Detectie van exosomaal Biomarker door Electric Field-geïnduceerde Release and Measurement (Efirm)

Samenvatting

Exosomen zijn microvesiculaire structuren die in biovloeistoffen worden aangetroffen en mogelijk belangrijke, voor ziekten discriminerende biomarkers dragen. Hier wordt een nieuwe methode gebruikt om specifiek exosomen te extraheren en het exosomale geladene snel te testen op zowel RNA/eiwitdoelen na de verstoring van exosomen met behulp van niet-uniforme elektrische cyclische vierkante golven.

Samenvatting

Exosomen zijn microvesicular structuren die een bemiddelende rol in intercellulaire communicatie spelen. Het is van belang om de interne lading exosomes onderzoeken om te bepalen of ze dragen ziekte discriminerende biomarkers. Voor het uitvoeren exosomaal analyse moet een werkwijze voor het extraheren en analyseren exosomes van target biovloeistoffen zonder de interne inhoud te ontwikkelen.

Elektrisch veld geïnduceerde vrijkomen en meting (Efirm) is een methode voor specifiek extraheren exosomen uit biovloeistoffen, lossen hun lading, en het testen van hun interne RNA / eiwitgehalte. Met behulp van een anti-humaan CD63 specifiek antilichaam magnetische microdeeltjes worden exosomes eerst geprecipiteerd uit biovloeistoffen. Na extractie, low-voltage elektrische cyclische blokgolven (CSW) worden toegepast op de vesiculaire membraan verstoren en leiden tot lading lossen. De inhoud van de exosome gehybridiseerd met DNA-primers of antilichamen geïmmobiliseerd op een elektrodeoppervlak voor quantification van moleculaire inhoud.

De Efirm werkwijze is voordelig voor de extractie van exosomes en lossen van vracht analyse zonder lysis buffer. Deze methode is in staat om specifieke detectie van RNA en eiwit biomarker doelen in de exosoom. Efirm extracten exosomes precies gebaseerd op hun oppervlak markers tegenstelling maat gebaseerde technieken.

Transmissie elektronenmicroscopie (TEM) en test tonen de functionaliteit van de werkwijze voor exosoom acquisitie en analyse. De Efirm methode werd gebruikt voor analyse van 9 muizen geïnjecteerd met menselijke longkanker H640 cellen (een cellijn getransfecteerd met de humane exosoom marker CD63-GFP expressie) om hun exosome profiel testen tegen 11 muizen die zoutoplossing controles exosomaal. Verhoogde niveaus van exosomaal biomarkers (referentie-gen GAPDH en eiwitoppervlak marker menselijk CD63-GFP) werden gevonden voor de H640 geïnjecteerde muizen in zowel serum en speeksel. Bovendien saliva en serummonsters werden aangetoond lineariteit (R = 0,79) hebben. Deze resultaten zijn suggestief voor de levensvatbaarheid van speeksel exosome biomarkers voor detectie van distale ziekten.

Inleiding

Exosome onderzoek is een opkomende gebied van onderzoek dat lipide microvesicles dat RNA ^1, DNA ^2, en eiwit ³ lading te vervoeren onderzoekt. Eerdere onderzoeken van exosome biologie hebben geleid tot de identificatie van exosomen in biovloeistoffen zoals bloed ^{4, 5} urine, moedermelk ^6, en speeksel ^7. Studies hebben aangetoond dat exosomes spelen een rol in verschillende cellulaire responsen op afstand mediteren communicatie tussen verschillende systemen van het lichaam ^8. Vanwege de rol exosomes spelen bij intercellulaire communicatie, wordt verondersteld dat ze biomolecule targets (eiwit, RNA en DNA) gecorreleerd met ziektetoestanden kunnen verpakken. In vitro ³ en diermodel ⁹ studies lijken deze hypothese te bevestigen. Bij het onderzoek exosomaal inhoud ontwikkeling van biomerkers, moet een methode voor selectieve isolatie van exosome biovloeistoffen ontwikkelen geïnduceerde expulsiop van de lading van exosomen, en kwantificatie van exosome biomoleculen. In de omvang van deze werkzaamheden zal exosomes gedefinieerd als een structuur met een diameter van ongeveer 70-100 nm en bezitten oppervlaktemarker CD63.

Onderzoekers normaliter eerst zuiveren exosomen door ultracentrifugeren ¹⁰ en dan verwerken exosomaal inhoud door het gebruik van lysebuffer kits. Gebruik lysisbuffer methoden vereist incubatietijden variëren van minuten tot uren. Dit proces kan in potentie schadelijk exosome lading en leiden tot degradatie proeven. Bijvoorbeeld, speeksel exosome RNA vrijkomt door lysis buffer in de omringende extracellulaire omgeving bezit een halfwaardetijd van minder dan 1 minuut, de meting van exosomaal RNA na lysis buffer bijzonder moeilijk zonder toevoeging van stabilisatie reagentia ^11. De samengestelde effect van het toevoegen van verschillende reagentia voor lysis en stabilisatie kunnen middelen die compliceren voeren en interfereren met de analysis van exosomaal inhoud. Een alternatieve benadering kan nuttig zijn voor het snel lossen exosomaal inhoud en veilig bewaren van de lading voor het karakteriseren zijn.

In dit werk, stellen wij het gebruik van een niet-uniform elektrisch veld voor de vrijlating van exosomaal inhoud. Elektrische velden is bekend dat het vermogen tot polariseren en verstoren de lipide dubbellaag die celmembranen vormt dragen. Onze experimentele werk onderzoekt het gebruik van niet-uniforme cyclische blokgolven (CSW) voor het verstoren van de microvesicle structuur van exosomen en het vrijgeven uitgevoerd lading. Deze methode maakt gebruik van spanningen in de honderden millivolt bereik, wat betekent dat de meeste biomoleculen niet worden verstoord. We tonen aan dat het gebruik van een cyclisch blokgolf kan afgifte van speeksel exosome mRNA gehalte bedienen in het omringende vloeibare omgeving. Deze versie van exosomaal inhoud naadloos geïntegreerd met een elektrode systeem dat kan worden gebruikt om de biomarker expressieniveaus kwantificeren ^12,13. De voorgestelde werkwijze maakt snelle, gevoelige en lysis buffer vrij analyse van exosome inhoud.

Figuur 1. Overzicht van Efirm ^Workflow.. De Efirm methode is in grote lijnen verdeeld in de drie grote fasen die nodig zijn voor het zuiveren en analyseren exosomen zijn.

Deze CSW gebaseerd exosomaal inhoud vrijkomen en analyse methode wordt gebruikt in combinatie met CD63-specifieke magnetische microbolletjes voor exosome isolement. Deze CD63-affiniteitskorrels zorgen voor de selectieve isolatie van exosomen uit speeksel monsters (en andere biovloeistoffen). Na incubatie en extractie van exosomen gebruik de gemagnetiseerde kralen, zijn de kralen gemigreerd naar de elektrochemische sensor systeem voor de CSW gebaseerde inhoud vrijkomen en analyse deel van het experiment. Figuur 1 geeft een overzicht van het werkstromen van de Efirm methode.

Protocol

1. Magnetische Bead-gebaseerde exosome Extraction

1. Pipetteer een goed gemengde oplossing van 5 ul van Streptavidine-gecoate magnetische microdeeltjes in 495 ui met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) buffer in een microcentrifugebuis om de kralen resuspenderen. Was en resuspendeer de kralen met 500 pl PBS driemaal met een magnetische rek. Het rek is een array van magneten op de zijkant van een wooneenheid dat het monster reactievaatjes kan houden.
   1. Voor elke wasbeurt, laten we eerst de buizen zitten op het rek voor 1 min, en vervolgens met een pipet tip om de bovenstaande buffer voorzichtig te verwijderen zonder verstoring van de kralen.
   2. Plaats de buizen regelmatig rooster zonder magneten aan de zijkant. Voeg 500 ul PBS in de buizen, en gebruik de pipet om de oplossing en kralen mengen. Dan zet de buizen weer op de magnetische rek de korrels opnieuw scheiden van de oplossing.
   3. Voer deze verwijdering van de buffer via magnetisatie en resuspensie in PBS eenin totaal drie keer. Deze voert een eerste wasbeurt van de magnetische deeltjes.
2. Resuspendeer de kralen in 490 pl PBS-buffer, met de buis die op de niet-gemagnetiseerde gedeelte van de magnetische rek. Pipetteer 5 ul gebiotinyleerd muis-anti-humaan CD63 antilichaam bij 1,0 mg / ml stock-concentratie in het mengsel van korrels. Gebruik de pipet om de kralen en antilichaam mengen in oplossing.
3. Plaats de microcentrifugebuizen met kralen en gebiotinyleerd antilichaam mengsel op een steekproef rotator. Stel de rotator parameters voor het monster rotator wederzijdse rotatie bij 90 ° kantelen gedurende 5 seconden en trillen bij 5 ° gedurende 1 sec. Draai de sample-kraal mengsel buizen bij deze parameters gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
4. Verwijder ongebonden antilichaam na conjugatie.
   1. Na 30 min rotatie bij kamertemperatuur, zet de buizen terug in de magnetische rek voor 5 min.
   2. Voer drie wassingen kralen door het verwijderen van de vloeibare fase met behulp van een micropipet en wassen met 500 μ, L PBS. Na de drievoudige wassen, resuspendeer de kralen in 490 ul van caseïne-PBS en plaats op de unmagnetized deel van het rack.
5. Exosoom extractie met antilichaam beklede parels.
   1. Label elke buis met gerichte monster ID. Pipetteer een 10 ul monster van serum of speeksel in de microcentrifugebuisje. Gebruik de pipet om het monster en magnetische korrels meng door herhaaldelijk pipetteren.
   2. Plaats de buizen met het monster en anti-humaan CD63 antilichaam kralen op rotator en roteer gedurende 2 uur bij KT. Gebruik dezelfde rotator parameters zoals beschreven in stap 1.2.
   3. Na 2 uur van het monster te draaien, het uitvoeren van een triple wassen door magnetiseren aparte kralen uit de oplossing, het verwijderen van de vloeibare fase met micropipet, en resuspenderen kralen in 500 pi van Tris-HCl-buffer. De resulterende kralen zijn nu gebonden aan de exosomen en zijn klaar voor het elektrische veld vrijlating en meting.

2. Elektrisch veld Induced Uitgebracht eennd Meting van exosomaal Content

1. Initiële voorcoating van elektrode met GADPH Primer
   1. Breng een plastic goed op een elektrode array om kruisbesmetting van de individuele elektroden te voorkomen. Voor dit experiment werd een 16-sensor elektrodenarray bij elke eenheid elektrode in de reeks bestaande uit een werkende, tegen en referentie-elektrode van kale goud.
   2. Bereid een voorraad mengsel van 100 nM DNA probe, 0,3 M KCl en 10 mM pyrrool pipetteren voorraad reagentia in een buis met ultrazuiver gedestilleerd water. Meng goed door vortexen.
      OPMERKING: Bij dit onderzoek werd de DNA probe gekozen overeenkomt met de GAPDH referentie gen, waarvan bekend is dat er in exosomes. De probe sequentie gebruikt: 5'-biotine-AGGTCCACCACTGACACGTTG-3 '. Met dit mengsel op de elektroden.
   3. Pipetteer 60 ul van de monomere DNA-probe mengsel op het oppervlak van elke goudelektrode. Onderzoek de elektroden om ervoor te zorgen dat er voldoende dekking van de arbeidersklasse, counter en referentie-elektroden door het vloeibare mengsel.
   4. Electropolymerize monomeer-probe mengsel een geleidende polymeerlaag op het elektrodeoppervlak creëren door een cyclisch blokgolf (CSW) elektrisch veld profiel naar het elektrodeoppervlak. Deze elektrische veld omvat de toepassing +350 mV 9 seconden en onmiddellijk omschakelen naar 950 mV gedurende 1 sec. Breng deze cyclische blokgolf profiel de elektrode 10 cycli in totaal 100 sec aangelegd elektrisch veld.
   5. Spoel sensoroppervlak 3 keer met gedestilleerd water en droog stikstofgas om vloeistof van het oppervlak van de elektrode te verwijderen. Zorg ervoor dat vloeistof goed is verwijderd uit de elektrode.
2. Exosome lading lossen
   1. Laad 5 gl 1 uM van een detector sonde in 495 ul van de hiel-Exosoom mengsel en gebruik een pipet te mengen.
      OPMERKING: De detector probe een DNA primer sequentie geconjugeerd met fluoresceïne molecuul aan het 3 'uiteinde. De detector probe sequentie die wordt gebruikt voor deze studie komt overeen met de GAPDH mRNA binnen exosomen. De sequentie van het fluoresceïne geconjugeerde detector probe: 5'-GCAGTGGGGACACGGAAGGCC-fluoresceïne-3 '.
   2. Pipetteer 60 ul van de probe en bead-Exosoom mengsel op een gouden elektrode oppervlak met een magneetreeks eronder. Deze magneet array bestaat uit zestien 2.54 mm neodymium magneten afgestemd overeenkomt met de elektrodes van de sensor. Figuur 2A illustreert de plaatsing van de magneten en bead-exosome oplossing.
   3. Eenmaal monster op het elektrodeoppervlak wordt geladen toepassen 20 cycli van het elektrisch veld CSW met 9 sec bij -300 mV en 1 s bij 200 mV (200 sec totaal). De exosomaal lading die vrijkomt zal hybridiseren met de primers op het oppervlak van de elektrode. Indien het oppervlak van markers van de exosome zijn onderwerp van onderzoek, sla dit gedeelte van het experiment. Figuur 2B illustreert dit proces.
   4. afspoelen ongebonden analyten op het elektrodeoppervlak door drievoudig spoelen het elektrodeoppervlak met gedestilleerd water. Droog de elektrode met stikstofgas.
3. Reporter antilichaam en uitlezing
   1. Voeg 60 ul van 150 eenheden / ml anti-fluoresceïne antilichaam geconjugeerd aan mierikswortel peroxidase (HRP in 1: 1000 verdunning) verdund in caseïne / PBS.
   2. Gebruik een elektrisch veld gedreven conjugatie complexe anti-fluoresceïne HRP aan de probe sandwich. Solliciteer -200 mV voor 1 sec en 500 mV voor 1 sec voor 5 cycli aan het oppervlak van de elektrode. Figuur 2A toont de vangst en de detector sonde complexen voor zowel een eiwit en nucleïnezuur systeem.
   3. Triple wassen sensor oppervlak met behulp van gedestilleerd water en droog met stikstofgas.
   4. Na het wassen-off van ongebonden overtollige anti-fluoresceïne antilichaam, voeg 60 ul van 3,3 ', 5,5'-Tetramethylbenzidine (TMB) substraat. Plaats dit substraat aan elke sensoroppervlak met een multichannel pipet.
   5. Voer amperometrische aflezing van de stroom door meting van de elektrode stroom bij -200 mV gedurende 60 sec met een elektrochemische potentiostaat geschikt voor het gelijktijdig meten van 16 kanalen. Figuur 2C is een voorbeeld van stroomprofiel tijdens uitlezing.

Figuur 2. Componenten van Efirm methode. (A) Werkwijze voor het extraheren van exosomes Biofluid behulp van anti-humaan CD63 beklede magnetische microdeeltjes en vervolgens lossen exosome lading van cyclische vierkante golven aangebracht op het deeltje-Exosoom. (B) Regeling van de elektrode biosensor gebruikt voor het opsporen van RNA / DNA / eiwit targets uit de vrijgegeven exosome. (C) Representatief voorbeeld van ampèrometrische uitlezing van de Efirm methodiek, waar grotere stroom magnitude komt overeen to hogere niveaus van een biomolecuul. Dit cijfer komt uit Wei et al. ¹⁴ Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Resultaten

Validatie van exosome Capture van Beads behulp TEM

Isolatie van exosomen uit speeksel behulp van anti-humaan CD63 magnetische parels werd gevalideerd na extractie protocol door transmissie elektronenmicroscopie (TEM) beelden. TEM toont magnetische korrels met 70-100 nm korrels onmiddellijk grenzend (zie figuur 3A en 3B), consistent met het bekende profiel van exosomes. Nr 70-100 nm granules werden waargenomen voor de magnetische kralen in sp...

Discussie

Als resultaat geven, anti-humaan CD63 beklede magnetische nanodeeltjes kunnen bijzonder kleine deeltjes die een grootte variërend 70-100 nm vangen. Deze gevangen deeltjes is in overeenstemming met de eerder waargenomen profiel van exosomes. Bovendien wordt het gebruik van de laagspannings-CSW na het vangen van de deeltjes aangetoond dat ze van de kraal oppervlak te verwijderen en veroorzaken DNA degradatie dat overeenstemt met dat van een traditionele lysisbuffer methode voor lading release. Deze gegevens duiden erop da...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Helios 16-Channel Reader System met Chip Interface	Genefluidics, USA	RS-1000-16
16x Sensor Chip, Bare Gold, pakket van 5 chips	Genefluidics, USA	SC1000-16X-B
Biotinyleerde anti-menselijke CD63 Antilichaam	Ancell, USA	215-030
Dynabeads MyOne Streptavidin T1	Invitrogen, USA	65601
Neodymium Magnetics (1/10" dia. x 1/32" dik)	K&J Magnetics, USA	DH101
Ultrazuiver Gedistilleerd Water	Life Technologies, USA	10977-023
Mettler Toledo 3 M KCl Oplossing	Fisher Scientific, USA	1911512
Pyrrole	Sigma-Aldrich, USA	W338605-100g
Anti-Fluoresceïne-POD, Fab fragmenten	Roche, Duitsland	11426346910
3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine substraat (TMB/H2O2, lage activiteit)	Neogen, USA	330175
Fosfaat Gebufferde Saline Oplossing	Life Technologies, USA	10010023
Caseïne/PBS	Fisher Scientific, USA	37532