Transposon Mediated Integratie van plasmide DNA in de subventriculaire zone van pasgeboren muizen om Novel Modellen van glioblastoma Genereer

Samenvatting

Hier beschrijven we een efficiënt en veelzijdig protocol om nieuwe glioblastoma (GBM) te induceren, monitoren en analyseren met behulp van transposon DNA dat in de ventrikels van neonatale muizen wordt geïnjecteerd. Cellen van de subventriculaire zone, die het plasmide opnemen, transformeren, prolifereren en genereren tumoren met histo-pathologische kenmerken van menselijk GBM.

Samenvatting

Er bestaat een dringende behoefte om de bijdrage van nieuwe genen aan de pathogenese en progressie van menselijke glioblastomen (GBM) te testen, de meest voorkomende primaire hersentumor bij volwassenen met een sombere prognose. Er komen snel nieuwe potentiële therapieën uit het laboratorium en deze vereisen systematische testen in experimentele modellen die de belangrijkste kenmerken van de menselijke ziekte nauwgezet reproduceren. Hierin beschrijven we in detail een methode om nieuwe modellen van GBM te induceren met transposon-gemedieerde integratie van plasmide-DNA in cellen van de subventriculaire zone van neonatale muizen. We presenteren een eenvoudige manier om nieuwe transposons te klonen die geschikt zijn voor genomische integratie met behulp van het Sleeping Beauty transposon systeem en illustreren hoe plasmide-opname en ziekteprogressie te volgen met behulp van bioluminescentie, histologie en immuno-histochemische analyse. We beschrijven ook een methode om nieuwe primaire GBM-cellijnen te creëren. Idealiter zal dit rapport de verdere verspreiding van het Sleeping Beauty transposon systeem onder hersentumoronderzoekers mogelijk maken, wat leidt tot een diepgaand begrip van GBM-pathogenese en progressie en tot het tijdig ontwerpen en testen van effectieve therapieën voor patiënten.

Inleiding

Glioblastoma multiforme (GBM) is de meest voorkomende (60%) primaire hersentumor bij volwassenen, met een mediane overleving van 15-21 maanden bij behandeling met chirurgie, radiotherapie en chemotherapie ^1. Nieuwe therapieën voor GBM zijn noodzakelijk. Experimentele therapieën vereisen testen in diermodellen waarin de meest opvallende kenmerken van de ziekte bij de mens adequaat reproduceren. Strategieën om GBM induceren in knaagdieren omvatten chemische mutagenese met alkylerende agentia, germline of somatische genetische veranderingen, of transplantatie met behulp glioomcellijnen ^2. De meest gebruikte modellen gebruiken implantatie van glioma cellijnen, hetzij orthotopically, in de hersenen of subcutaan met syngene cellen bij dieren met identieke genotype; of xenogene cellen, meestal humane GBM cellijnen, geïmplanteerd in immuun gecompromitteerde muizen ^3. Xenotransplantaties bieden vele voordelen voor de studie van intracraniële tumoren: gemak van reproduceerbaarheid, standardized groeicijfers, de tijd van de dood en tumorlokalisatie. Echter, deze modellen hebben beperkingen als gevolg van de kunstmatige, invasieve chirurgische benadering gebruikt voor implantaties en de beperkte mogelijkheid om histologische nauwkeurig te reproduceren beschikt kenmerk van de menselijke GBM (WHO graad IV): pseudo-pallisading necrose, nucleaire atypias, diffuse invasie, micro-vasculaire proliferatie en de vorming van glomeruloid vaatafwijkingen ^4-7. Inductie van GBM door het veranderen van het genoom van somatische cellen met oncogeen DNA, of met virale vectoren ^8-12, of transposon-gemedieerde integratie ^13, reproduceert beter de etiologie van menselijke ziekten en herhaalt histo-pathologische kenmerken van menselijke GBM.

Historisch, tumoren van het centrale zenuwstelsel zijn geclassificeerd op basis van de waargenomen cel van oorsprong, die werd waargenomen, zou een voorspellende factor voor overleving ¹⁴ zijn. GMB's worden ingedeeld in primaire en secundaire. Opkomende bewijs today wijst op de zeer heterogene karakter van de primaire glioblastoma ^15. Secundaire GBM (15%), het resultaat van maligne transformatie laagwaardige astrocytomen (WHO graad I) en anaplasic astrocytomen (WHO graad II), geassocieerd eerder optreden van de ziekte, betere prognose en een "proneural" patroon van genexpressie , terwijl primaire GBM (85%) een late onset, slechte prognose en gliacellen (klassiek), neurale of mesenchymale expressie patronen tonen. Of de patronen van genexpressie correleren met de reële cel van oorsprong van de tumor is nog actief onderzocht. Accumulerende gegevens blijkt dat de combinatie van genetische mutaties geassocieerd met GBMs predictief te overleven. Bijvoorbeeld, het verlies van heterozygocity (LOH) chromosomen 1p / 19q, IDH1 mutaties, PDGFRα versterkingen, in verband worden gebracht met secundaire GBMs, proneural expressie patroon en betere prognose, terwijl EGFR overexpressie, Notch en Sonic hedgehog pathway activering, Nf1 en PTEN verlies en mutaties van p53 zijn gecorreleerd met neurale, klassiek, of mesenchymale primaire GBM en slechtere prognose ^16,17. De komst van grootschalige sequentiebepalingsprojecten en de accumulatie van verschillende patiëntenmonsters voor het testen brengt een schat aan nieuwe informatie betreffende genetische mutaties en routes betrokken bij GBM pathogenese en progressie en de mogelijkheid van geïndividualiseerde geneeskunde, waar therapieën specifiek kunnen worden afgestemd de genetische afwijkingen van de patiënt. Uiteindelijk is de voorspellende waarde van deze mutaties en routes systematisch te evalueren en mogelijke behandelingen testen telkens vereist diermodellen van GBM met vooraf bepaalde genetische veranderingen. Transposon gemedieerde integratie van genomisch DNA biedt bruikbaar zijn.

The Sleeping Beauty transposon systeem, lid van de Tc1 / zeeman klasse van transposons, werd "wakker" (gebouwd) in een multi-step process van plaatsspecifieke mutagenese van een zalmachtige transposase gen, die slapende meer dan 10 miljoen jaar geleden werd ^18,19. In wezen DNA transposons geflankeerd door specifieke sequenties (omgekeerde herhalingen / directe herhalingen: IR / DR) kan door middel van de activiteit van Doornroosje transposase worden geïntegreerd in het genoom in een "knip en plak" wijze. Het transposase erkent de uiteinden van de IR sites accijns de transposon en integreert willekeurig in een andere DNA-plaats tussen de basen T en A, basen die worden gedupliceerd aan beide uiteinden van het transposon tijdens omzetting (figuur 1a). Doornroosje transposase bestaat uit drie domeinen, een transposon bindend domein, een nucleair lokalisatiesignaal sequentie en een katalytisch domein. Vier transposase moleculen dienen de twee uiteinden van de transposon samen te brengen en zorgen voor de omzetting echter, indien te veel moleculen transposase aanwezig zijn, kunnen ze dimeriseren en tetrameer te remmende omzetting reactie ^20. Een efficiënte omzetting reactie vereist een optimale verhouding van transposasegen om transposons. Het DNA dat codeert voor het transposase kan worden uitgebracht op hetzelfde plasmide met de transposon (CIS) of op een ander plasmide (trans). De optimale verhouding tussen het transposase en de transposons garanderen, kan een promoter met voldoende activiteit gekozen voor de expressie van het transposase (de "cis" model) of de verhouding van de plasmiden in de injectieoplossing kan worden geoptimaliseerd (de "trans" model). The Sleeping Beauty transposon systeem met succes kan worden gebruikt voor functionele genomica, insertiemutagenese, transgenese en somatische gentherapie ^21. Omdat het een synthetische constructie opnieuw ontworpen om een functionele molecuul van een slapende zalmachtige variant, doet de Sleeping Beauty transposase niet binden aan andere transposons in mensen of andere zoogdieren ^20. Sinds de ontdekking, moleculaire technieken heeft audiotoebed de omzetting werkzaamheid van het SB transposon systeem door veranderingen in het IR sequenties en toevoeging van TATA dinucleotiden flankeren de transposon, waardoor de pT2 transposons. Deze transposons hebben binding van de RvC geoptimaliseerd om de IR-website en de toegenomen effectiviteit van excisie. De SB transposase onderging ook een significante verbetering; het transposase gebruikt in experimenten die hierin is SB100X een hyperactief transposase gegenereerd door DNA shuffling strategie gevolgd door een grote genetische screen in zoogdiercellen ^22.

In dit rapport presenteren we een snelle, veelzijdige en reproduceerbare methode intrinsieke GBM induceren in muizen met niet-virale, transposon-gemedieerde integratie van plasmide-DNA in cellen van de sub- ventriculaire zone van neonatale muizen ^23. We presenteren een eenvoudige manier om transposons met nieuwe genen vatbaar voor genomische integratie met behulp van de Schone Slaapster transposase maken en demonstreren hoe plasmide opname te controleren enprogressie van de ziekte met behulp van bioluminescentie. We hebben ook karakteriseren histologische en immuno-histochemische kenmerken van de GBM gereproduceerd met dit model. Bovendien presenteren we een snelle methode om primaire GBM cellijnen van deze tumoren genereren. Doornroosje model, waarin tumoren worden geïnduceerd uit cellen origineel aan het dier, kan de functionele beoordeling van de rol van GBM kandidaat genen in de inductie en progressie van tumoren. Dit systeem is ook goed geschikt voor het testen van nieuwe GBM behandelingen, waaronder immune therapieën in immunocompetente muizen, zonder de noodzaak van invasieve inflammatoire chirurgische procedures, waarbij de lokale micro-omgeving kunnen veranderen.

Protocol

OPMERKING: Alle dieren protocollen zijn door de Universiteit van Michigan Comité voor het gebruik en onderhoud van Dieren (UCUCA) goedgekeurd.

1. Klonen van de sequentie van belang in New Doornroosje Transposons

OPMERKING: Om genen of remmende elementen (zoals shRNA) met behulp van de Schone Slaapster transposase systeem plaatst, klonen de sequentie van belang in de ruggengraat van een pkT of pT2 plasmide. Richt de klonering zodanig dat de regulerende elementen betrokken gen en markers blijven geflankeerd door omgekeerde herhalingen (IR / DR). Een voorbeeld van het klonen PDGFβ in een pkT backbone wordt hieronder beschreven (zie ook figuur 1b).

1. Digest 5 ug plasmide vector pkT-IRES-Katushka gedurende 4 uur bij 37 ° C met 5-10 eenheden Xbal / Xhol restrictie-enzymen in 50 pl reactievolume.
2. Digest de mPDGFβ cDNA van 5 pg van de pGEM-T mPDGFβ plasmide gedurende 4 uur bij 37 ° C met 5-10 units van NcoI / SacI-restrictie-enzymen.
3. Neerslag het totale DNA door toevoeging van 2,5 volumes 100% ethanol en 1/10 volume 3 M Na-acetaat, pH 5,8 en incubeer overnacht bij -20 ° C.
4. Centrifugeer de monsters bij 13.800 xg gedurende 15 min.
5. Was de DNA-pellet met 500 ul van 70% ethanol, centrifuge bij 13.800 xg gedurende 1 min, herhaal eens en opnieuw op te schorten in 19 ul van steriel DNase-vrij water.
6. Volg de instructies van de fabrikant in de Quick Blunting Kit aan de uiteinden van beide vector (pkT-IRES-Katushka) stomp en plaats (mPDGFβ).
7. Laad de afgestompte vector en de insert op een 1,2% ethidiumbromide gekleurde agarosegel en draaien op 80 V gedurende 40 min. Visualiseer de bands, accijnzen ze met een schone scheermesje en gel zuiveren het DNA met behulp van een gel zuiverend kit volgens protocol van de fabrikant.
8. Afbinden het insert en vector-DNA gezuiverd in stap 1.7 op te tellen in een buis in een 4: 1 molverhouding (insertie: vector). In deze buis, pipette 1 ui T4 ligase en 2 ui T4 ligase buffer (bevattende ATP), en het volume tot 20 pi met steriel water passen. Incubeer de ligatiereactie gedurende 18 uur bij 16 ° C.
9. Transformeren chemisch competente DH5a bacteriële cellen met de geligeerde producten.
   1. Ontdooi de competente cellen op ijs.
   2. Voeg het gehele volume van de ligatiereactie van 50 gl competente cellen, schud de buis en incubeer het mengsel op ijs gedurende 30 min. Heat-shock de bacteriën gedurende 45 seconden bij 42 ° C en onmiddellijk naar ijs; incuberen op ijs voor nog eens 2 min.
   3. Voeg 950 ul van Luria Broth de cultuur en incubeer onder schudden bij 37 ° C gedurende 1 uur. Centrifugeer kiemen bij 2400 xg gedurende 3 min en resuspendeer de pellet in 200 ui LB.
   4. Spreid de getransformeerde bacteriën op een petrischaal bekleed met LB-agarose en de overeenkomstige antibioticum. Incubeer de plaat overnacht bij 37 ° C.
   5. Tot slot, het verzamelen van 5-10 bacte-rial kolonies en kweek overnacht bij 37 ° C in 5 ml LB medium met antibioticum.
   6. Zuiver plasmide-DNA met een plasmide-DNA mini kit volgens instructies van de fabrikant. Voer een diagnostische restrictiedigestie de goede opname van het inzetstuk in de vector controleren en legt positieve klonen voor DNA sequencing voor de juiste oriëntatie van de insert te garanderen.
10. Selecteer de juiste koloniën en opschalen van het DNA productie met behulp van een hoge kwaliteit, endotoxinevrij plasmide voorbereiding kit.
11. Elueer het DNA in steriel water of 1 mM Tris-HCl. Winkel DNA bij -20 ° C tot klaar om te injecteren in neonaten.

2. Intra-ventriculaire Neonatale Injecties

1. Drie tot vier weken voorafgaand aan het experimenteren, het opzetten van een muis fokken kooi met een mannelijke en een vrouwelijke muis, en een plastic gekleurde iglo. Dit zorgt voor een verrijkte omgeving en helpt de paring proces.
2. Als zwangerschap wordt bevestigd, verwijdert u de male een nieuwe kooi. Achttien dagen na de paring, bewaken kooi elke dag voor levering. Voeren intraventriculaire injecties op postnatale dag 1 (P1).
3. Bereiding van de injectieoplossing
   OPMERKING: De injectie oplossing wordt bereid door het mengen van het plasmide DNA met transfectie reagens om de deeltjes voor transfectie creëren. Hieronder is een voorbeeld over de voorbereiding van een injectie-oplossing met behulp van een plasmide dat codeert voor het Sleeping Beauty transposase en luciferase: pT2 / SB100x-Luc en twee transposon plasmiden: PT / CAGGS-NRASV12 en Pt / CMV-SV40-LGT, in een verhouding van 1: 2: 2. Alle plasmiden hebben een concentratie van 2 ug / ul. Belangrijke details over de bereiding van de oplossing voor injectie worden gepresenteerd in de discussie.
   1. Bereid de DNA-oplossing door het toevoegen van: 4 pg (2 pl) van pT2 / SB100x-Luc, 8 ug (4 pl) van PT / CAGGS-NRASV12 en 8 ug (4 pl) van PT / CMV-SV40-LGT en 10 pl 10% glucose tot een eindvolume van 20 pi bij een concentratie van 1 ug / mlDNA en 5% glucose.
   2. Bereid de PEI door toevoeging van 2,8 pl in vivo jet PEI, 7.2 pl steriel water en 10 ui 10% glucose tot een uiteindelijke concentratie van 5% glucose.
   3. Voeg de PEI oplossing van de DNA-oplossing, mengen en vortex en laat op kamertemperatuur (RT) gedurende 20 min. De oplossing is klaar voor injectie. Na een uur bij KT, houd de oplossing op het ijs.
   4. Monteer een 10 ul schone spuit uitgerust met een 30 gauge injectienaald met 12,5 ° schuine in de micropomp (Figuur 2 # 1).
4. Voor een goede werking van het injectiesysteem controleren, de automatische injector (figuur 2 # 1) tot 10 pl water terugtrekken in de spuit en vervolgens volledig legen injectiespuit
5. Koel de neonatale stereotactische fase (figuur 2 # 3) met een suspensie van droog ijs en alcohol tot een temperatuur van 2-8 ° C.
6. Induceren anesthesie door het plaatsen van de pups op nat ijsgedurende 2 min. Anesthesie zal verder op de gekoelde stereotaxisch frame voor de rest van de procedure. De temperatuur van het frame boven het vriespunt tussen 2-8 ° C voorkomt thermische brandwonden. Zoals speciale voorzorg pups kan worden verpakt in gaas voordat het op nat ijs.
7. Vul de spuit met de DNA / PEI-oplossing.
8. Immobiliseren de pup in de stereotaxisch frame door het plaatsen van haar hoofd tussen het gaas bedekt oor bars (figuur 2b). Zorg ervoor dat de dorsale zijde van de schedel horizontale, evenwijdig aan het oppervlak van het frame en dat de craniale hechtingen zijn duidelijk zichtbaar. Veeg het hoofd met 70% ethanol.
9. Zet de naald van de spuit en pas stereotaxisch coördinaten met behulp van wijzerplaten van de stereotaxisch frame totdat de naald raakt de lambda (de middellijn kruising van de pariëtale en occipitale botten) (figuur 2b).
10. Til de naald en stereotaxisch coördinaten aan te passen tot 0,8 mm lateraal en 1,5 mm rostraal van de lambda (figuur 2b).
11. Zet de naald omlaag totdat het in aanraking komt en iets kuiltjes van de huid. Meet de coördinaten. Zet de naald nog eens 1,5 mm. De naald zal de huid en de schedel te doorboren, en passeren de cortex aan de laterale ventrikel (figuur 2c) in te voeren.
12. De automatische injector, injecteren 0.75 gl van het DNA / PEI oplossing bij een snelheid van 0,5 ul / min
13. Houd de pup op het frame nog een minuut om de oplossing te dispergeren in de ventrikels. Ondertussen verdoven een jong, op ijs gedurende 2 minuten in voorbereiding voor de volgende injectie.
14. Voorzichtig en langzaam til de naald, en plaats de pup onder een warmtelamp. Controleer ademhaling en activiteit. Indien nodig, zachte stimulatie van de ledematen tot de eerste ademhaling volgt.
15. Zet de pup naar zijn moeder nadat het is opgewarmd, heeft een roze kleur bereikt, wordt ademhaling regelmatig en actief is, normaal gesproken 5-7 min. Als more dan één pup geïnjecteerd tegelijk houd alle pups elkaar totdat alle injecties gedaan. Als injecties langer dan 30 min, halfdoorlatende van de pups na de eerste 30 minuten en de rest aan het einde van de procedure.
16. Toezicht op dat de dam is responsief en verzorgende aan haar pups. Voeg eventueel een surrogaat moeder naar de kooi.
17. Zorg ervoor dat het interval tussen het plaatsen van de pup op ijs en het onder de opwarming licht minder dan 10 min. Hoe sneller de procedure hoe beter de overlevingskansen. Meestal is de tijd die het kost om te verdoven en te injecteren een pup is 4 min.

3. Bioluminescence Monitoring van tumorvorming en Progression

3.1) Monitoring Plasmid Opname na injectie

1. 24-72 uur na de injectie, verwijder alle pups van de kooi en de plaats van de moeder in een 6 goed schoon weefselkweek schotel, één jong per putje.
2. Bereid een 30 mg / ml oplossing van luciferine, opgelost in normale zoutoplossing of Phosphate buffer. Bereid deze oplossing op voorhand en in kleine porties bewaren bij -20 ° C.
3. Met behulp van een 1 ml spuit uitgerust met een 30 gauge injectienaald injecteren 30 pi van luciferin subcutaan tussen de schouderbladen van de pup. Zorg ervoor dat de naald niet doorboren alle organen, door knijpen van de huid en het opheffen van het iets vóór het inbrengen van de naald.
4. Afbeelding onmiddellijk met een in vivo bioluminescentie systeem. Voor de IVIS Spectrum, gebruikt u de volgende instellingen voor acquisities: automatische belichting, grote binning, en diafragma f = 1.

3.2) Monitoring tumorvorming en Progression

OPMERKING: Animals start vormen macroscopische tumoren gedetecteerd door bioluminescentie en histologie binnen 2½-6 weken, afhankelijk van de oncogene plasmiden geïnjecteerd.

1. Met behulp van een 1 ml injectiespuit met een 26 gauge naald Injecteer 100 ui van een 30 mg / ml oplossing luciferine intraperitoneaal.
2. Plaats het dier in de anesthesie kamer. Injecteer maximaal vijf dieren tegelijk.
3. Wacht 5 min start vervolgens de zuurstof / isofluraan stroom (1.5-2.5% isofluraan) om de dieren te verdoven. Na 3-4 minuten, verwijder de dieren uit de narcose kamer, start de zuurstof / isofluraan stroming in de bioluminescentie kamer. Plaats de dieren in de respectieve sleuven met glas- neus kegels om voor anesthesie en onbelemmerde doorgang van licht.
4. Typisch, het verwerven van een serie van 6 beelden, op 2 min intervallen met een automatische belichtingstijd, mediaan binning en een open diafragma van f = 1.
5. Stel het van belang zijnde voor alle dieren afgebeeld, typisch een ovale over het kopgebied, en meet de luminescentie-intensiteit met de gekalibreerde eenheden fotonen / s / ^cm2 / sr.
6. Noteer de maximale waarde voor elk dier. Vervolgens kan opnamen worden vergeleken tijdens de progressie van de tumor per dier en / of tussen dieren, bijvoorbeeld when verschillende behandelingen worden toegepast.

4. histologische en immunohistochemische analyse van New GBMs

OPMERKING: Wanneer de tumoren de gewenste experimentele tijd-punt hebben bereikt, kunnen de dieren worden opgeofferd, hersenen doorbloed, vaste en geanalyseerd. Om te overleven analyseert de zieltogende stadium vertegenwoordigt het eindpunt van het experiment, wanneer de dieren op humane wijze worden gedood op de eerste tekenen van de tumor last, zoals gedefinieerd door de klinische fase wanneer het dier symptomatisch tonen verminderde mobiliteit, gebogen houding en smerig bont. Een korte beschrijving van standaard histologische en immuno-histochemische methoden wordt hieronder weergegeven.

4.1) perfusie en Fixatie

1. Verdoven de muis met een intraperitoneale injectie van 100 mg / kg ketamine en 10 mg / kg xylazine.
2. Controleer het pedaal reflex door knijpen de voet van de muis. Wanneer deze reflex wordt afgeschaft, wat aangeeft diepe narcose, immobilize de muis op een dissectie bord met pinnen, opent de buikholte, ontleden het middenrif en openen van de borstholte naar het hart te visualiseren.
3. Plaats een stompe 20 gauge canule in de linker ventrikel van het hart. Sluit de canule plastic buis die door een peristaltische pomp naar een houder met zuurstof en gehepariniseerde Tyrode's oplossing (0.8% NaCl, 0,0264% _CaCl2 2H ₂ O, 0,005% NaH _{2PO 4,} 0,1% glucose, 0,1% _NaHCO3, 0.02 % KCl). Start de stroom van Tyrode's oplossing door aanpassing van de snelheid van de peristaltische pomp zodat een langzame en constante stroom, ongeveer een druppel per seconde of minder als de dieren kleiner.
4. Maak een kleine incisie in het rechter atrium van het hart om de afvoer van bloed en Tyrode mogelijk.
5. Monitor perfusie efficiëntie door het observeren blancheren van inwendige organen (het duidelijkst in de lever en nier) naarmate zij zonder bloed.
6. Wanneer deoplossing drainage van het hart is duidelijk (3-5 min), schakelt de oplossingen van Tyrode tot 4% paraformaldehyde fixatie (4% PFA, pH 7,34 in met fosfaat gebufferde zoutoplossing).
7. Monitor goede fixatie van het weefsel met de verhoogde stijfheid van de nek en de staart.
8. Onthoofden met de muis en zorgvuldig ontleden de hersenen uit de schedel.
   1. Trek de vacht, die de schedel rostraal bestrijkt, naar de neus, en pak deze stevig op het hoofd, dorsale zijde naar boven te stabiliseren.
   2. Met behulp van een scherpe scalpel, naar beneden te snijden langs de rand van de baan, om de orbitale spieren en de onderliggende jukbeenderen doorsnijden.
   3. Draai het hoofd ventrale zijde naar boven en verwijder bevestigd nekspieren met behulp van een rongeur. Plet de eerste wervel en verwijder deze uit de hersenstam.
   4. Visualiseer het slakkenhuis, pak de bovenliggende slaapbeen met de rongeur en maak een opening tussen de temporale en occipitale bot. Schil van de occipitale bot van het oppervlak van het cerebellum.
   5. Crush het bot bovenop de neus met de rongeur. Verwijder voorzichtig de resterende frontale en pariëtale botten van het oppervlak van de hersenen als ik gedenk het oppervlak van de hersenen niet te beschadigen. Bijzondere aandacht besteden aan de orbitale gebied.
   6. Draai het hoofd ventrale zijde naar boven. De hersenen beneden glijden van de rest van de schedel, nu verbonden uitsluitend via de craniale zenuwen. Met behulp van kleine schaar knippen de geur, de optische en trigeminus zenuwen. Dit zal de hersenen vrijgeven.
9. Plaats hersenen in 4% PFA overnacht bij 4 ° C voor post-fixatie.
10. Voor histologische analyse en hematoxyline- eosinekleuring, overdracht van de hersenen om fosfaatbuffer gedurende 24 uur en vervolgens overgaan tot inbedden in paraffine.
11. Voor immuno-histologische analyse overbrengen hersenen in 30% sucrose-oplossing in met fosfaat gebufferde zoutoplossing gedurende 24-48 uur (tot de hersenen naar de bodem van de buis)
12. Sectie hersenen in de helft door het midden van de tumor regio, plaats de cutkant naar beneden in een bevriezing mal, insluiten in cryo inbedding media (oktober verbinding), en flash-vries in een brij van droogijs-ethanol, droogijs isopentaan of in vloeibare stikstof. Houd bevroren blokken bij -80 ° C tot het snijden en vlekken.

4.2) Hematoxyline-eosinekleuring van paraffine ingebedde Brains voor Histo-pathologische analyse van Intrinsieke GBMs

1. Sectie paraffine ingebedde hersenen op 4 micrometer dik, te laten vallen in een 42 ° C waterbad en monteren op glasplaatjes.
2. De-paraffinize dia door ze gedurende 10 minuten in een 60 ° C oven en vervolgens over te dragen op 5 minuten intervallen door een reeks van drie slide containers gevuld met xyleen.
3. Hydrateren glijdt door een reeks van ethanol baden 100% ethanol gedurende 2 minuten, eenmaal herhalen, 95% ethanol gedurende 2 minuten, eenmaal herhalen, 70% ethanol gedurende 2 minuten en vervolgens overbrengen slides water.
4. Vlekken op de dia's door ze onder te dompelen in een dia container gevuld met Harris Hematoxyline gedurende 2 minuten.
5. Spoelen met leidingwater tot het water helder is.
6. Dip schuift twee keer in blauwen-oplossing (0,1% natriumbicarbonaat).
7. Laat dia's staan ​​in leidingwater gedurende 2 minuten, vervolgens transfer naar 80% ethanol gedurende 2 minuten.
8. Vlekken op de objectglaasjes door ze onder te dompelen in een bak met Eosine gedurende 5 min.
9. Dehydrateer glaasjes in een reeks van ethanol baden (80% ethanol 04/03 dips, 95% ethanol 2 min, eenmaal herhalen, 100% ethanol 2 min, eenmaal herhaald).
10. Duidelijk met 3 opeenvolgende baden van xyleen, 3 min elk.
11. Dekglaasje met een-xyleen op basis van montage medium en laat drogen op een vlakke ondergrond bij kamertemperatuur tot klaar voor de beeldvorming. Bewaren bij kamertemperatuur.

4.3) Immuno-histochemie van Cryo-bewaarde Embedded Brains voor Moleculaire en Cellulaire karakterisering van De Novo Induced GBMs

1. Ophalen bevroren blokken van de -80 ° C bewaren, te plaatsen in cryostaat en laat de temperatuur in evenwicht gedurende 30 min.
2. Sectie 12-14 Pm dikke secties en monteren 2-3 secties op positief geladen glasplaatjes. Snijd secties serieel, door het verzamelen van aangrenzende secties op verschillende dia's. Hierdoor kan de kleuring met verschillende antilichamen op aangrenzende weefselsecties in de tumor.
3. Droge objectglaasjes in een exsiccator gedurende ten minste 1 uur na het snijden te zorgen voor een goede hechting van het weefsel.
4. Maak een hydrofobe barrière (met een hydrofobe marker) aan elk uiteinde van de schuif om voor vloeistof om de secties te dekken en te verblijven op de dia tijdens de wasbeurten. Bedek de secties met een oplossing van fosfaat gebufferde zoutoplossing met 0,1% Triton-X (PBS 0,1% Tx) en schud gedurende 5 min op een horizontaal schudapparaat om het weefsel doorlaatbaar. Tweemaal herhalen.
5. Blokkeer niet-specifieke binding met een oplossing van 10% normaal geit serum (of serum van het dier waarbij het secundaire antilichaam werd opgewekt) gedurende 30 minuten onder zacht schudden
6. Bereid primaire antilichaam opgelost in 2% normaal geit serum in PBS 0,1%Tx en pipet de oplossing over de secties. Plaats objectglaasjes in een vochtige kamer bedekt in het donker en laten kamertemperatuur.
7. De volgende dag was secties driemaal gedurende 5 minuten met PBS 0,1% Tx en incubeer fluorescerende secundair antilichaam verdund in 2% normaal geit serum PBS 0,1% Tx van één uur.
8. Was secties drie keer voor 5 min met PBS 0,1% Tx, tegenkleuring met een nucleaire kleurstof (bv, DAPI) gedurende 2 minuten, was eens te meer duidelijk in het water en dekglaasje met een op water gebaseerde montage medium dat de fluorescentie zal behouden. Plaats objectglaasjes op een vlakke ondergrond en laten uitharden ten minste 24 uur in het donker, tot klaar voor beeldvorming. Bewaar bij 4 ° C daarna.

5. Generatie van de primaire tumor cellijnen met specifieke genetische veranderingen.

1. Om cellijnen te genereren uit Sleeping Beauty-muizen met een tumor selecteer een muis met bevestigde grote tumor (bioluminescentie 10 ⁷ -10 ⁸ fotonen / s / cm2 / sr).
2. Euthanaseren de muis met een overdosis van isofluraan anesthesie, onthoofden het dier en zorgvuldig ontleden de hersenen uit de schedel (zoals beschreven in hoofdstuk 4). Plaats de hersenen in een schone petrischaal.
3. Met behulp van een scheermesje, maak coronale sneden anterior en posterior aan de tumor. De locatie van de tumor gewoonlijk herkenbaar aan de transparantie van de hersenen.
4. Ontleden van de tumor, meestal 5-7 mm in diameter met fijn pincet en plaats in een 1,5 ml buis gevuld met 300 ul neurale stamcellen Media (NSC Media: DMEM / F12 met B-27 supplement, N2 supplement, en Normocin, aangevuld met menselijk recombinant EGF en bFGF aan een concentratie van 20 ng / ml elk).
5. Voorzichtig homogeniseren tumor met een plastic stamper, die past bij de wanden van de buis.
6. Voeg 1 ml enzymvrije weefsel dissociatie oplossing en incubeer bij 37 ° C gedurende 5 min.
7. Ga celsuspensie door een 70 um cel zeef, spoel de zeef met 10 mlNSC media, centrifuge bij 300 xg gedurende 4 min, decanteren supernatant en opnieuw op te schorten pellet in 7 ml van NSC media.
8. Plate op een T25 kweekfles en kweek bij 37 ° C in een weefselkweek incubator met en atmosfeer van 95% lucht en 5% _CO2. Na 3 dagen, sommige cellen dood, wat gehecht aan de bodem van de kweekschaal en sommige vormen neurosferen, vrij zwevend in de media.
9. Verwijder deze opgeschort cellen en re-plaat op een T75 weefselkweekkolf.
10. Na nog eens drie dagen van de cultuur, het verzamelen van neurosferen, distantiëren zoals beschreven in stap 5.6, stam via cel zeef en te tellen cellen. Freeze hoeveelheden cellen in Fetal Bovine Serum 10% DMSO en doorgang cellen bij een dichtheid van een miljoen cellen in 14 ml van NSC aangevuld met EGF en FGF een T75 fles. De groei zal afhangen van de oncogenen gebruikt om tumoren te genereren. Pas celkweekomstandigheden overgroei te voorkomen en cellen handhaven op een relatief hoge dichtheid.

Resultaten

Om histo-pathologische kenmerken van SB-geïnduceerde glioblastoma karakteriseren, werden C57 / BL6 neonatale muizen geïnjecteerd op P1 met een plasmide dat codeert voor luciferase (pT2 / SB100x-Luc) in combinatie met plasmiden die coderen transposons met oncogeen DNA, dwz NRAS (pT / CAGGS -NRASV12) en SV40 LGT (pT / CMVSV40-LGT) (figuur 3c) of een plasmide dat codeert voor een korte haarspeld met p53 PDGFβ en een GFP reporter (pT2shp53 / GFP4 / mPDGFβ) in combinatie met NRAS (figuur 3d)...

Discussie

In dit artikel, we detail een veelzijdig en reproduceerbare werkwijze voor het genereren van nieuwe modellen van GBM gebruik SB transposase- gemedieerde integratie van oncogene plasmide-DNA in cellen rondom de subventriculaire zone van neonatale muizen. We presenteren een protocol om transposon plasmiden met nieuwe genen van belang te genereren, te illustreren hoe de progressie van de tumoren in levende dieren, en hoe histo-pathologische en immuno-histochemische kenmerken van deze tumoren te karakteriseren.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Stoelting's Lab Standard with Rat and Mouse Adaptors	Stoelting	51670	Andere bedrijven produceren vergelijkbare frames, elk van hen met kleine muisadapters is geschikt
Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)	Stoelting	53311	Injecties kunnen zonder worden gemaakt,,maar    de automatische injector zorgt voor verhoogde reproduceerbaarheid en gemak
10 μl 700 series hand fitted MICROLITER syringe	Hamilton	Model 701	Dit spuitmodel zal betrouwbaar van 0,5 tot 500 ul oplossing afgeven. Andere spuiten (bijvoorbeeld 5 ul, Model 75) kunnen ook worden gebruikt
30 gauge hypodermic needle (1.25", 15o bevel)	Hamilton	S/O# 197462	Deze naald is ideaal om de huid en de schedel van een neonatale muis te doorboren zonder dat andere invasieve procedures nodig zijn. Als deze boter (dringt niet gemakkelijk de huid binnen) wordt, moet deze worden vervangen.
in vivo-jetPEI	Polyplus Transfection	201-10G	Portioneren in kleine volumes en bewaren bij -20 oC
D-Luciferin, Potassium Salt	Goldbio.com	LuckK-1g	Andere bronnen van vuurvlieg lucifierase zijn net zo adequaat
Hematoxylin Solution, Harris Modified	Sigma Aldrich	HHS128-4L
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Electron Microscopy Sciences	62550-01	Voor het inbedden van hersenen voor cryosectie en immunohistochemie
Advanced DMEM/F-12, no glutamine	Life Technologies	12634-010	Voor de kweek van neurosferen
B-27¨ Supplement (50X), serum free	Life Technologies	17504-044	Serumvrij supplement voor de kweek van neurosferen
N2 Supplement (100x)	Life Technologies	17502-048	Serumvrij supplement voor de kweek van neurosferen
Normocyn	InvivoGen	ant-nr-1	Anti-mycoplasmamiddel voor de kweek van neurosferen
Recombinant Human EGF	PEPROTECH	AF-100-15	Groeifactorsupplement voor de kweek van  neurosferen
Recombinant Human FGF-basic	PEPROTECH	100-18B	Groeifactorsupplement voor de kweek van  neurosferen
[header]
HyClone HyQTase  Cell Detachment Reagent	Thermo Scientific	SV3003001	Voor de dissociatie van neurosferen
Kimble-Chase Kontes Pellet Pestle	Fisher Scientific	K749510-0590	Voor de dissociatie van vers verzamelde tumoren
Falcon Cell Strainers mesh size 70 um	Fisher Scientific	08-771-2	Voor het genereren van enkele celsuspensies van gedissocieerde neurosferen
Xylenes Histological grade	Fisher Scientific	C8H10
Protocol Harris Hematoxylin Mercury free (acidified)	Fisher Scientific	245-678
Protocol Eosyn Y Solution (intensified)	Fisher Scientific	314-631