Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Synthese van Indoxyl-glycosiden voor detectie van Glycosidase Activiteiten

6.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52442

⸱

27 mei 2015

 , 
1Department of Chemistry, Faculty of Sciences, University of Hamburg

In dit artikel

Samenvatting

Indoxyl glycosides zijn goed gevestigde en veelgebruikte hulpmiddelen voor enzymscreening en het bewaken van enzymactiviteit. Vooral voor glucose-type structuren bleken eerdere syntheses uitdagend en met een lage opbrengst. Onze nieuwe aanpak gebruikt indoxylzuur esters als waardevolle tussenproducten om een aanzienlijk aantal indoxyl glycosides met een goede opbrengst te verkrijgen.

Samenvatting

Indoxyl glycosiden bleken waardevolle en veelzijdige hulpmiddelen te zijn voor het monitoren van glycosidase-activiteiten. Indoxylen worden vrijgegeven door enzymatische hydrolyse en worden snel geoxideerd, bijvoorbeeld door atmosferische zuurstof, tot indigo-kleurstoffen. Deze reactie maakt snelle en eenvoudige screening in vivo mogelijk zonder isolatie of zuivering van enzymen, evenals snelle tests op agarplaten of in oplossing (bijv. blue-white screening, micro-wells) en wordt gebruikt in biochemie, histochemie, bacteriologie en moleculaire biologie. Helaas bleek de synthese van dergelijke substraten moeilijk, vanwege verschillende nevenreacties en de lage reactiviteit van de indoxyl hydroxyl functie. Vooral voor glucose type structuren werden lage opbrengsten waargenomen. Onze nieuwe aanpak gebruikt indoxylzuur ester als sleutel tussenproducten. Indoxylzuur esters met gevarieerde substitutiepatronen werden bereid op schaalbare paden. Faseoverdracht glycosyleringen met die acceptoren en peracetyleerde glycosyl halogeniden kunnen onder gewone omstandigheden in hoge opbrengsten worden uitgevoerd. Ester splitsing en daaropvolgende milde zilver gemedieerde glycosylering levert de peracetyleerde indoxyl glycosiden in hoge opbrengsten op. Ten slotte wordt de deprotectie uitgevoerd volgens Zemplén.

Inleiding

Gedurende een lange periode was de productie van indigo een economisch zeer belangrijk proces. Voordat grootschalige chemische syntheses een goedkope toegang tot indigo boden, werden precursoren sinds voorchristelijke tijden uit natuurlijke bronnen verkregen. De teelt van indigo-producerende planten (natuurlijk indigo) in Europa werd in de 17e eeuw onrendabel, aangezien de hoeveelheid indigo-precursoren van de Indiase indigoplant (0,2-0,8 %) ongeveer 30 keer hoger is. Aan het einde van de 19e eeuw verving de chemische synthese van indigo de conventionele teelt1,2.

Indigo-precursoren die van nature in planten voorkomen, zijn onder meer Indican (1), Insatan A (2) en Isatan B (3) (Figuur 1). Al deze stoffen bestaan uit een indoxyl-motief gekoppeld aan een glycosylresidu. Splijting van de glycosidische binding, bijvoorbeeld door enzymatische hydrolyse, leidt tot de afgifte van indoxyl (4). Indoxyl zelf is vrijwel kleurloos, maar kan snel worden geoxideerd tot een indigokleurstof (5). Deze gevoelige reactie is in de biochemie, histochemie, bacteriologie en moleculaire biologie aangepast voor het monitoren van enzymactiviteiten. Activity screening in vivo zonder isolatie of zuivering van enzymen, evenals snelle tests op agarplaten of in oplossing (bijv. blauw-wit screening, micro-wells), is mogelijk. Afhankelijk van het residu (bijv. esters, glycosiden, sulfaten) dat aan de indoxylgroep is gekoppeld, zijn geschikte substraten voor verschillende enzymklassen (bijv. esterasen, glycosidasen, sulfatasen) ontwikkeld3. In het vervolg ligt de focus op de vorming en toepassing van indoxylglycosiden.

Diagram van het indicanhydrolyseproces met weergave van indoolderivaten en de vorming van indigokleurstof.
Figuur 1: Natuurlijke indigoprecursoren en vorming van indigokleurstof door hydrolyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Het substitutiepatroon van de indoxylgroep bepaalt de kleur en de fysische eigenschappen van de resulterende indigokleurstof. De meest voorkomende substitutiepatronen zijn 5-bromo-4-chloro (afgekort als X; groenblauw), 5-bromo (blauw) en 5-bromo-6-chloro (magenta), aangezien deze de kleinste kleurstofdeeltjes vormen, geen granulen vormen en de minste diffusie vertonen vanuit de plaatsen van hydrolyse. Deze laatste eigenschap is vooral belangrijk voor in vivo experimenten3.

Het eerste verslag van een indigogene methode voor de detectie van esterase-activiteit werd in 1951 gepubliceerd door Barrnett en Seligman, die indoxylacetaat en -butyraat gebruikten4. Ongeveer een decennium later werd het indigogene principe aangepast voor de lokalisatie van glucosidase bij zoogdieren5. Tot nu toe zijn verschillende indoxylglycosiden ontwikkeld, hoewel de synthese daarvan moeilijk bleek te zijn. De meeste syntheses zijn gebaseerd op het gebruik van een N-geacetyleerd indoxyl als acceptor en het respectievelijke glycosylhalide als donor6-14. Glycosylering wordt uitgevoerd in aceton met natriumhydroxide. Onder deze omstandigheden treden een aantal nevenreacties op, waardoor de opbrengst aanzienlijk afneemt. Vooral voor structuren van het glucosetype werden zeer lage glycosyleringsopbrengsten gerapporteerd (bijv. 15% voor (N-acetyl-5-bromo-4-chloro-indol-3-yl)-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-ᴅ-glucopyranoside6 en 26% voor (N-acetyl-5-bromo-4-chloro-indol-3-yl)-2,3,2',3',4'-penta-O-acetyl-β-ᴅ-xylobioside14 in een recenter voorbeeld). Via een nieuwe benadering, waarbij gebruik wordt gemaakt van indoxylzuuresters, is een aanzienlijk aantal indoxylglycosiden met goede opbrengsten geprepareerd (bijv. (N-acetyl-5-bromo-4-chloro-indol-3-yl)-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-ᴅ-glucopyranoside met een opbrengst van 57%).

Het volgende protocol beschrijft de eenvoudige synthese van indoxylozuur allylester (5-broom-4-chloor) en op basis daarvan de synthese van een indoxylglycoside (X-Gal). Een eenvoudig modeleexperiment toont de enzymactiviteit van β-galactosidase met gebruik van X-Gal.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Algemene opmerkingen:

Alle reacties werden uitgevoerd in een afzuigingskast en met geschikte beschermende kleding. Alle reagentia en oplosmiddelen (p.a.; watergehalte voor droge oplosmiddelen: MeCN <50 ppm; Et2O <0,01%; CH2Cl2 <0,003%; THF <0,005%) werden aangeschaft bij commerciële leveranciers en werden gebruikt zoals ontvangen. TLC werd uitgevoerd op Merck silica gel 60 F254 platen. Verbindingen werden gedetecteerd door UV en/of door behandeling met EtOH/H2SO4 (9:1) en vervolgens verwarmen. Kolomchromatografie werd uitgevoerd met Merck/Fluka silica gel 60 (230-400 mesh). Filtraties werden uitgevoerd met een Büchner-trechter en aspiratiepomp. Oplosmiddelen werden verwijderd met behulp van een rotatie-verdamper (40 °C, ~200 rpm). Producten werden gedroogd in hoog vacuüm (rotary vane pomp). Reacties die droge oplosmiddelen vereisen, werden uitgevoerd onder argonatmosfeer.

Hieronder wordt de synthese van X-Gal (16) beschreven met behulp van 5-bromo-4-chloro-indoxylic acid allyl ester (12). Voor verdere verbindingen met verschillende substitutiepatronen en methylesters die volgens deze synthetische sequentie zijn bereid, zie ref.17-19.

1. Acceptor: Synthese van 5-Bromo-4-Chloro-Indoxylic Acid Allyl Ester18 (12)

  1. N-Acetylering: Synthese van N-(4-bromo-3-chloro-2-methylfenyl)-acetaat (6)
    1. Los 10,0 g (45,7 mmol) van 4-bromo-3-chloro-2-methylaniline op in 30 ml dichloromethaan.
      Let op! Dichloromethaan is schadelijk en koel de oplossing in een ijsbad.
    2. Voeg 6,50 ml (68,7 mmol) azijnzuuranhydride druppelsgewijs toe en laat het mengsel opwarmen tot kamertemperatuur. Het mengsel kan 8 uur of overnacht worden geroerd. Let op! Azijnzuuranhydride is corrosief en ontvlambaar.
    3. Verwijder het oplosmiddel en kristalliseer opnieuw uit 9:1 ethylacetaat/methanol (opbrengst: 97% (11,6 g, 44,2 mmol), kleurloze vaste stof).
      Let op! Ethylacetaat is irriterend en ontvlambaar. Let op! Methanol is giftig en ontvlambaar.
  2. Oxidatie: Synthese van N-acetyl-5-bromo-6-chloro-anthranilzuur (7)
    1. Reflux een mengsel van 2,30 g (8,76 mmol) van 6 (het product verkregen uit stap 1.1) en 2,10 g (8,52 mmol) MgSO4·7H2O in 40 ml water in een 3-hals ronde bodemkolf uitgerust met koeler en druppeltrechter.
    2. Voeg druppelsgewijs 50 ml verzadigde KMnO4 oplossing in water toe aan het reactiemengsel gedurende een periode van 3 uur. Verwarm vervolgens nog 2 uur onder reflux, ca. 135 °C oliebad. Let op! Kaliumpermanganaat is schadelijk en oxiderend.
    3. Laat afkoelen tot kamertemperatuur en filter de pyroloosiet (MnO2), die tijdens de reactie is gevormd.
      Let op! Pyroloosiet is schadelijk.
    4. Voeg zoutzuur (37%) toe aan het filtraat tot pH 1, filter vervolgens het product en droog in vacuüm, (opbrengst: 70% (1,80 g, 6,15 mmol), kleurloze vaste stof).
      Let op! Zoutzuur is corrosief.
  3. Deacetylering: Synthese van 5-bromo-6-chloro-anthranilzuur (8)
    1. Los 3,90 g (13,3 mmol) van 7 (het product verkregen uit stap 1.2) op in 70 ml van 1 N waterige natriumhydroxideoplossing en verwarm gedurende 5 uur op ca. 100 °C (oliebaad).
      Let op! Natriumhydroxide is corrosief.
    2. Laat afkoelen tot kamertemperatuur en voeg zoutzuur (37%) toe tot pH 1, filter vervolgens het product met een Büchner-trechter en droog in vacuüm, (opbrengst: 88% (2,93 g, 11,7 mmol), kleurloze vaste stof).
  4. Anhydridevorming: Synthese van 5-bromo-6-chloro-isatoic anhydride (9)
    1. Suspendieer 8,17 g (32,6 mmol) van 8 (het product verkregen uit stap 1.3) in 33 ml droog acetonitrile.
      Let op! Acetonitrile is schadelijk en ontvlambaar.
    2. Roer op kamertemperatuur en voeg 5,3 ml en een oplossing van 3,22 g (10,8 mmol) triphosgeen in 18,5 ml droog dichloromethaan druppelsgewijs toe gedurende een periode van 30 minuten. Verhit vervolgens 3 uur bij 50 °C (oliebaad). Let op! Pyridine is schadelijk en ontvlambaar.
      Let op! Trifosgeen is giftig en kan fosgeen vrijgeven.
    3. Verwijder ongeveer 75% van het oplosmiddel en deactiveer de reactie door 100 ml gedestilleerd water toe te voegen en filter het product. Was met een kleine hoeveelheid koud dichloromethaan.
    4. Droog het product in vacuüm, (opbrengst: 88% (7,53 g, 27,2 mmol), kleurloze vaste stof).
  5. N-Alkylering: Synthese van 5-bromo-6-chloro-N-[(methoxycarbonyl)allyl]-isatoic anhydride (10)
    1. Los 25 g (90 mmol) van 9 (het product verkregen uit s

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De allereerste syntheses van indicane en 5-broom-indicane werden al in 1927 en 1929 gepubliceerd door Robertson15,16. Door gebruik te maken van indoxylozuurmethylester als acceptor werd de reactieve 2-positie geblokkeerd, waardoor nevenreacties gedeeltelijk werden onderdrukt. Glycosylering in aceton/natriumhydroxide, gevolgd door beschermgroepverwijdering en decarboxylering (160 °C, azijnzuuranhydride, 1 uur) en tot slot deacetylering, leverde indicane en 5-broom-indicane op. Op basis van dit concept hebben we...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Vanwege lage opbrengsten en beperkingen, vooral voor glucosetype structuren en complexere suikers, werd een nieuwe synthetische benadering voor indoxyl glycosiden ontwikkeld. Indoxylzuur esters bleken waardevolle tussenproducten te zijn en werden verkregen in een modulair, schaalbaar proces. Alle stappen leveren hoge opbrengsten op en vanwege goedkope uitgangsmaterialen en eenvoudige nabehandeling zijn syntheses in grammen mogelijk. Het voordeel van de allyl-ester benadering is het blokkeren van de reactieve 2-positie. H...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

De steun van dit werk door Glycom A/S, Kopenhagen, Denemarken, wordt met dank erkend.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AzijnzuuranhydrideGrüssing10298Corrosie, ontvlambaar
AcetonitrilSigma-Aldrich608-001-00-3Schadelijk, ontvlambaar
AllylalcoholAldrich453021Schadelijk, gevaarlijk voor het milieu
Amberlite IR-120 H+Fluka06428Irritativum
BroomazijnzuurMerck802260Corrosie, giftig, gevaarlijk voor het milieu
4-Broom-3-chloor-2-methylanilineABCRAB 171687Irritativum
DichloormethaanACROS326850010Schadelijk
Di-ethyletherGrüssing10274Schadelijk, zeer ontvlambaar
DimethylformamideACROS348430010Schadelijk, ontvlambaar
DimethylsulfoxideSigma-Aldrich41648
EthylacetaatSigma-Aldrich607-022-00-5Irritativum, ontvlambaar
Etheen-diamine-tetra-azijnzuurAppliChemA1103.0500Irritativum
β1,3-Galactosidase, recombinant, E. coliCalbiochem345795
ZoutzuurVWR20252.290Corrosie
MagnesiumsulfaathydraatMerck105885
MethanolACROS326950010Giftig, ontvlambaar
MorpholineJanssen Chimica15.868.57Corrosie, ontvlambaar
PetroleumetherAzelis111053Ontvlambaar, irriterend, gevaarlijk voor het milieu
KaliumcarbonaatGrüssing12005Corrosie
KaliumpermanganaatGrüssing12056Schadelijk, oxiderend
Kalium-tert-butoxideMerck804918Corrosie, ontvlambaar
PyridienSigma-Aldrich613-002-00-7Schadelijk, ontvlambaar
ZilveracetaatFluka85140Irritativum, gevaarlijk voor het milieu
NatriumbicarbonaatGrüssing12144Corrosie
NatriumhydrideMerck814552Corrosie, ontvlambaar
NatriumhydroxideRiedel-de HäenS181200Corrosie
NatriummethoxideMerck806538Corrosie, ontvlambaar
NatriumsulfaatGrüssing12175
Tetrabutylammonium-waterstofsulfaatLancaster5438Schadelijk
TetrahydrofuraanSigma-Aldrich87371Schadelijk, ontvlambaar
Tetrakis (trifenylfosfine)palladium(0)Sigma-Aldrich216666
TrifosgeenFluka15217Giftig
Tris (hydroxymethyl)aminomethaanhydrochlorideSigmaT-3253Irritativum

Referenties

  1. Clark, R. J. H., Cooksey, C. J., Daniels, M. A. M., Withnall, R. Indigo, Woad, and Tyrian Purple: Important Vat Dyes from Antique to the Present. Endeavour. 17, 191-199 (1993).
  2. Hunger, K. Industrial Dyes: Chemistry, Properties, Applications. , 1st, Weinheim. Wiley-VHC. (2003).
  3. Kiernan, J. A. Indigogenic Substrates for Detection and Localization of Enzymes. Biotechn. Histochem. 82, 73-103 (2007).
  4. Barnett, R. J., Seligman, A. M. Histochemical Demonstration of Esterases by Production of Indigo. Science. 114, 579-582 (1951).
  5. Pearson, B., Andrews, M., Grose, F. Histochemical Demonstration of Mammalian Glucosidase by Means of 3-(5-Bromoindolyl)-β-ᴅ-glucopyranoside. Exp. Biol. Med. 108, 619-623 (1961).
  6. Anderson, F. B., Leaback, D. H. Substrates for the Histochemical Localization of some Glycosidases. Tetrahedron. 12, 236-239 (1961).
  7. Van Dort, M. E., Lee, K. C., Hamilton, C. A., Rehemtulla, A., Ross, B. R. Radiosynthesis and Evaluation of 5-[125I]Iodoindolyl-3-yl-β-ᴅ-galactopyranoside ([125I]IBDG) as a β-Galactosidase Imaging Radioligand. Mol. Imaging. 7, 187-197 (2008).
  8. Yoshida, K., Iino, N., Koga, I. Syntheses of Halogen Substituted β-ᴅ-Glucuronides and Their Hydrolysis by Rabbit Liver β-Glucoronidase. Chem. Pharm. Bull. 32, 1759-1769 (1975).
  9. Horwitz, J. P., et al. Substrates for Cytochemical Demonstartion of Enzyme Activity I. Some Substituted 3-Indolyl-β-ᴅ-glycopyranosides. J. Med. Chem. 7, 574-575 (1964).
  10. Eschenfelder, V., Brossmer, R. 5-Bromo-indol-3-yl 5-Acetamido-3,5-dideoxy-α-ᴅ-glycero-ᴅ-galactononulopyranosidic Acid, a Novel Chromogenic Substrate for the Staining of Sialidase Activity. Glycoconjugate J. 4, 171-178 (1987).
  11. Fujii, I., Iwabuchi, Y., Teshima, T., Shiba, T., Kikuchi, M. X-Neu5Ac: A Novel Substrate for Chromogenic Assay of Neuraminidase Activity in Bacterial Expression Systems. Bioorg. Med. Chem. 1, 147-149 (1993).
  12. Berlin, W., Sauer, B. In situ Color Detection of α-ʟ-Arabinofuranisodase, a "No-Background" Reporter Gene, with 5-Bromo-3-indolyl-α-ʟ-arabinofuranoside. Anal. Biochem. 243, 171-175 (1996).
  13. Marmuse, L., et al. New Chromogenic Substrates for Feruloyl Esterases. Org. Biomol. Chem. 6, 1208-1214 (2008).
  14. Kaneko, S., Kiaoka, M., Kuno, A., Hayashi, K. Syntheses of 4-Methylumbelliferyl-β-ᴅ-Xylobioside and 5-Bromo-3-Indolyl-β-ᴅ-Xylobioside for Sensitive Detection of Xylanase Activity on Agar Plates. Biosci. Biotechnol. Biochem. 64, 741-745 (2000).
  15. Robertson, A. J. Syntheses of Glucosides. Part I. The Synthesis of Indican. Chem. Soc. , 1937-1943 (1927).
  16. Robertson, A., Waters, R. B. J. Synthese of Glucosides. Part VII. The Synthesis of 6-Bromoindican. Chem. Soc. , 2239-2243 (1929).
  17. Böttcher, S., Thiem, J. Indoxylic Acid Esters as Convenient Intermediates Towards Indoxyl Glycosides. Eur. J. Org. Chem. , 564-574 (2014).
  18. Böttcher, S., Hederos, M., Champion, E., Dékány, G., Thiem, J. Novel Efficient Routes to Indoxyl Glycosides for Monitoring Glycosidase Activities. Org. Lett. 15, 3766-3769 (2013).
  19. Böttcher, S., Thiem, J. Facile Preparation of Indoxyl- and Nitrophenyl Glycosides of Lactosamine and Isolactosamine. RSC Adv. 4, 10856-10861 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Glycosidasedetectiefasetransfer-glycosyleringzilver-gemedieerde glycosyleringZemplen-deacetyleringenzymactiviteitstestchromogeen substraatindigo-kleurstofvormingkoolhydraatsynthesepergeacetyleerde glycosiden
Synthese van Indoxyl-glycosiden voor detectie van Glycosidase Activiteiten
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.