Ontwikkeling van inhibitoren van eiwit-eiwit interacties door middel van VERVANGEN: Toepassing op het ontwerp en de ontwikkeling van niet-concurrerende ATP CDK-remmers

Summary

We beschrijven de implementatie van de REPLACE-strategie voor het targeten van eiwit-eiwitinteracties. REPLACE is een iteratieve strategie die synthetische en computationele benaderingen omvat voor de omzetting van geoptimaliseerde peptidische remmers in geneesmiddelachtige moleculen.

Abstract

REPLACE is een unieke strategie ontwikkeld om gerichter eiwit-eiwitinteracties (PPI). Het doel is om beschikbare drug doel ruimte uit te breiden door middel van een verbeterde methode voor het identificeren van remmers voor dergelijke bindingsplaatsen en die vormen de meerderheid van de potentiële drug targets. Het belangrijkste doel van deze paper is om een ​​methodologisch overzicht van het gebruik en de toepassing van de VERVANGEN strategie die computational en synthetische chemie benaderingen gaat bieden. REPLACE wordt geïllustreerd door middel van de toepassing ervan op de ontwikkeling van niet-competitieve ATP cycline afhankelijke kinasen (CDK) inhibitoren als anti-tumor therapieën. CDK's worden vaak gedereguleerd bij kanker en dus worden beschouwd als belangrijke doelen voor de ontwikkeling van geneesmiddelen. Remming van CDK2 / cycline A in S-fase is gerapporteerd selectieve apoptose van kankercellen in een p53-onafhankelijke wijze te verminderen door de E2F1 route. Gericht op de interactie eiwit-eiwit op het cycline binding groef (CBG) is een benadering die de specifieke remming van de celcyclus dan transcriptie CDKs zal toestaan. Het CBG wordt herkend door een consensus sequentie afgeleid van CDK substraten en tumor suppressor eiwitten aangeduid als de cycline bindingsmotief (CBM). De CBM eerder is geoptimaliseerd om een ​​octapeptide uit p21WAF (HAKRRIF) en dan verder ingekort tot een pentapeptide behoud van voldoende activiteit (RRLIF). Peptiden in het algemeen niet celpermeabel, metabolisch onstabiel en derhalve de REPLACE (gedeeltelijke vervanging Ligand Alternatieven tot Computational Enrichment) strategie om meer geneesmiddelachtige inhibitors genereren toegepast. De strategie begint met het ontwerp van het Fragment afgebonden remmende peptiden (salto) die selectief celcyclus CDK / cycline complexen remmen. Flips werden gegenereerd door het vervangen van residuen van iteratieve HAKRRLIF / RRLIF met fragment zoals kleine moleculen (kapgroepen) vanaf de N-terminus (Ncaps), gevolgd door vervanging vande C-terminus. Deze verbindingen zijn uitgangspunten voor het genereren van niet-competitieve ATP CDK inhibitoren als anti-tumor therapieën.

Introduction

In dit artikel wordt een case study van de toepassing van de REPLACE (vervangen met gedeeltelijke ligand alternatieven met behulp van computationele verrijking) strategie om peptidische remmers van eiwit-eiwit interacties te zetten in meer farmaceutisch relevante moleculen beschreven ^1-3. Terwijl PPI's vertegenwoordigen een rijke maar onderbenut bron van potentiële drug targets, bestaande methoden zijn grotendeels onvoldoende om deze op grote schaal toegankelijk te maken. De huidige strategieën waaronder fragment based design ^4, high-throughput screening ^{5 en} geniete peptiden ⁶ verstrekte voorschotten, maar deze zijn in veel gevallen niet effectief. Hierdoor meer vooruitgang en efficiëntere benadering vereist. REPLACE is volledig gevalideerd in de ontwikkeling van kinaseremmers die drug-achtige eigenschappen zijn verbeterd en hebben potentieel voor verdere ontwikkeling als anti-tumor therapieën. Deze strategie is geïllustreerd in de ontwikkeling van niet-ATP remmers celcycle CDKs en gaat als volgt: 1) het verkrijgen van 3D structurele gegevens over de interactie van HAKRRLIF / RRLIF het cycline bindende groef; 2) het bepalen van de belangrijke determinanten voor binding peptide interactie; 3) afknotting van het peptide N-terminus bevattende een of meer bindende determinanten; 4) computationele identificatie van potentiële kleine molecule alternatieven (gedeeltelijke ligand alternatieven, PLA) voor het afgeknotte deel van het peptide en die te behouden belangrijke interacties van de ouder peptide; 5) synthese of commerciële inkoop van Plas voorspeld te gretig te binden met de subsite eerder door de verwijderde peptide residu (s) bezet; 6) synthese van flips door middel van ligatie van de beste PLA om het afgeknotte peptide met vastefasesynthese; 7) het testen van klapt in een in vitro binding of functionele test (fluorescentie polarisatie in de CDK / cycline context) gevolgd door verdere karakterisering in cellevensvatbaarheid assay. Een schematische weergave van VERVANGEN strategy is weergegeven in figuur 1. In dit artikel worden iteraties van REPLACE strategie besproken en de toepassing CDK2 / cycline A beschreven. CDK's zouden direct of indirect gedereguleerd in de meeste tumoren en worden derhalve geacht passend kanker drug targets ^7. CDKs vereisen samenwerking met cyclinen voor volledige activering en vervolgens fosforyleren belangrijkste eiwitten die betrokken zijn bij de celcyclus regulatie ^8. De twee grote groepen van CDKs zijn de isotypen dat celcyclus controleposten controle [G1 / S (CDK4 / Cycline D, CDK6 / cycline D en CDK4 / cycline E), S-fase (CDK2 / cycline A) en G2 / M (CDK1 / cycline B)] en de toezichthouders van de RNA-polymerase door middel van fosforylering (cdk7 / cycline H, CDK8 / cycline C, CDK9 / cycline T). Een belangrijke stap in de S-fase progressie optreedt wanneer de transcriptiefactor E2F1 gecomplexeerd het DP-eiwit dat vervolgens bindt aan DNA en initieert gentranscriptie. CDK2 / cycline A is vereist om transcriptie te neutraliseren E2F1activiteit door middel van fosforylering hetgeen leidt tot loslaten van de E2F1-DP complex en de daaropvolgende degradatie. Remming van CDK2 / cycline A wordt aangenomen dat E2F1 in zijn DNA gebonden toestand leidt tot aanhoudende activatie handhaven. De resulterende mate van E2F-1 activiteit de drempel moeten p53 onafhankelijke apoptose induceert dus duidt op een therapeutische strategie overtreffen. Door gedereguleerd p53 en pRb pathways, hoge niveaus van E2F-1 regelmatig optreden in kankercellen en remming van CDK2 / cycline A moet leiden tot selectieve apoptose in tumoren en kan worden beschouwd als een gevalideerde kanker doelwit ^7.

Onderzocht CDK remmers klinisch richten de sterk geconserveerde ATP-bindingsplaats leidt tot de reactiviteit steken van de meer dan 500 eiwitkinasen in de menselijke kinome en mogelijk aanleiding geven tot effecten en toxiciteit ⁹ zijkant. Een alternatieve benadering is niet ATP-competitieve remming door zich te richten werving substraat door het CBGaanwezig op positieve regulerende cycline subunit en dat derhalve gescheiden en op afstand van ATP bindingsplaats ^10,11. Het CBG is vooral een hydrofoob groef aanwezig cycline A, cycline D en cycline E en blijkt een consensussequentie in substraten en tumor suppressors herkennen. Aangezien een geïsoleerd peptide, het cycline bindende motief (CBM) bindt aan het CBG en is aangetoond dat kinaseactiviteit van de celcyclus CDK's remmen. De CBM is geoptimaliseerd om een octapeptide (HAKRRLIF, CDK2 / cycline A _IC50 0,07 ± 0,02 uM, CDK4 / cycline D, IC ₅₀ 0,88 ± 0,34 uM) en voorts afgeknotte een pentapeptide die een goed compromis tussen moleculaire gewicht voor drugs- gelijkenis en potentie (RRLIF, CDK2 / cycline A IC ₅₀ 1,01 ± 0,17 uM, CDK4 / cycline D, IC ₅₀ 25.12 ± 2.97 uM) ^12,13. Het CBGS bestaat uit een grote primaire en secundaire kleinere hydrofobe pocket die worden overbrugd door een acidic regio (inclusief Glu220, Glu224 en Asp283). De belangrijkste bindingsdeterminanten van HAKRRLIF omvatten de interactie van Ala2 met additionele hydrofobe pocket, ionenparing en waterstofbindingen van Lys3, Arg 4 en Arg5 het zure gebied en een hoge mate van complementariteit van Leu6 en pHE8 de primaire lipofiele plaats. Bovendien worden talrijke waterstofbruggen bijdrage van het peptide hoofdketen terwijl Ile7 fungeert als afstandhouder residu zodat optimaal contact met de primaire zak. De bindingsmodus en interacties van HAKRRLIF met CBG is getoond in figuur 2.

Gericht op de CBM / CBG eiwit-eiwit interacties zullen kinaseactiviteit van CDK2 / cycline A, CDK2 / cycline E & CDK4 / cycline D te remmen en dit moet leiden E2F1 gemedieerde apoptose van kankercellen zonder dat afgeweken normale cellen ^7. Hoewel CBM afgeleide peptiden zijn effectieve remmers van celcyclus-CDK's, is het onwaarschijnlijk dat zij nuttig als geneesmiddelen zullen zijn vanwege hun metabolischeinstabiliteit en algemene gebrek aan celdoorlaatbaarheid. Daartoe hebben we de REPLACE strategie om deze potente peptidische remmers te zetten in meer drug-achtige verbindingen voor de verdere ontwikkeling van anti-tumor therapieën benutten gedereguleerd E2F1 tot CDK2 / cycline A inhibitie toegepast. Het volgende protocol vat werk dat bij de toepassing van REPLACE de cycline groove voltooid. In eerste instantie werden drug-like capping groep vervanging van het N-terminale tetrapeptide van HAKRRLIF geïdentificeerd. Bovendien werden verbeteringen in deze groepen onderzocht in een extra validatie studie voor te vervangen. Representatieve resultaten van deze studies worden gepresenteerd.

Protocol

1. Computational identificatie van potentiële Small Molecule Afdekken Groepen

Opmerking: in principe een grote docking of farmacofoor zoekmethoden worden gebruikt om potentiële capping groepen voorspellen. Het hoofddoel van computationele studie REPLACE is om kleine moleculen die de functies en interacties van de aminozuren die gesubstitueerd behouden te identificeren.

1. Validatie van de LigandFit docking protocol ¹⁴

Opmerking: In eerdere studies, de docking werkwijze (LigandFit ^15, een module in de moleculaire modeling programma suite, Discovery Studio 3,0) werd gevalideerd dat dit algoritme voldoende is om binding vormen van bekende Ncaps reproduceren en te tonen dat de resultaten verkregen voor onbekende verbindingen predictief ^14.

1. Met behulp van de volgende stappen (1,2-1,5), te identificeren optimale parameters voor LigandFit als volgt: PLP1 energy grid voor pose generatie, minimalisering van de gegenereerde poses en de PLP1 scoren functie voor de analyse van de poses.
2. Om de verkregen conformaties beperken en liganden passende positie voor de vorming van covalente binding in de afgedekte peptide, stel de indool- stikstof en de amide-stikstofatomen van Trp217 en Gln254 respectievelijk interactie filters voor waterstofbinding.
3. Ontwerp en de dock een bibliotheek van fragment alternatieven in de CDK2 / cycline A receptor (2UUE). Prioriteren potentiële aftopping groepen voor synthese en commerciële inkoop op basis van PLP1 scoren, interacties met interactie filters en complementariteit met het CBG. De verschillende stappen voor LigandFit docking zijn als volgt.

2. Bereiding van receptorbindingsplaats ¹⁴
   1. Importeer de CDK2 / cycline A kristalstructuur (pdb id: 2UUE) in een visualisatie venster in de software. Deze structuur bevat de eerder geïdentificeerde FLIP 5-methyl-1-fenyl-1H-1, 2,4-triazool-3-carboxamido (3,5-DCPT) RLIF gebonden aan cycline groef (figuur 3).
   2. Verwijderen of in de plaats van de resten RLIF (C-terminus) te houden. Wanneer de peptidesequentie wordt vastgehouden, met de N-terminale aminogroep van het peptide een interactie filter voor de ligand. Uit de "Receptor-ligand interacties" gereedschappen, het creëren van een sfeer rond de N-cap 3,5-DCPT van Show / Hide website bol. De bol is gemaakt om het actieve gebied in de bindingsplaats waar de ligand-receptor interacties mogen optreden tijdens binding te definiëren.
   3. Definieer de bindingsplaats verder van het "vinden plaats het volume van geselecteerde ligand" en verwijder het ligand 3,5- DCPT van het eiwit. Voer deze stap om het volume te binden binnen de bol gemaakt definiëren.
   4. Stel het indoolstikstofatoom en amide-stikstofatomen van de resten Trp217 en Gln254 de interactie filters voor waterstofbinding. Stel de interactie filters, zodat alleen de poses die interact met de atomen van de set residuen worden gefilterd tijdens het docking proces dan ook het behoud van belangrijke interacties in de aangemeerd poses.
3. Bereiding van liganden ¹⁴
   1. Ontwerp een bibliotheek van 100 mogelijke capping groepen op basis van criteria waaronder molecuulgewicht lager dan 500, de aanwezigheid van een carboxylaatgroep voor ligatie met het afgeknotte peptide en opnemen van geschikte hydrofobe groepen (gesubstitueerde fenylgroep) Van der Waals interactie in de secundaire zak als Tabel 1.
   2. Selecteer heterocyclische ringen voor het nabootsen van peptide waterstofbruggen interacties met Trp217 en substituenten inbegrepen voor het vervangen van ion-paring interacties van elementaire zijketens van de HAKRRLIF. Dok de liganden respectieve aldehyde moleculen zodat de carbonyl zuurstof kan communiceren met het amide stikstofatoom van Gln254 Soortgelijke peptideskelet in het ouder peptide (tabel 1).
   3. Voorafgaand aan dockoning, minimaliseren ontworpen liganden aan een lage energie conformatie en voor te bereiden op een geschikte ionisatie toestand met behulp van de "Bereid liganden" protocol. Tekenen en deze potentiële N-caps in de .sdf bestandsindeling ChemDraw voor een spreadsheet exporteren voorafgaand aan in de software worden geïmporteerd.
      Opmerking: Bereid liganden protocol wordt gebruikt om alle liganden te minimaliseren worden gedokt in de laagste energietoestanden en de ionisatie lasten werden toegepast op de toepasselijke atomen. Default parameters worden gebruikt voor deze stap.
4. Couperen van de liganden in de Cycline A Groove ¹⁴
   1. Selecteer de LigandFit routine van receptor-ligand interacties protocol set van de software. Gebruik de receptor en de liganden bereid als input voor dit protocol.
   2. Voor deze runs select PLP1 als energienet, aangeven dat vormt zijn energie tot een minimum beperkt en dat het aantal gegenereerde poses als 10. Laat alle andere parameters op de standaardwaarden.
      Opmerking: LigandFit isdocking methode die poses hoge complementariteit en mogelijke affiniteit kunnen identificeren en genereren de actieve plaats van een eiwit met een vorm gebaseerd vergelijking filter dat wordt gecombineerd met een Monte Carlo conformationele zoekalgoritme. De energienet gebruikt door het docking-programma is het krachtenveld voor het genereren van ligand-receptor interacties en mogelijke poses. PLP1 is stuksgewijs lineaire potentiaal specifiek prioriteit waterstofbruggen en waarbij het PLP atoom type wordt toegewezen voor elk niet-waterstof atoom of ligand niet- waterstofatomen receptor atoom.
5. Analyse van de resultaten
   1. In eerste instantie weergave stelt in de visualizer programma en vervolgens sorteren op dalende waarden van de PLP1 score. Gebruik scoring functies zoals PLP1 het schatten van de bindingsaffiniteit van een gekoppelde ligand op basis van een kandidaat ligand vormen geometrie en non-covalente interactie met het doelwit receptorstructuur.
      Let op: Hier werd de PLP1 scoring functie gevonden give de beste resultaten als deze een schatting van waterstofbinding.
   2. Analyseer visueel de top 25% van de ingesneden poses voor 1) superimposability de bekende capping groep (met een relatieve gemiddelde kwadratische afwijking (RMSD) waarde kleiner dan 2 A), 2) voldaan interactie filters en 3) visueel complementariteit met het cycline groef . Het is in dat aanvaard een correct gedokt vormen (in vergelijking met een experimentele structuur) heeft een RMSD waarde van <2 Å.
   3. Onderzoek poses voor visuele complementariteit die wordt begrensd efficiënte vulling van de bindingsplaats op een wijze die consistent is met bekende structuur-activiteitsrelaties. Interactie filters worden ingesteld atoom beperkingen die intermoleculaire contacten bekend kritisch voor het binden en / of nodig zijn om de potentiële capping groep positie in de juiste geometrie voor de vorming amidebinding worden gevraagd zijn. Drie voorbeelden van aangemeerd poses van de potentiële-N aftopping groepen die waterstofbruggen met interaction filters worden weergegeven in figuur 4.

2. Synthese en karakterisering van potentiële N -capping Groepen

1. Synthese van N-kapgroepen.
2. Synthese Gebruik alle commerciële uitgangsmaterialen, oplosmiddelen en reagentia verkregen. Synthesize potentiële N-kapgroepen met gebruikelijke synthetische organische chemie (figuur 5 ^12,13 voor een voorbeeld).
3. Voer dunnelaagchromatografie (TLC) op silicagel toezicht reacties.
   1. Los het uitgangsmateriaal en reactiemengsel (1 mg) in de mobiele fase en spot ze op de TLC-plaat door middel van capillaire buisjes.
   2. Plaats de DLC-plaat in de kamer die mobiele fase (ethylacetaat en hexaan in een verhouding 35:65). Zodra de mobiele fase 90% van de TLC-plaat bereikt, te verwijderen en de lucht drogen van de plaat.
   3. Met UV-licht om het uitgangsmateriaal en reactiemengsels detecteren zichtbare vlekken. Calkeningen de _Rf van alle plekken (verhouding van afgelegde afstand door de plek en de mobiele fase).
      Opmerking: De reactie is volledig wanneer er geen gebrek gezien bij de _Rf van het uitgangsmateriaal.
4. Na voltooiing van de reactie opgewerkt het reactiemengsel door in een scheidtrechter en gewassen met waterig zuur of base oplossing geschikt. Verzamel de organische oplosmiddel verdampen in rotatieverdamper droog en het ruwe product verkregen onder vacuüm.
5. Los 500 mg ruw product in 3-5 ml geschikt oplosmiddel en toevoegen van een 1 g silica of RP18 samplet en droog onder lucht. Plaats de samplet met het ruwe product in de silica / RP SNAP flash patronen en zuiveren van het ruwe materiaal met behulp van geautomatiseerde high performance flash-chromatografie (volgens het protocol van de fabrikant) gebruik van een SNAP 100 g kolom met een gradiënt run vanaf 6% ethylacetaat: 94 % hexanen tot 50% ethylacetaat en 50% hexaan in15 kolomvolumes.
6. Droog het gezuiverde product in oplosmiddel vanuit flashchromatografie met behulp van een rotatieverdamper verdampen van de oplosmiddelen tot droog en het product verder gedroogd onder vacuüm om alle resterende oplosmiddelen te verwijderen. Voer karakterisering van het gezuiverde product door NMR, MS en analytische HPLC.
   1. Voor ^1H NMR en ^13C NMR, weegt ongeveer 10 mg van het gezuiverde monster oplossen in een geschikt gedeutereerde oplosmiddel en breng de inhoud ervan een droge NMR-buis voor het opnemen van de NMR-spectra ^2,14.
   2. Noteer de ^1H NMR en ^13C NMR spectra met een hoog veld NMR Spectrometer (minimaal 300 MHz). Verwerven massaspectra met een QTOF (Tandem quadruple-1 time of flight massaspectrometer), elektrospray ionisatie (ESI) of een VG 70S (Double-focus sector massa magnetische spectrometer, EI) ^2,14.
   3. Analyseer de zuiverheid van producten door HPLC met een diode array detector en voorzieneen C18 (2) 100 A, 250 x 4,6 mm, 5 urn kolom voor analyse. Gebruik een gradiënt run vanaf 100% water (0,1% trifluorazijnzuur) tot 60% acetonitril (0,1% trifluorazijnzuur) meer dan 30 minuten en houd de gradiënt voor 4 min. Pak de chromatogrammen op 226 en 254 nm ^2,14.
      Opmerking: Analytische zuiverheden geëvalueerde verbindingen waren> 95%.

3. vastefasesynthese voor de opwekking van Flips ²

1. Synthese van N-bedekte Flips
   1. Assembleren N-bedekte peptide verbindingen via standaard vaste-fase synthese methoden met behulp van de volgende stappen.
      1. Activeren 5 equivalenten van het C-terminale aminozuur (Fmoc-Phe) in 4,4 equivalenten O -Benzotriazole- N, N, N ', N'-tetramethyl-uronium-hexafluor-fosfaat (HBTU, 221,93 mg) in 2 ml DMF gedurende 5 min. Laad de Fmoc-Phe HBTU mengsel op de Rink hars met 6 equivalenten van diisopropylethylamine (DIPEA, 103,13mg) gedurende 1 uur bij KT.
      2. Verwijder de Fmoc beschermende groep van het C-terminale rest met behulp 20% piperidine in 3 ml DMF gedurende 10 min. Paar daaropvolgende aminozuren (bijvoorbeeld Fmoc-Ile, Fmoc-Leu, Fmoc-Arg-PMC) stap voor stap. Bij elke stap 5 equiv partner van het volgende aminozuur behulp 6 equivalenten DIPEA (103,13 mg) en 4,4 equivalenten HBTU (221,93 mg) in 2 ml DMF gedurende 1 uur bij KT.
      3. Breng wascycli (5 x 10 ml DMF + 5 x 10 ml DCM) na aminozuur- koppeling en Fmoc ontscherming bovenbeschreven stappen. Na peptide montage paar N-kapgroepen behulp 6 equivalenten DIPEA (103,13 mg) en 4,4 equivalenten HBTU (221,93 mg) in 2 ml DMF gedurende 1 uur bij KT.
      4. Na voltooiing van assemblage peptide behandelen van het reactiemengsel met 2 ml van de splitsing mengsel (90: 5: 5 TFA / _H2O / TIPS) O / N om zijketens te verwijderen beschermende groepen en splitsen klapt uit de hars. Vermaal het verkregen product met koude diethylether om te precipiteren en if nodig concentraat in een roterende verdamper.
2. Synthese van N-bedekte-C-capped Flips
   1. Weeg en los het N-eindstandig afgedekte beschermde Arg-Leu peptide (16,1 mg, 0,02 mmol) in dichloormethaan en voeg [4- (3-chloorfenoxy) pyridin-2-yl] methaanamine (C-cap) met O - benzotriazole- N, N, N ', N' tetramethyluroniumhexafluorfosfaat (HBTU, 16,7 mg, 0,02 mmol) en N, N-diisopropylethylamine (DIPEA, 6,5 mg, 0,02 mmol).
   2. Roer en bewaken van de reactie bij kamertemperatuur totdat TLC / HPLC geeft het volledige verbruik van uitgangsmateriaal. Na voltooiing van de reactie geconcentreerd het ruwe reactiemengsel met een rotatieverdamper en verdeel tussen ethylacetaat en water.
   3. Scheid de waterige en de organische laag; Was de organische laag met 1 N NaOH, 1 N HCl en pekel. Droog de organische laag met ongeveer 1 g natriumsulfaat en concentreren het product rotatieverdamper. Finally behandel het product O / N bij de splitsing mengsel (95: 2,5: 2,5 trifluorazijnzuur / H ₂ O / TIPS) voor ontscherming.
   4. Vermaal het verkregen product met koude diethylether en eventueel concentraat rotatieverdamper drooggedampt voltooien om alle oplosmiddel te verwijderen. Verdere het product gedroogd onder vacuüm om alle resterende oplosmiddelen te verwijderen.
3. Zuivering en karakterisering van Flips
   1. Zuiver ruwe Flips met semi preparatieve reverse-fase HPLC methoden. Lyofiliseren het gezuiverde salto's en karakteriseren hun moleculaire massa met behulp van massaspectrometrie ^2,14.
   2. Bepaal de analytische zuiverheid van de flips door HPLC met een diode array detector en uitgerust met een C18 (2) 100 A, 250 x 4,6 mm, 5 urn kolom. Gebruik gradientmethode vanaf 95% _H2O (0,1% trifluorazijnzuur) / 5% acetonitril (0,1% trifluorazijnzuur) naar 35% _H2O (0,1% trifluorazijnzuur) / 65% acetonitril (0,1% trifluoroacetic zuur) meer dan 30 minuten en houd de gradiënt voor 4 min. Extract chromatogrammen bij 226 en 254 nm.

4. Fluorescentie Polarisatie bindingsbepaling voor het bepalen van competitieve binding ^2,14

1. Voer de test in zwart 384 putjes (138 ui) platen met de volgende procedure.
2. Verdun de monsters tracer peptides (4 nM), en kinasecomplexen (CDK2 / cycline A - 18 gg / ml, CDK4 / cycline D - 37 gg / ml) om de gewenste concentraties in testbuffer (25 mM HEPES pH 7, 10 mM NaCl, 0,01% Nonidet P-40, 1 mM dithiothreitol (DTT).
3. Aan elk putje van de 384-well plate, voeg 5 ul CDK4D1 of CDK2CA (0,3 ug / putje gezuiverd recombinant humaan kinase complex), 5 ui verbinding, oplossing, 5 ui 30 nM tracer peptide (fluoresceinyl-Ahx-Pro-Val Lys-Arg-Arg-Leu- (3ClPhe) -Gly of fluoresceinyl-Ahx-Pro-Val-Lys-Arg-Arg-Leu-Phe-Gly tracer peptide). Gebruik 5 pi van elke DMSO (6%), buffer, tracer en 5 gl DMSO (6%), kinase complex, als tracer controleputjes
4. Na de toevoeging van alle componenten, Centrifugeer de plaat bij 500 rpm gedurende 1 min (41,16 x g) bij kamertemperatuur en vervolgens incubeer de plaat met roeren gedurende 45 min bij kamertemperatuur. Met een multimode plaatlezer en detector voorzien van 485 nm / 535 nm excitatie / emissie filters en dichroïsche spiegel lezen van de fluorescentie-intensiteit van elk putje in de plaat.
5. Bereken het relatieve gemiddelde polarisatie (mp) van de monsters met behulp van de onderstaande vergelijking tonen. Bepaal IC ₅₀ waarden logaritmische regressie door het correleren relatieve mps en het testen van concentraties.

Results

De interacties van HAKRRLIF met cycline groef getoond in figuur 2. Het peptide resten die het belangrijkste bindingsdeterminanten vertegenwoordigen omvatten Ala2, Arg4, Leu6 en pHE8 met andere residuen leveren kleinere bijdragen ^12,13,18. In deze case REPLACE strategie is gebruikt om fragment alternatieven voor residuen in de N-terminale tetrapeptide van HAKRRLIF, vooral nabootsen van de interactie van Ala2 en Arg4 vinden. Een bibliotheek van potentiële NCAP fragmenten

Discussion

Targeting van eiwit-eiwitinteracties (PPI) bij medicijnontdekking is zeer uitdagend omdat deze doorgaans een groot, ondiep contactoppervlak omvatten dat bestaat uit talrijke en diffuse contacten¹⁹. Bovendien zijn peptidische verbindingen die PPI's remmen die geschikt zijn voor medicijnontdekking problematisch vanwege hun hogere molecuulgewicht, metabole instabiliteit en slechte biologische beschikbaarheid²⁰. Huidige strategieën die zijn toegepast voor de ontwikkeling van PPI-remmers omvatten het ont...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computational Chemistry
Accelyrs Discovery studio 3.0
Dell Optiplex Workstations
Synthetic Organic Chemistry
Silica gel (GF-254 platen) voor TLC, Biotage (Uppsala, Zweden) voor flitschromatografie, Waters Alliance 2695 HPLC met een 2996 diode-array detector en uitgerust met een C18 (2) 100 A, 250 x 4,6 mm, 5 μm kolom (Phenomenox Luna) voor zuiverheidsbepaling, 1H NMR en 13C NMR spectra werden opgenomen met een Varian Mercury 300 en 400 Spectrometer, respectievelijk. Massaspectra werden gemeten met een Micromass QTOF (Tandem quadruple-1 time of flight massaspectrometer), elektrospray ionisatie (ESI) en VG 70S (Dubbel gefocuste magnetische sector massaspectrometer, EI).
Fluorescentie Polarisatie Assay
384 micro well platen, Micro pipetten	Grenier Bio-one	110256602
CDK4D1 en CDK2CA (goed gezuiverde recombinante humane kinase complex)	BPS Bio Sciences	40094(CDK4/Cyclin D), 41101(CDK2/Cyclin A)
assay buffer (25 nM HEPES pH 7, 10 mM NaCl, 0,01% Nonidet P-40, 1 mM dithiothretiol (DTT))
25 nM HEPES	CALBIOCHEM	375368
NaCl	Fisher	127838
Nonidet P-40	US Biological	N3500
DTT	Aldrich
-70 °C vriezer	Revco (Ultima II)
DTX880 multimode detector uitgerust met 485 nm/535 nm excitatie/emissie filters en een dichroisch spiegel geschikt voor fluoresceïne	Beckman Coulter, Brea, CA
Celcultuur
96 well platen	Fisher
Bevroren voorraden van U2OS (osteosarcoom) en DU145 (prostaatkanker) cellijnen	ATCC
NU serum, DMEM media, trypsine, PEN/STRIP, MTT reagens	Fisher, Life Technology, Alfa Aesar
Heemocytometer	VWR
-70 °C vriezer	Revco (Ultima II)
Incubator	Thermo Electron Corporation
Centrifuge	Eppendorf	5804 R
Koelkast 4-8 °C	Isotemp Fisher
DTX880 multimode detector uitgerust met 595 nm filter	Beckman Coulter, Brea, CA