 (1995).
  12. Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, 679-690 (2008).
  13. Hochstrasser, M., Ellison, M. J., Chau, V., Varshavsky, A. The short-lived MAT alpha 2 transcriptional regulator is ubiquitinated in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 4606-4610 (1991).
  14. Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast alpha 2 repressor. Cell. 61, 697-708 (1990).
  15. Bays, N. W., Gardner, R. G., Seelig, L. P., Joazeiro, C. A., Hampton, R. Y. Hrd1p/Der3p is a membrane-anchored ubiquitin ligase required for ER-associated degradation. Nature Cell Biology. 3, 24-29 (2001).
  16. Hampton, R. Y., Gardner, R. G., Rine, J. Role of 26S proteasome and HRD genes in the degradation of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase, an integral endoplasmic reticulum membrane protein. Molecular Biology of the Cell. 7, 2029-2044 (1996).
  17. Swanson, R., Locher, M., Hochstrasser, M. A conserved ubiquitin ligase of the nuclear envelope/endoplasmic reticulum that functions in both ER-associated and Matalpha2 repressor degradation. Genes & Development. 15, 2660-2674 (2001).
  18. Goebl, M. G., et al. The yeast cell cycle gene CDC34 encodes a ubiquitin-conjugating enzyme. Science. 241, 1331-1335 (1988).
  19. Bachmair, A., Finley, D., Varshavsky, A. In vivo half-life of a protein is a function of its amino-terminal residue. Science. 234, 179-186 (1986).
  20. Chen, P., Johnson, P., Sommer, T., Jentsch, S., Hochstrasser, M. Multiple ubiquitin-conjugating enzymes participate in the in vivo degradation of the yeast MAT alpha 2 repressor. Cell. 74, 357-369 (1993).
  21. Varshavsky, A. Discovery of the biology of the ubiquitin system. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 311, 1969-1970 (2014).
  22. Heinemeyer, W., Kleinschmidt, J. A., Saidowsky, J., Escher, C., Wolf, D. H. Proteinase yscE, the yeast proteasome/multicatalytic-multifunctional proteinase: mutants unravel its function in stress induced proteolysis and uncover its necessity for cell survival. The EMBO Journal. 10, 555-562 (1991).
  23. Sommer, T., Jentsch, S. A protein translocation defect linked to ubiquitin conjugation at the endoplasmic reticulum. Nature. 365, 176-179 (1993).
  24. Hiller, M. M., Finger, A., Schweiger, M., Wolf, D. H. ER degradation of a misfolded luminal protein by the cytosolic ubiquitin-proteasome pathway. Science. 273, 1725-1728 (1996).
  25. Seufert, W., Jentsch, S. In vivo function of the proteasome in the ubiquitin pathway. The EMBO Journal. 11, 3077-3080 (1992).
  26. Knop, M., Finger, A., Braun, T., Hellmuth, K., Wolf, D. H. Der1, a novel protein specifically required for endoplasmic reticulum degradation in yeast. The EMBO Journal. 15, 753-763 (1996).
  27. Zattas, D., Adle, D. J., Rubenstein, E. M., Hochstrasser, M. N-terminal acetylation of the yeast Derlin Der1 is essential for Hrd1 ubiquitin-ligase activity toward luminal ER substrates. Molecular Biology of the Cell. 24, 890-900 (2013).
  28. Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14, 115-132 (1998).
  29. Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 122, 19-27 (1989).
  30. Ralser, M., et al. The Saccharomyces cerevisiae W303-K6001 cross-platform genome sequence: insights into ancestry and physiology of a laboratory mutt. Open Biology. 2, 120093(2012).
  31. Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16, 857-860 (2000).
  32. Rubenstein, E. M., Kreft, S. G., Greenblatt, W., Swanson, R., Hochstrasser, M. Aberrant substrate engagement of the ER translocon triggers degradation by the Hrd1 ubiquitin ligase. The Journal of Cell Biology. 197, 761-773 (2012).
  33. Mayer, T. U., Braun, T., Jentsch, S. Role of the proteasome in membrane extraction of a short-lived ER-transmembrane protein. The EMBO Journal. 17, 3251-3257 (1998).
  34. Scott, D. C., Schekman, R. Role of Sec61p in the ER-associated degradation of short-lived transmembrane proteins. The Journal of Cell Biology. 181, 1095-1105 (2008).
  35. Kim, I., et al. The Png1-Rad23 complex regulates glycoprotein turnover. The Journal of Cell Biology. 172, 211-219 (2006).
  36. Fisher, E. A., et al. The degradation of apolipoprotein B100 is mediated by the ubiquitin-proteasome pathway and involves heat shock protein 70. The Journal of Biological Chemistry. 272, 20427-20434 (1997).
  37. Pariyarath, R., et al. Co-translational interactions of apoprotein B with the ribosome and translocon during lipoprotein assembly or targeting to the proteasome. The Journal of Biological Chemistry. 276, 541-550 (2001).
  38. Yeung, S. J., Chen, S. H., Chan, L. Ubiquitin-proteasome pathway mediates intracellular degradation of apolipoprotein. B. Biochemistry. 35, 13843-13848 (1996).
  39. Mumberg, D., Muller, R., Funk, M. Regulatable promoters of Saccharomyces cerevisiae: comparison of transcriptional activity and their use for heterologous expression. Nucleic Acids Research. 22, 5767-5768 (1994).
  40. Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. International Journal of Molecular Sciences. 10, 2763-2788 (2009).
  41. Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N., Burke, D. Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2005).
  42. Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197, 33-48 (2014).
  43. Guthrie, C., Fink, G. R. Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology. , Elsevier. San Diego. (2004).
  44. Sherman, F. Getting started with yeast. Methods in Enzymology. 350, 3-41 (2002).
  45. Xie, Y., Rubenstein, E. M., Matt, T., Hochstrasser, M. SUMO-independent in vivo activity of a SUMO-targeted ubiquitin ligase toward a short-lived transcription factor. Genes & Development. 24, 893-903 (2010).
  46. Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. The EMBO Journal. 25, 533-543 (2006).
  47. Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. The Journal of Biological Chemistry. 283, 32302-32316 (2008).
  48. Medicherla, B., Kostova, Z., Schaefer, A., Wolf, D. H. A genomic screen identifies Dsk2p and Rad23p as essential components of ER-associated degradation. EMBO Reports. 5, 692-697 (2004).
  49. Kohlmann, S., Schafer, A., Wolf, D. H. Ubiquitin ligase Hul5 is required for fragment-specific substrate degradation in endoplasmic reticulum-associated degradation. The Journal of Biological Chemistry. 283, 16374-16383 (2008).
  50. Crouse, G. F. Mutagenesis assays in yeast. Methods. 22, 116-119 (2000).
  51. Le Douarin, B., Pierrat, B., vom Baur, E., Chambon, F., Losson, R. A new version of the two-hybrid assay for detection of protein-protein interactions. Nucleic Acids Research. 23, 876-878 (1995).
  52. Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. 5-Fluoroorotic acid as a selective agent in yeast molecular genetics. Methods in Enzymology. 154, 164-175 (1987).
  53. Toyn, J. H., Gunyuzlu, P. L., White, W. H., Thompson, L. A., Hollis, G. F. A counterselection for the tryptophan pathway in yeast: 5-fluoroanthranilic acid resistance. Yeast. 16, 553-560 (2000).
  54. Schafer, A., Wolf, D. H. Endoplasmic reticulum-associated protein quality control and degradation: genome-wide screen for ERAD components. Methods in Molecular Biology. 301, 289-292 (2005).
  55. Griggs, D. W., Johnston, M. Regulated expression of the GAL4 activator gene in yeast provides a sensitive genetic switch for glucose repression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 8597-8601 (1991).
  56. Duennwald, M. L. Growth assays to assess polyglutamine toxicity in yeast. The Journal of Visualized Experiments. (61), e3791(2012).
  57. Baryshnikova, A., et al. Synthetic genetic array (SGA) analysis in Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe. Methods in Enzymology. 470, 145-179 (2010).
  58. Szymanski, E. P., Kerscher, O. Budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications. The Journal of Visualized Experiments. (80), e50921(2013).
  59. Hjelm, H., Sjodahl, J., Sjoquist, J. Immunologically active and structurally similar fragments of protein A from Staphylococcus aureus. European Journal of Biochemistry. 57, 395-403 (1975).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Gistgroei assayfusie eiwitselectief mediumeiwitextractieWestern blot analyseseri le verdunningubiquitine ligaseonstabiel eiwit

Gerelateerde artikelen