Kwantitatieve Massaspectrometrische Profilering van Kanker-cel proteoom Afgeleid Van vloeibare en vaste tumoren

Samenvatting

Diepgaande analyses van kankercel-proteomen vergemakkelijken de identificatie van nieuwe doelen voor geneesmiddelen en diagnostische biomarkers. We beschrijven een experimentele workflow voor kwantitatieve analyse van (fosfo-)proteomen in kankercelsubpopulaties afgeleid van vloeibare en vaste tumoren. Dit wordt bereikt door cellulaire verrijkingsstrategieën te combineren met kwantitatieve Super-SILAC-gebaseerde massaspectrometrie.

Samenvatting

Diepgaande analyses kanker cel proteoom nodig oncogene pathomechanisms helderen, alsmede potentiële drug targets en diagnostische biomarkers identificeren. Echter, zijn methoden voor de kwantitatieve proteomics karakterisering van de patiënt afgeleid tumoren en in het bijzonder hun cellulaire subpopulaties ontbreken grotendeels. Hier beschrijven we een experimentele set-up die kwantitatieve analyse van proteomen van kankercel subpopulaties afgeleid van vloeibare of vaste tumoren mogelijk maakt. Dit wordt bereikt door cellulaire verrijkingsstrategieën combineren met kwantitatieve Super-SILAC gebaseerde massaspectrometrie gevolgd door bio gegevensanalyse. Naar specifieke cellulaire subsets te verrijken, worden vloeibare tumoren eerst immunophenotyped door flowcytometrie gevolgd door FACS-sortering; voor solide tumoren, is laser-capture microdissection gebruikt om specifieke cellulaire subpopulaties te zuiveren. In een tweede stap worden eiwitten geëxtraheerd uit de gezuiverde cellen en vervolgens gecombineerd met een tumor-specifieke,SILAC gemerkte spike in standaard dat eiwit kwantificering mogelijk maakt. Het verkregen eiwitmengsel onderworpen aan ofwel gelelektroforese of Filter Aided Monsterbereiding (FASP) gevolgd door tryptische digestie. Tenslotte worden tryptische peptiden geanalyseerd met een hybride quadrupool-massaspectrometer orbitrap, en de verkregen gegevens worden verwerkt met bioinformatica software pakketten zoals MaxQuant. Met behulp van de hier gepresenteerde tot 8000 eiwitten workflow worden geïdentificeerd en gekwantificeerd patiënt afgeleide monsters, en de resulterende eiwitexpressie profielen kunnen vergeleken worden bij patiënten met diagnostische proteomics handtekeningen of potentiële drug targets te identificeren.

Inleiding

Massaspectrometrie gebaseerde proteomics is ontstaan ​​en is nu een veel gebruikte discipline in de celbiologie en translationeel biomedisch onderzoek. Technische vooruitgang op het gebied hebben het mogelijk om complexe cellulaire processen in cellijnen en diermodellen studie gemaakt als duizenden eiwitten kunnen worden geïdentificeerd in een enkele massaspectrometrische experiment ^1,2. Soortgelijke vooruitgang geboekt voor de analyse van vele posttranslationele modificaties zoals fosforylering of ubiquitinatie, hoewel maat werkstromen voor verrijking en gegevensanalyse voor elk type modificatie ^2,3 meestal vereist. Bovendien is de betrokkenheid van chemische en metabolische labeling strategieën, waaronder SILAC, maakt een nauwkeurige relatieve kwantificering van eiwitten en PTMs, waardoor deze werkwijze bijzonder aantrekkelijk voor de ontdekking van biologische processen, diagnostische biomarkers en potentiële drug targets in verschillende kankers ^4.

Echter,verschillende uitdagingen overwonnen moeten worden met betrekking tot proteomics analyse van primaire menselijke kankers ^5. Allereerst menselijke kanker monsters vertonen vaak een hoge mate van cellulaire heterogeniteit die door de aanwezigheid van verschillende celtypes behoren tot de tumor micro-omgeving, zoals immune cellen en fibroblasten. Tweede klonale evolutie leidt genetische diversiteit in de tumoren zelf, waardoor het bestaan ​​van verscheidene cellulaire subpopulaties met verschillende functionele eigenschappen. Volgens het huidige concept van een paar kanker stamcellen zijn de drijvende krachten achter de ontwikkeling en progressie van kanker, proteomics analyse van dergelijke (functioneel zeer relevant) cellulaire subpopulaties verwachting is van groot belang voor een beter begrip van oncogene mechanismen die relevant zijn voor klinische toepassing ^6. Ten derde kwantitatieve eiwitexpressie profielen van grote series monsters vaak vereist voor de identificatie van robuuste klinische Biomarkers; Dit kan niet worden bereikt door chemische labeling zoals iTRAQ ^7, terwijl metabolisch merken strategieën - vertrouwen, aangezien zij op cellulaire proliferatie ⁴ - zijn eveneens van toepassing. Vierde meeste beschikbare vaste tumor monsters in formaline gefixeerd, die massaspectrometrische proteoom analyse bemoeilijkt door de vorming van eiwit crosslinks ^8. Tot slot, de meeste bestaande proteomics workflows vereisen aanzienlijke hoeveelheden monster verwerking en data-acquisitie, waardoor de analyse van de aantallen monsters die relevant zijn voor klinisch onderzoek moeilijk, en waarin wordt opgeroepen tot nieuwe workflow paradigma ^9,10.

Om deze obstakels te pakken we een experimentele opstelling die ofwel Stromingscytometrische cel combineert het sorteren ¹¹ of laser-capture microdissection ^12,13 voor cellulaire verrijking met een Super-SILAC ¹⁴ strategie om een wereldwijde interne standaard voor een uitgebreide massaspectrometrische analyse introduceren ontwikkeld. Met de hier beschreven werkwijze is het mogelijk te kwantificeren tot 8.000 eiwitten in enkele humane tumormonsters afgeleid van vloeibare of vaste kankers.

Protocol

Alle experimenten op de menselijke weefsel of bloedmonsters moet worden goedgekeurd door een ethische commissie en uitgevoerd volgens een van de richtlijnen gegeven in de ethiek stemming.

1. Cellular Verrijking

1. Vloeibare tumoren / fluorescentie-geactiveerde cel sorteren.
   1. Isoleer mononucleaire cellen uit beenmerg of bloedmonster door het uitvoeren van erytrocyten lysis behulp van ammoniumchloride of door Ficoll dichtheid-gradiëntcentrifugatie.
      1. Voor erytrocyten lysis combineren 1 ml monster met 4 ml ammoniumchlorideoplossing. Incubeer de oplossing op ijs voor 5-10 min. Voeg 40 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) + 2% foetaal kalfsserum (FCS) en centrifugeer 5 min bij 400 xg en 4 ° C.
      2. Voor Ficoll gradiëntcentrifugatie, laag 10 ml van het monster van 15 ml Ficoll-Hypaque om 2 verschillende lagen te vormen (wees voorzichtig niet om de lagen te verstoren). Centrifugeer bij 400 xg gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (15-25 ° C) voorzichtig en oogst de mononucleairecellen die halen bij de interfase.
      3. Spin down de cellen en nemen ze in PBS + 2% FCS. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten en nemen in 1 ml PBS + 2% FCS. Neem een ​​monster als negatieve controle en één monster per fluorescente kleurstof in het eindproduct vlek.
   2. Incubeer met fluorescentie gemerkte antilichamen nuttig de leukemische celpopulatie te isoleren verdunning volgens instructies van de fabrikant op ijs gedurende 30 min. Ook vlekken op de hoeveelheden die voor vergoeding met elk antilichaam individueel. Tweemaal wassen met PBS + 2% FCS.
      OPMERKING: De antilichamen die waren muis anti-humaan tegen CD117-PE (Clone 95C3), CD34-FITC (Clone 8G12) en CD33-PE (Clone P67.6).
   3. Filter cellen door 35 micrometer cel zeef, idealiter met behulp van buizen met celzeef geïntegreerd in de dop.
   4. Voeg levensvatbaarheid van de cellen vlek (bijvoorbeeld 7-AAD). Sorteer cellen met een geschikte celsortering ¹¹ (figuur 2). Verzamel cellen in Isc ove gemodificeerd Dulbecco's medium (IMDM) dat 10% FCS.
2. Solide tumoren / Laser-microdissectie.
   1. Voor de beschreven experimenten werden FFPE monsters van longkanker specimen gebruikt. Voor dit doel werd longkanker weefsel onmiddellijk gefixeerd in 4% gebufferde formaline na chirurgische resectie en stukjes van ongeveer 3 x 2 x 1 cm wanneer ingebed in paraffine voor verdere analyse.
   2. Snijd secties van 5-10 micrometer dikte van de formaline gefixeerde paraffine ingebedde (FFPE) monster met een microtoom. Mount secties in folie bedekte membraan dia en droog bij 37 ° C gedurende 1 uur. Deparaffinize en rehydrateren de gemonteerde delen door opeenvolgende incubatie in xyleen, absolute ethanol, 70% en water, elk voor 1 min.
   3. Vlekken op de secties met hematoxyline voor 20 sec en dan afspoelen met leidingwater. Het verzamelen van de betrokken celpopulatie met behulp van een laser-capture microdissectie systeem (zie ook ^12).

titel "> 2. Eiwitextractie

1. Vloeistof tumoren.
   1. Centrifugeer de celsuspensie uit stap 1.1.5 bij 400 xg, 4 ° C gedurende 4 min en de bovenstaande vloeistof. Tweemaal wassen met 500 ul koude PBS en centrifugatie gedurende 5 min bij 400 xg en 4 ° C
   2. Voeg 40 ul lysisbuffer per 10 ⁶ cellen en incubeer 15 min op ijs (10 ⁵ cellen (ong. 10 pg totaal eiwit) moet het minimumaantal cel). Centrifugeer het lysaat bij 14.000 xg, 4 ° C gedurende 10 minuten en giet het supernatant (verwijderd cellulaire lysaat) een nieuwe reageerbuis. Gooi de pellet.
2. Vaste tumoren.
   1. Voeg 60 ul van weefsel lysis buffer om de gemicrodissecteerde weefsel en incubeer gedurende 15 minuten op ijs, het verzamelen van de vloeistof door korte centrifugeren en breng de ophanging aan een nieuwe reageerbuis. Ultrasone trillingen het lysaat op ijs gedurende 3 min.
   2. Voeg 15 ul van 20% natriumdodecylsulfaat (SDS) om bereiken definitieve SDS concentration van 4%. Incubeer de gemicrodissecteerde weefsel bij 99 ° C in een verwarmingsblok gedurende 1 uur geroerd en bij 600 rpm. Centrifugeer het lysaat bij 16.000 xg, 18 ° C gedurende 10 min en breng het supernatant naar een nieuwe buis.

3. Oprichting van een SILAC Spike-in Kwantificering Standaard (Super-SILAC Standard)

OPMERKING: De kwantificering standaard bestaat uit een SILAC gemerkt eiwitmengsel afkomstig 4-6 cellijnen die overeenkomen met het soort tumor plaats. Om de maximale overlap tussen de SILAC gelabelde referentie proteoom en de tumor afgeleide proteoom bereiken, een principale component moet worden uitgevoerd voordat cellijnen geselecteerd voor de kwantificering standaard ^14.

1. Principal component analyse (PCA).
   1. Om het eiwit expressie van cellijnen bepalen kweken ongeveer tien verschillende cellijnen in geschikte celkweekmedium. Lyse van de cellen zoals beschrevenin stap 2.1. Bereid cellysaten voor massaspectrometrie zoals beschreven in stap 6.1.
   2. Analyseer de eiwitexpressie patroon van elke cellijn op een hoge-resolutie, vloeistof-chromatografie gekoppeld massaspectrometer (nanoLC-MS / MS).
   3. Analyseer de resulterende ruwe data met behulp van een gratis ware MaxQuant en het uitvoeren van een van de belangrijkste componenten analyse met behulp van de bijbehorende software zoals Perseus ^16,17.
   4. Selecteer 4-6 cellijnen die de grootste diversiteit tussen hun proteïne-expressie profielen te tonen en gebruik ze om de Super-SILAC spike-in standaard te genereren.
2. SILAC-etikettering en label check.
   1. Cultiveren geselecteerde cellijnen ten minste vijf celdelingen in geschikte SILAC celkweekmedium, waarin arginine en lysine worden gelabeld met stabiele isotopen van koolstof en stikstof (SILAC gemiddeld) ^4.
   2. Lyse van de cellen zoals beschreven in stap 3.1 en bereiden cellysaten voor massaspectrometrie zoals beschreven in stap 6.1.Meet de incorporatie efficiëntie van SILAC etikettering door nanoLC-MS / MS. Analyseer de resulterende ruwe MS-gegevens met MaxQuant en bepalen de efficiëntie van SILAC-etikettering. Dit wordt bereikt door het tellen van het aantal peptiden die in het etiket (zware) en hun endogene vormen (licht), en de ratio te berekenen (zware) / (zwaar + licht). Labelingsefficiëntie hoger mag zijn dan 98%.
3. Combinatie van SILAC proteomen en validatie.
   1. Verbouwen en uitbreiden geselecteerde cellijnen volgens de instructies van de fabrikant in de juiste SILAC medium. Lyse van de cellen zoals beschreven in stap 2.1 voor vloeibare tumoren of zoals beschreven in stap 3.2 voor vaste tumoren en bepaal eiwitconcentratie voor elke cellulaire lysaat.
   2. Meng equimolaire eiwit hoeveelheden van elke cellijn en verdeel het mengsel in portie. Snap-bevriezen van de porties en bewaar bij -80 ° C tot meting. Voor een experiment wat je nodig hebt 20-50 ug van Super-SILAC standaard. Zorg ervoor dat de stan bereidendard boven het veranderen van de standaard in een reeks proeven worden vermeden.

4. Meting van eiwitconcentratie en Spike in

1. Vloeistof tumoren.
   1. Met eiwitkwantificering assay bepaalt de eiwitconcentraties van de desbetreffende cellysaten en de Super-SILAC standaard.
   2. Meng gelijke hoeveelheden geklaard cellulaire lysaat en de Super-SILAC standaard en alsnog lithium dodecyl sulfaat (LDS) buffer (25% van het monstervolume) en reductiemiddel (10% van het monstervolume).
   3. Verwarm de verkregen oplossing in een verwarmingsblok bij 72 ° C gedurende 10 min. Eventueel het resulterende gedenatureerde eiwitten bij -80 ° C.
2. Vaste tumoren.
   1. Voor eiwitconcentratie gemeten op een plaatlezer, meng standaard runderserumalbumine (BSA) verdunningsoplossing serie, het lysaat en de juiste Super-SILAC standaard met een commercieel verkrijgbaar eiwit eenssay in een 96-well plaat en schud gedurende 1 min geïncubeerd aangegeven tijd en meet absorptie zoals aangegeven door de fabrikant.
      OPMERKING: De hoge concentratie van SDS en dithiothreitol (DTT) in het lysaat is een probleem voor de meeste beschikbare assays voor eiwit concentratiebepaling.
   2. Meng gelijke hoeveelheden geklaarde lysaat en de Super-SILAC standaard met 200 ul van ureum in de filtereenheid en centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 30 min bij 20 ° C. Gebruik niet meer dan 50 ul van geklaarde lysaat en de Super-SILAC standaard. Vermijd temperaturen onder 15 ° C, zodat ureum niet uitkristalliseren.

5. Sample Scheiding en Protein Digest

1. Vloeistof tumoren.
   1. Aparte 30-100 ug totaal eiwit per rijstrook op een 4-12% gradiënt SDS-PAGE gel. Stain eiwitten met Coomassie Blue O / N. Verwijder overtollige Coomassie vlek door twee opeenvolgende wasbeurten met water.
   2. Snijd elke baan van de gel en verdeel hetin 23 gelijke grootte plakjes ongeacht het patroon van gelkleuring. Verwerk de gelplakjes afzonderlijk, elk in een in 0,6 ml polypropyleen flacon.
   3. Was de gelplakjes met water en methanol / water (50:50, v / v), verminderen met 10 mM DTT door incubatie gedurende 30 minuten bij 56 ° C. Alkylaat de gelplakjes met 55 mM joodacetamide (IAA) door incubatie 60 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
   4. Tussen monster behandeling stappen, wassen plakjes met acetonitril gedurende 15 minuten en droog in een SpeedVac om overtollig oplosmiddel te verwijderen en de opname van reagensoplossing verbeteren.
   5. Voer protease splitsing door rehydrateren gedroogde gel plakjes met de minimale hoeveelheid van varkens trypsine-oplossing (12,5 ng / ul in 0,025 M waterig ammonium bicarbonaat) gedurende 16 uur bij 37 ° C.
   6. Voeg 10 ul water gel slice en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C. Voeg 80 ul acetonitril en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C. Centrifugeer bij 15.800 xg gedurende 1 min. Verzamel supernatant en op te slaan in een aparte 0,6 mlbuis.
   7. Voeg 65 ul van 5% mierenzuur oplossing vortex en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C. Voeg 65 ul acetonitril en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C. Centrifugeer bij 15.800 xg gedurende 1 min. Verzamel de bovenstaande vloeistof toevoegen aan de supernatant van de vorige stap. Damp het gecombineerde supernatant tot droog in vacuüm concentrator.
2. Vaste tumoren.
   1. SDS uit weefsel lysaat te verwijderen gebruikt u de volgende FASP protocol, ook wel omschreven als in referentie ^15.
   2. Na de eerste centrifugatie in stap 5.2.3 beschreven voeg nogmaals 200 ul 8 M ureum op het filter en verder centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 20 min bij 20 ° C. Gooi de doorstroom filtraat.
   3. Voeg 100 ul IAA en meng in een thermomixer bij 600 rpm gedurende 1 minuut. Incubeer de filter gedurende 20 minuten bij 20 ° C in het donker. Centrifugeer het filter bij 14.000 xg gedurende 10 min bij 20 ° C.
   4. Voeg 100 ul van ureum aan het filter en centrifuge bij 14.000 xg gedurende 15 min bij 20 ° C. Herhaal deze stap nog een keer.
   5. Voeg 100 ul van NH ₄ HCO ₃ het filter en centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 10 min bij 20 ° C. Herhaal deze stap twee keer.
   6. Voeg 40 ul NH ₄ HCO ₃ + 1 gl (= 0,4 g) trypsine en meng thermomixer bij 20 ° C 600 rpm, 1 min. Incubeer de filter O / N in een vochtige kamer bij 37 ° C. Breng de filter om nieuwe collectie buizen.
   7. Centrifugeer het filter bij 14.000 xg gedurende 10 min bij 20 ° C. Voeg 50 ul van _NH4 HCO ₃ en centrifugeer de filter bij 14.000 g gedurende 10 min bij 20 ° C. Bewaar de verkregen peptiden bij -20 ° C totdat massaspectrometrische meting.
   8. Voor peptide concentratiemeting afzien 50 ui van de resulterende doorstroom en een reeks geschikte verdunningen nette tryptofaan in een 96-well plaat. Meet tryptofaan fluorescentie. Zetten de resulterende concentratie vantryptofaan peptide concentratie 0,1 ug tryptofaan overeenkomt met 9 ug eiwit.

6. vloeistofchromatografie en massaspectrometrische analyse

1. Peptiden opnieuw worden opgelost in 30 ul loading buffer gedurende 5 min in een ultrasoonapparaat bad. Spin down in een centrifuge bij 15.800 xg gedurende 1 minuut en pipet de heldere oplossing in een MS autosampler flesje.
2. Injecteer 5 pl monster per analyse via de autosampler van de nanoLC-MS / MS systeem. Concentreren en ontzouten peptiden online op een reversed phase C18 pre-kolom (0,15 mm ID x 20 mm met 5 micrometer poriegrootte C18 materiaal) gemonteerd in een van beide een geventileerde kolominstelling of een prekolom schakelen setup.
3. Afzonderlijke peptiden op een omgekeerde fase C18 microkolom (0,075 mm ID x 200 mm zelf verpakt met 3 urn of kleiner poriegrootte C18 materiaal als zelfstandige pakket nanosproeivloeistof kolom zoals PicoFrit, met een 90 min gradiënt van 5> 35% acetonitril vs . 0,1% waterig mierenzuur bij 300 nl /min. Transfer eluens in een hybride quadrupool / orbitrap massaspectrometer via een nanospray ion bron.
4. Analyseer peptiden met behulp van een Top15 data afhankelijke acquisitie methode (MS m / z range 350 -. 1600, resolutie doelwit 70.000 FWHM, AGC target 1 x 10 ^6, max vultijd 60 msec MS / MS start massa 100, resolutie doelwit 17.500 FWHM, AGC doel 2 x 10 ^5, max vultijd 60 msec MS / MS drempel van 3 x 10 ^4, onder meer rekenen staten 2 -. 5, Genormaliseerde botsingsenergie NCE 25%, dynamische uitsluiting 15 sec).

7. Data Analyse

1. Voor data-analyse gebruik maken van de vrij beschikbare MaxQuant ¹⁶ software. Een gedetailleerd protocol voor bio gegevensanalyse wordt beschreven in ^16,17. Voor analyse, combineer ruwe data bestanden van alle segmenten van een SDS-PAGE lane in een enkel experiment ^17.

Resultaten

Eiwitprofilering van vloeibare en vaste tumoren van patiënten is een veelbelovende benadering voor de ontdekking van nieuwe diagnostische en voorspellende biomarkers. Echter, bereiding van het monster en de massaspectrometrische analyse uitdagend, gezien de complexiteit van de monsters en de behoefte aan nauwkeurige kwantificering eiwit in grote series monsters. De hierboven beschreven experimentele procedure begint met de isolatie van cellen van belang, hetzij door fluorescentie geactiveerde celsortering of door laser capture microdissectie.

Hiertoe worden cellen van patiënt afgeleide beenmergaspiraten of bloed monsters gekleurd met fluorescerend gemerkte antilichamen tegen gedefinieerde oppervlak markers van belang voor FACS gebaseerde sortering en cellysis.

Om cellulaire subsets uit weefsel secties te verrijken, deze hebben voor het eerst op de juiste dia's om te worden gemonteerd om voor laser-capture microdissectie. Voor dit doel te monteren tHij weefselcoupes geschikte membraan glijbanen en gebruik een laser-capture microdissector volgens de instructies van de fabrikant. Het selecteren van de gebieden en de cellen van belang vereist de nodige kennis over de histomorphology van gezonde en neoplastische weefsel. De gewonnen cellen worden vervolgens overgebracht naar een geschikte collectie buis. Initiële experimenten worden uitgevoerd om de hoeveelheid weefsel die nodig zijn voor winning van voldoende hoeveelheden eiwit (ten minste 10 ug totaal eiwit) voor elk nieuw weefsel van belang te definiëren. Elk gemicrodisseceerde monster wordt behandeld met 60 gl weefsel lysis buffer. Voor een efficiënte lysis cellen van weefselmonsters moet gesoniceerd gedurende 3 minuten en na toevoeging van 15 ui SDS monsters worden geïncubeerd in een thermomixer bij 99 ° C gedurende 1 uur tot formaline geïnduceerde proteïne crosslinks verwijderen. Centrifugeren zal uiteindelijk de collectie van de ontruimde cellulaire lysaat vergemakkelijken.

Voor elke ziekte van iBELANG (vloeibare en vaste tumoren) een geschikte Super-SILAC kwantificering norm moet worden vastgesteld ^14. Een geschikte norm moet meer dan 90% van de eiwitten tot expressie in de monsters van belang vertegenwoordigen. Voor de bereiding van een kwantificering standaard dient cellijnen gerelateerd aan het type kanker van belang eerst geanalyseerd door massaspectrometrie hun eiwitexpressie profiel kan worden en vervolgens principale component moet worden uitgevoerd. 4-6 verschillende cellijnen met differentiële eiwit expressie worden gekozen en SILAC gelabeld met "zware" arginine en lysine. Labelingsefficiëntie moet worden gecontroleerd door nanoLC-MS / MS en moet groter zijn dan 98% bedragen. Daarna moet cellijnen worden gelyseerd op dezelfde wijze als de desbetreffende patiënt verkregen monster en vervolgens moet equimolaire hoeveelheden eiwit van elk monster en de SILAC piek in standaard gemengd. Een cruciale stap voor nauwkeurige eiwit kwantificering van klinische monsters of belang is de nauwkeurige mengsel van equimolaire eiwit hoeveelheden van de patiënt verkregen monsters en de SILAC spike-in kwantificering standaard. De eiwitconcentratie van lysaten afgeleid van cellen gesorteerd bepalen, kunnen diverse eiwit kwantificering assays worden gebruikt. Voor cellulaire lysaten van weefsel afgeleide cellen een test nodig die kan omgaan met hoge concentraties van SDS en DTT in het lysaat. Eiwitconcentraties van de patiënt verkregen monsters en de SILAC piek in standaard moet worden gemeten telkens vóór combinatie met de respectieve klinische monsters om correct mengsel, dat is cruciaal in het maken zelfs honderden monsters vergelijkbare waarborgen.

Nadat het mengsel van gelijke hoeveelheden spike-in standaard en lysaat verkregen uit vloeibare tumoren worden gemengd met LDS, in een thermomixer verwarmd bij 72 ° C gedurende 10 min en vervolgens onderworpen aan 1D-PAGE en in-gel digestie van de afgescheiden eiwitten met trypsine. Monsters uitweefsel bevrijd van SDS en gedigereerd met trypsine door de FASP benadering zoals door Wisniewski et al. ¹⁵

De tryptische peptiden verkregen kan worden gekwantificeerd door tryptofaan fluorescentie, hetgeen van bijzonder belang voor weefselmonsters als de hoeveelheid gesecreteerd uit de filter verschilt tussen 15% en 75% vergeleken met de hoeveelheden eiwit eerst op het filter geplaatst. Hiertoe meten we de fluorescentie van tryptofaan. Vergelijking met een geschikte tryptofaan verdunningsreeks maakt de kwantificering van peptiden, 1,1 ug tryptofaan overeen met ongeveer 100 ug van peptide. Eventueel monsters name ontleend FASP verwerkingen vooraf gezuiverd op commerciële of zelfgemaakte stage tips gepakt met omgekeerde fase C18 (RP-C18) materiaal voordat op de nanoLC / MS / MS systeem ^18.

Massaspectrometrische analyse wordt uitgevoerd op een hoge-resolutie, hoge gevoeligheid massaspectrometrie systeem. Kortom, peptide monsters ontzout en gepreconcentreerd op een RP-C18 voorkolom en gescheiden op een RP-C18 analytische kolom direct gekoppeld aan de massaspectrometer. Om voldoende diepte van de analyse te bereiken maken we gebruik van ofwel een combinatie van SDS-PAGE eiwit voorfractionering met 40 min gradiënten RP-C18 (voor vloeibare tumoren) of enkelvoudige injecties met lange 2-3 hr RP-C18 gradiënten (voor solide tumoren verwerkt door FASP ). MS spectra worden verkregen tegen een resolutie van 70.000 FWHM of beter, om nauwkeurige kwantificering van SILAC paren mogelijk door integratie van de chromatografische piek profielen. Voor proteïne-identificatie, wordt een Top15 data-afhankelijke acquisitie methode om een ​​groot aantal peptide MS / MS spectra voor peptide- en proteïne-identificatie genereren.

Uit de resulterende ruwe data, identificeren en kwantificeren eiwit worden bereikt door de database te zoeken met MaxQuant software tegen een UniProt Knowledgebase Human Compleet Proteome sequentiedatabank ^17. In MaxQuant software (huidige versie 1.5.0.25) peptiden worden geïdentificeerd van de verworven MS / MS spectra door peptide fragment-matching tegen spectra afgeleid in silico van de proteïnesequentie database. Tegelijkertijd, precursorion isotopische profielen geëxtraheerd rond hun chromatografische retentietijd en hun geïntegreerde piekoppervlakken worden gebruikt voor relatieve kwantificatie van het licht: zware peptide paren gegenereerd door SILAC labeling. Peptide identiteit en relatieve intensiteiten zijn dan de overeenkomstige proteïne eigenschappen toegekend. Perseus software (huidige versie 1.5.0.15) wordt vervolgens gebruikt om verder stroomafwaarts statistische beoordeling van de resultaten MaxQuant verwerking, waaronder sample to sample vergelijkingen PCA en hiërarchische clustering voeren.

De experimentele opzet beschreven we hebben geïdentificeerd en gekwantificeerd tot 8.000 eiwitten uit slechts 30 ug totaal eiwitverkregen uit vloeibare tumoren.

Tot 2500 eiwitten van vaste tumor monsters kunnen worden geïdentificeerd en gekwantificeerd in een shotgun proteomics aanpak met LC gradiënt van slechts 2 uur, waardoor de analyse van honderden klinische monsters in een relatief korte tijd.

Figuur 1. Experimentele workflow. De belangrijkste stappen van cellulaire-deelverzameling verrijking, eiwitisolatie, spike-in van de kwantificering standaard en massaspectrometrische analyse worden getoond voor vloeibare en vaste tumoren. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2. Cellular verrijking strategies. FACS sorteren en LCM. (A) Voorbeeldige gating strategie beeltenis gating op een-CD117 gekleurd leukemische celpopulatie verworven door een cel sorter. (B) lasermicrodissectie van solide tumor weefsel. Weefselcoupes van 5-10 urn dikte werden op film bedekte membraan objectglaasjes vóór kleuring gemonteerd. Regio van belang is handmatig geselecteerd voor lasermicrodissectie. Getoond worden de secties voordat microdissection met de regio van belang geel gemarkeerd en na microdissection. Een schaal bar van 50 micrometer is opgenomen in de figuur. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3. Cluster analyse van de menselijke kanker-cel proteoom. Unsupervised cluster analyse van protein expressie profielen van vloeibare en vaste tumoren werd uitgevoerd met behulp van de computationele platform Perseus. AC - Darmkanker, SCC - Plaveiselcelcarcinoom, SCC-Met - Plaveiselcelcarcinoom uitzaaiingen van hoofd-halskanker, R - technische repliceren.

Discussie

Massaspectrometrische profilering van patiënt afgeleide kanker cel proteoom is nodig voor de ontdekking van nieuwe diagnostische / predictieve biomarkers alsook een beter begrip van kanker celbiologie geven die op hun beurt leiden tot de identificatie van nieuwe potentiële drug targets kunnen. Dergelijke massaspectrometrische analyses zijn zeer uitdagend, vooral omdat diverse pre-analytische problemen moeten worden opgelost, als men robuuste en biologisch relevante resultaten.

De experimentele workflow beschreven maakt kwantitatieve proteomics karakterisering van proteomen afgeleid van cellulaire subpopulaties van zowel vloeibare als vaste tumoren. De initiële verrijking van tumorcellen door een FACS-gebaseerde mobiele sortingor microdissectie nodig om verontreiniging door cellen van de tumor micro-omgeving voorkomen. Bovendien zijn deze technieken mogelijk maken om cellulaire subpopulaties van belang te isoleren. Recente celbiologische studies hebben demontoond dat bepaalde cellulaire subpopulaties hebben tumor-initiërende eigenschappen en zijn dus zeer relevant voor kanker pathogenese ^19,20. Massaspectrometrie gevoeliger is geworden in de afgelopen jaren, kwantitatieve proteoomanalyse haalbaar voor kleine hoeveelheden eiwitten die kunnen worden afgeleid uit een paar duizend cellen, waardoor het mogelijk te concentreren op functioneel relevante celpopulaties.

De set-up hier gepresenteerd kan worden gebruikt om nieuwe diagnostische biomarkers in FFPE monsters identificeren en te valideren. Daarom belooft het nuttig hulpmiddel bea voor de verbetering van de klinische diagnostiek, aangezien er tot op heden nog onvoldoende moleculaire biomarkers in voldoende kwaliteit voor vele soorten kanker. Belangrijke voorbeelden van moeilijke differentiaaldiagnoses waarvoor biomarkers ontbreken, zijn het onderscheid tussen primaire longkanker van metastasen in de longen, intrapancreatic cholangiocellulaire carcinoom en pancreas adenocarcinoom, evenals verschillenentiation van goedaardige neurofibroom van zeer kwaadaardige perifere zenuw-schede tumoren. Bovendien wij en anderen hebben aangetoond dat kwantitatieve opheldering van proteomics handtekeningen nuttig bij het ​​bestuderen kankercelbiologie in het algemeen en voor het openbaren voorspellende biomarkers therapeutische respons bij kankerpatiënten ²¹ kan zijn.

Twee huidige nadelen van de hier gepresenteerde methode de noodzaak van uitgebreide handleiding monster verwerking en vergt nanoLC-MS / MS acquisitietijd. Terwijl de eerste door het bewegen van monstervoorbereiding tot bv 96-well-formaten en met behulp van robotica verwerking kan worden aangepakt, zal de laatste van een verandering in massa strategie trometrische verkrijging te eisen. Zodra subsets van doeleiwitten geïdentificeerd die kunnen worden gekoppeld aan bijvoorbeeld tumorclassificatie, voorzien wij het ​​ontwerp van gerichte massaspectrometrie methoden kwantitatieve uitlezingen deze deelverzamelingen met een sterk verminderde separatie inspanningen leveren, endaarom met een overeenkomstig verminderd acquisitie tijd. Indien de vereiste acquisitietijd nodig worden verlaagd 24-36 uur (vloeibaar tumoren) of 3 uur (vaste tumoren) op bijv, 1 uur met behulp van doelgerichte massaspectrometrie en eenvoudige eendimensionale scheiding van peptiden, dan is de resulterende winst overslag kunnen worden gebruikt om aanzienlijk het aantal biologische en technische repliceert onderzocht verhogen, met bijbehorende verbetering in de betekenis van kwantificering resultaten. Gerichte massaspectrometrische benaderingen reeds aangetoond een geschikt instrument voor de verificatie van kanker-geassocieerde eiwit biomarker-kandidaten ²² zijn, en zijn ontwikkeld tot een punt waar ze veelbelovend voor validatie of zelfs als een potentieel middel voor routinematig klinisch gebruik ^{23 , 24.}

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
660 nm Kit	Thermo scientific	22662
Celcultuurmedium gedepleterd van arginine en lysine	Thermo Scientific	88421
Coomassie Brilliant Blue R-250 kleuringsoplossing	Bio Rad	161-0436
Gedialyseerde foetaal runder serum (FCS)	PAA	A15-107
Diffuser caps voor microdissectie	MMI	50202
FACS-sorter	BD	FACSAria III
Ionische Detergent Compatibiliteits Reagens	Thermo scientific	22663
Laser-capture microdissector	MMI	cell cut plus
LDS buffer	Life Technologies	NP0009
Membrane slides voor microdissectie	MMI	50103
Microcon YM-30	Millipore	MRCF0R030
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Mini Gels	Life Technologies	NP0335PK2
Picofrit Self-Pack Kolommen	New Objective	PF360-75-15-N-5	Mass Spectrometry Column/Emitter
Reducing agent	Life Technologies	NP0007
Reprosil-Pur LC/MS/MS Column stationaire fase	Dr. Maisch	120 C18-AQ, 3 µm
Reprosil-Pur LC/MS/MS Precolumn stationaire fase	Dr. Maisch	120 C18-AQ, 5 µm
SILAC-gelabelde arginine	Eurisotop	CLM-2265-H-0.1
SILAC-gelabelde lysine	Eurisotop	DLM-2640-0.25
Trypsin, NB Sequencing Grade	Serva	3728301	voor in-gel digests
Trypsin, Sequencing Grade	Promega	V5111	voor in-solution digests
Buffer en oplossingen
Cel lysis buffer: 150 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl pH 7.8, 5 mM NaF,  0.5% NP40, 0.1% laurylmaltoside, Roche complete protease inhibitor, 1 mM Na3VO4
Weefsel lysis buffer: 100 mM Tris/HCl pH 7.8, 0.1 M DTT
Urea: 8 M urea in 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5			voor FASP-protocol
IAA: 0.05 M iodoacetamide, 8 M urea, 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5			voor FASP-protocol
0.05 M NH4HCO3
10 mM dithiothreitol (DTT) in 0.1 M ammonium bicarbonate			voor in-gel digest
55 mM iodoacetamide (IAA) in 0.1 mM ammonium bicarbonate			voor in-gel digest
5% waterige formique zuur.