Uitgebreide beoordeling van Kiembaan chemische toxiciteit De nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Samenvatting

We beschrijven de gedetailleerde stappen van een hoog-doorvoer chemische test bij de rondworm Caenorhabditis elegans die wordt gebruikt om de toxiciteit van de kiemcellen te beoordelen. Bij deze test wordt de verstoring van de kiemcellenfunctie na blootstelling aan chemicaliën gemonitord met behulp van een fluorescerende reporter specifiek voor aneuploïde embryo's.

Samenvatting

Het identificeren van de reproductieve toxiciteit van de duizenden chemische stoffen aanwezig in onze omgeving is een van de meest prikkelende uitdagingen op het gebied van milieu en gezondheid. Dit is deels te wijten aan het gebrek aan modelsystemen dat (1) nauwkeurig kan recapituleren toetsen kenmerken van reproductieve processen en (2) dit doen in een middellange tot high-throughput manier, zonder de noodzaak van een groot aantal gewervelde dieren.

We beschrijven hier een test in de nematode C. elegans dat de snelle identificatie van kiembaan toxische stoffen mogelijk maakt door het monitoren van de inductie van aneuploïde embryo's. Door gebruik van een GFP reporter lijn worden fouten in chromosoomsegregatie gevolg zijn van door kiemlijn verstoring gemakkelijk gevisualiseerd en gekwantificeerd door geautomatiseerde fluorescentie microscopie. Dus de screening van een bepaalde reeks van verbindingen op de toxiciteit kan worden uitgevoerd in een 96- tot 384-well plaat formaat enkele dagen. Secundaire analyse van positieve hhet kan worden uitgevoerd om te bepalen of het chromosoom afwijkingen afkomstig van meiotische verstoring of vroege embryonale chromosoomsegregatie fouten. Al met al, deze test is een snelle first-pass-strategie voor de snelle beoordeling van kiembaan dysfunctie na blootstelling aan chemische stoffen.

Inleiding

Er zijn ongeveer 87.000 chemische stoffen geregistreerd voor de handel in de Verenigde Staten, maar slechts een klein aantal van deze zijn getest voor mogelijke gevolgen voor de gezondheid ^1. Van degenen die zijn getest, is slechts een deel beoordeeld voor reproductieve gezondheidseffecten deels te wijten aan de moeilijkheid bij het bepalen van de wijziging van de vroege reproductieve gebeurtenissen in zoogdieren, vooral tijdens vrouwelijke ontwikkeling en differentiatie kiemcel. Inderdaad, de eerste meiotische gebeurtenissen plaatsvinden tijdens de vroege stadia van embryonale ontwikkeling bij vrouwelijke zoogdieren en zijn daardoor moeilijk toegankelijk en in een aantal geschikt zijn voor screening doeleinden.

De kiemlijn geeft het cruciale verband tussen generaties, en de gewenste functie is afhankelijk van de precieze uitvoering van de ingewikkelde programma van cellulaire en chromosomale scheiding genoemd meiose. Ontregeling van het meiose kan tot verminderde vruchtbaarheid en de productie vangameten en embryo's met een afwijkend aantal chromosomen, een voorwaarde genoemd aneuploïdie. Chromosoomscheiding fouten in de meiose zeer relevant zijn voor de menselijke gezondheid. Chromosoomafwijkingen komen vaak met een frequentie van 1 in 150 levendgeborenen Trisomie 21, 18 en 13 en X en Y-chromosoom fouten zijn de meest voorkomende vormen ^2,3. Bovendien, aangeboren afwijkingen, waaronder die van chromosomale oorsprong, zijn de belangrijkste oorzaak van kindersterfte dood in de VS ⁴ Het idee dat omgevingsinvloeden chromosomale segregatie en gedrag kunnen beïnvloeden is niet nieuw ^5, maar is nog steeds slecht begrepen. Het is daarom van cruciaal belang om te onderzoeken welke van de chemicaliën geïntroduceerd in onze omgeving zijn interfereren met de menselijke vruchtbaarheid, vroege ontwikkeling en de algemene reproductieve gezondheid.

In het licht van deze beperkingen van de zoogdieren modellen, hebben we een high-throughput screen test ontwikkeld tot reproductieve toxiciteit testen in de rondworm C. elegans. We hebben een aantal belangrijke functies van deze veelgebruikte genetisch modelsysteem gemobiliseerd, zoals zijn kleine formaat, lage kosten, korte voortplantingscyclus, hoog percentage van geslachtscellen en het gemak van manipulatie ^6. Wormen kunnen worden gekweekt in 96-well platen of hoog volume vloeibare kweken en door hun transparantie direct kan worden afgebeeld op platen voor detectie van fluorescerende reporters. De hieronder beschreven test maakt gebruik van deze eigenschappen en maakt gebruik van een worm stam die de fluorescente reporter Pxol-1 :: GFP kiemlijn verstoring en inductie van embryonale aneuploïdie detecteren.

Het gebruik van deze reporter stam is gebaseerd op de algemeen zeldzaam voorkomen van mannetjes in een hoofdzakelijk hermafrodiete worm bevolking. Deze mannen (<0,2%) van nature afkomstig van fout in de scheiding van het X-chromosoom ^7. Aangezien kiemlijn verstoring leidt vaak tot fouten in segregatie autosomenen heterochromosomes, correleert beide met een verhoogde incidentie van mannetjes fenotype (X missegregation) als embryonale letaliteit (autosoom missegregation). Om de inductie van mannetjes gemakkelijk detecteren te omzeilen het vraagstuk van embryonale letaliteit wordt een mannelijk promotor (xol-1) toegepast om expressie van GFP rijden vroege embryo's vertoonden nog in de baarmoeder van de worm. Als zodanig is het uiterlijk van GFP-expressie embryo's gebruikt als een proxy voor de aanwezigheid van aneuploïde embryo's. Deze werkwijze is eerder gebruikt om genen die kiemlijn onderhoud en meiose ^8,9 identificeren. Aangepast aan chemische screening, wordt deze stam die werkzaam zijn in een medium tot high-throughput screen. Belangrijk is dat de stam trouw meldt de aneugenicity chemicaliën en daarom relevant voor zoogdieren reproductieve eindpunten ^10. De beschreven test is bijzonder nuttig toxicologen in farmaceutische en chemische industrie instellingen uitziendede toxiciteit van chemicaliën naar reproductieve eindpunten snelle beoordeling. Bovendien is deze test volledig in lijn met de bestuurlijke prioriteiten gemarkeerd in de toxiciteit in de ^ste eeuw rapport 21 ^11.

Protocol

1. Voorbereiding van Feeding Bacteriën

OPMERKING: Deze sectie beschrijft de bereiding van het voeden van bacteriën (E. coli-stam OP50).

1. Isoleren van een enkele kolonie van E. coli stam OP50 een lysogenie bouillon (LB) agar plaat en aseptisch inoculeren in 300 ml van geautoclaveerd LB-bouillon.
2. Laat de geïnoculeerde kweek gedurende de nacht groeien in een schudinrichting bij 200 rpm en 37 ° C, totdat verzadiging is bereikt.
3. Breng de OP50 in 6 steriele, vooraf gewogen 50 ml conische buizen. Pellet de bacteriën door centrifugeren gedurende 5 min bij 6000 rpm (5.000 xg).
4. Verwijder het supernatant en was de bacterie met 50 ml steriel M9. Tweemaal herhalen.
5. Na de tweede wasbeurt verwijdert u het overgebleven M9, ervoor te zorgen dat er geen M9 is links in de buis.
6. Bepaal het gewicht van de pellet door weging van de buis met de pellet bacteriën en aftrekken van het gewicht van de 50 ml conische buis.
7. Resuspendeer de pellet in M9 bij een concentratie van 100 mg / ml.
8. Bewaar de OP50 oplossing bij 4 ° C totdat het wordt gebruikt voor de worm cultuur.

2. Voorbereiding van Nematode groeimedium (NGM) Petri Platen

OPMERKING: Deze sectie beschrijft de bereiding van NGM Petri platen, die de platen waar de C. zijn elegans wormen routinematig gehandhaafd in het laboratorium.

1. Autoclaaf de NGM agar medium.
2. Met behulp van steriele procedures, afzien 17 ml van NGM agar oplossing in 6 cm Petri platen met behulp van een peristaltische pomp.
   OPMERKING: Een constante hoeveelheid agar in de platen vermindert de noodzaak voor heroriëntatie microscoop bij het overschakelen van de ene plaat naar de andere.
3. Laat de platen bij kamertemperatuur gedurende 2-3 dagen voor gebruik om de agar te laten stollen en laat het overtollige vocht te verdampen.
4. Zaad van de NGM platen met behulp van een steriele techniek. Solliciteer 1-2 druppels OP50 vloeibare cultuur en verspreiden met een glazen staaf. Zorg ervoor dat niethet gazon bacteriën verspreid tot aan de randen van de platen.
5. Laat het gazon OP50 te groeien gedurende 1-2 dagen bij kamertemperatuur voordat u de borden naar wormen groeien.

3. Bereiding van een synchrone wormenpopulatie

OPMERKING: De levenscyclus van C. elegans omvat het beginstadium vier larvale stadia (L1-L4) en volwassenheid. Dit gedeelte beschrijft de bereiding van een tijdperk-synchrone bevolking van wormen. Alle materialen die in contact komen met C.elegans na het bleekmiddel behandeling moeten steriel zijn.

1. Dag 1 - Voorbereiding van de Bij drachtige Worm Bevolking
   1. Gebruik NGM platen waarin het merendeel van de wormenpopulatie uit uitgehongerd L1 larven.
   2. Verzamel de L1 larven met een gesteriliseerde worm te halen en over te brengen naar vers 6 cm NGM platen bezaaid met OP50. Incubeer gedurende ongeveer 65 uur bij 20 ° C totdat het merendeel van de wormen zwangere volwassenen. Naarvermijd plaat overbevolking en laat de wormen om te groeien zonder uitputting van de bacteriën, niet meer dan een of twee clusters van L1 larven niet overdragen aan elke verse NGM plaat.
2. Dag 4 - Oprichting van een Gesynchroniseerde L1 Larven Bevolking
   1. Verzamel de gravid wormen uit de NGM platen door ze te wassen met 1-2 ml van M9 en overbrengen naar een conische buis van 15 ml.
   2. Laat de zwangere wormen bezinken naar de bodem van de 15 ml conische buis gedurende ongeveer 5-10 minuten. Verwijder de bovenstaande vloeistof zonder verstoring van de worm pellet.
   3. Breng de worm pellet tot 2-4 microcentrifugebuisjes en voeg 1 ml bleekwater / NaOH-oplossing. Incubeer gedurende 2-3 minuten bij kamertemperatuur. De voortgang van de reactie onder de stereomicroscoop bevestigen de wormen dood. Niet bleken langer dan 5 min als de embryo's kon sterven.
   4. Verzamel de wormen door centrifugeren gedurende 1 min bij 3000 rpm (900 xg). Verwijder de bovenstaande vloeistof en voeg 1 ml steriel M9 aanneutraliseren de reactie.
   5. Was de wormen tweemaal door centrifugeren gedurende 1 min bij 3000 rpm (900 xg).
   6. Verwijder de bovenstaande vloeistof verwijderd en M9 te 100-200 ul.
   7. Met behulp van een glazen Pasteur pipet voeg een druppel van de worm / M9 mixen NGM duidelijk borden en incubeer ze gedurende ten minste 24 uur bij 20 ° C om het embryo te broeden.
      OPMERKING: Zonder voedsel groei van de larven zal worden gestopt in het stadium L1.
3. Dag 5 - Oprichting van een Gesynchroniseerde L4 larven Bevolking
   1. Verzamel de L1 larven van het heldere NGM platen door het wassen van de platen met 1-2 ml van M9 en overbrengen naar een conische buis van 15 ml.
   2. Laat de dode volwassen wormen sediment op de bodem van de 15 ml conische buis gedurende ongeveer 5 min.
   3. Verzamel de bovenstaande vloeistof, waarbij de L1 wormen in een nieuwe conische buis van 15 ml en precipiteren de wormen door centrifugeren gedurende 2 min bij 2600 rpm (1.000 xg).
   4. Verwijder het supernatant leaving ongeveer 500 pi.
   5. Bepaal de concentratie van wormen in de M9 oplossing door het tellen van het aantal wormen in 10 pl druppels met een stereomicroscoop. Telling minstens 5 druppels.
   6. Stel de concentratie van de wormen tot 20-25 wormen / ul en voeg 50 ul van de worm / M9 mix NGM platen geënt met OP50.
   7. Incubeer 65 uur bij 15 ° C (voor incubatie door het week-end) om de L1 gesynchroniseerde bevolking groeien tot ze de L4 stadium te bereiken.

4. Blootstelling van Worms naar Chemicals in 96-well platen

LET OP: Dit deel beschrijft het gebruik van Pxol1 :: GFP transcriptionele reporter met C. elegans stam screenen op de inductie van aneuploidie.

1. Verzamel de L4 larven van het heldere NGM platen door het wassen van de platen met 1-2 ml van M9 en overbrengen naar een conische buis van 15 ml.
2. Laat de L4 wormen sediment op de bodem van de15 ml conische buis gedurende ongeveer 5-10 minuten. Verwijder de bovenstaande vloeistof zonder verstoring van de worm pellet.
3. Voeg 3-5 ml M9 en bepaal de concentratie van wormen in de M9 oplossing door het tellen van het aantal wormen in 10 pl druppels met een stereomicroscoop. Telling tenminste 5 druppels per monster.
4. Resuspendeer de wormen in een concentratie van 1,000 wormen / ml in M9.
5. Verdun de OP50 bacteriën uit hoofdstuk 1 10-voudig met M9. Zorg ervoor dat de geresuspendeerd bacteriën bereiken kamertemperatuur omdat lagere temperatuur beïnvloedt worm ontwikkeling.
6. Met een multichannel pipet eerst toevoegen van 100 ul van de worm / M9 mengsel (van stap 4.4) en voeg 400 ul van de verdunde OP50 bacteriën (van stap 4.5) aan elk putje van een 2 ml diepe ronde bodem 96-well plaat. Aan het einde wordt elk putje met 100 wormen in 500 pi.
7. Voeg 0,5 ul van ofwel de teststof of de juiste controle op de gewenste putten, met een voorstel voor de definitieve krachtv bereikenatie 100 uM, concentratie algemeen in chemische schermen C. elegans ^12. Expose ethanol of DMSO oplosmiddelcontroles bij een uiteindelijke concentratie van 0,1%.
   OPMERKING: Wij raden het gebruik van nocodazole (100 uM) als positieve controle.
8. Dicht de plaat met behulp van zelfklevende folie. Zorg ervoor dat u de plaat sluiten goed af om kruisbesmetting tussen de putten te voorkomen.
9. Wikkel de plaat met aluminiumfolie.
10. Breng de plaat op een schudinrichting (170-180 rpm) van de geschikte temperatuur voor een geschikte periode (24 of 65 uur). De temperatuur van de ruimte invloed op de groei van de wormen; Houd de temperatuur ongeveer 20 ° C.

5. Image Acquisition van Bij drachtige Worms in een 384-wells plaat

LET OP: Dit deel beschrijft het gebruik van een hoog gehalte microscoop het imago van de blootgestelde Pxol1 :: GFP wormen, om de expressie van GFP visualiseren in het embryo in de baarmoeder van de volwassen hermafrodieten. Voorelk 384-well plaat worden gescreend, gebruik wormen 4 x 96 putjes.

1. Na chemische blootstelling van de shaker, laat de 96-well plaat rust gedurende 10-15 minuten om de volwassen wormen bezinken naar de bodem van de plaat.
2. Met een multichannel pipet, verwijdert 350 gl van de M9, zeer voorzichtig de wormen te verstoren in de bodem van de plaat.
3. Was de wormen met 1 ml van M9 en herhaal stap 5.1.
4. Met een multichannel pipet, verwijdert 1 ml M9, waarbij vey voorzichtig de wormen te verstoren in de bodem van de plaat.
5. Met een multichannel pipet, resuspendeer de wormen in de resterende M9 en verzamel 100 ui de worm / M9 mengsel van 96-well platen en geladen in de putjes van een zwarte muren / onder 384-wells plaat. Herhaal het proces met wormen 4 x 96 putjes, tot alle putjes van de 384-wells plaat zijn geplaatst.
   OPMERKING: Het is belangrijk voor alle putten om hetzelfde volume hebben om het te vergrotenefficiëntie en snelheid van de autofocus tijdens de afbeelding overnameproces. Elk goed moet tussen de 80 tot 100 wormen.
6. Voeg 1 ul van levamisool (100 uM) aan elk putje en laat de wormen incubeer gedurende ongeveer 30 minuten.
   OPMERKING: Levamisole fungeert als een acetylcholine receptor agonist en immobiliseert de wormen.
7. Breng de plaat naar een groothoek hoog gehalte microscoop in staat om geautomatiseerde beeldvorming.
8. Voor het verwerven, gebruik dan een hoog gehalte afbeelding acquisitie en analyse software volgens de richtlijnen van de fabrikant. Selecteer de 4X doelstelling om 1 afbeelding per goed te verwerven.
9. Voordat u begint met het beeld acquisitie, pas de GFP beeldvorming parameters tot 45 msec van de blootstelling en de beeldresolutie aan 2.160 x 2.160.
10. Verzamel de gegevens als het aantal GFP positieve wormen gedeeld door het totale aantal wormen in de put, de laatste maatregel relatief consistente tussen putjes.

Resultaten

Blootstelling van de Pxol-1 :: GFP reporter stam chemische middelen zoals het microtubule gif Nocodazole (figuur 1) leidt tot de inductie van een hoog percentage van GFP-expressie embryo in de baarmoeder blootgestelde volwassen hermafrodieten vergeleken met DMSO controle. De GFP-positieve embryo aanzienlijk helderder dan de zwakke achtergrond fluorescentie waargenomen in andere embryo en de auto-fluorescentie waargenomen in de darm van de dieren. Blootgestelde wormen rechtstreeks afgebeeld op 3...

Discussie

De hier beschreven methode vormt de eerste grootschalige strategie voor de identificatie van de kiembaan toxische stoffen. Het vereist het gebruik van een GFP transgene Pxol-1 :: GFP bevatten stam die getrouw rapporteert de inductie van aneuploïdie in vroege embryo's wordt gebruikt als een proxy voor kiemlijn dysfunctie. De werkwijze omvat de zorgvuldige synchronisatie van een C. elegans worm bevolking en blootstelling wormen tegen chemicaliën 96 putjes gevolgd door beeldvorming van GFP positieve w...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
60 mm Vented, sharp edge Petri dishes	Tritech	T3315
Agar	Apex	20-274
Axygen 96-well clear round bottom 2 ml polypropylene deep well plate	Corning	P-DW-20-C-S
Bactopeptone	Apex	20-261
Bacto-tryptone	Fisher Scientific	BP1421-2
Bleach	Clorox
Calcium chloride (CaCl2)	VWR	AA12316-A1
Cholesterol	Fisher Scientific	ICN10138225
DMSO	VWR	IC19018680
E. coli (OP50)	Caenorhabditis Genetics Center		http://www.cbs.umn.edu/cgc
Ethanol 200 proof	VWR	EM-4455S
Greiner CELLSTAR 384 well plates	Sigma-Aldrich	M1937-32EA
ImageXpress Micro XLS System	Molecular Devices
Levamisole hydrochloride	Fluka	31742
Magnesium sulfate anhydrous (MgSO4)	VWR	97061-438
MetaXpress High Content Image Acquisition & Analysis Software	Molecular Devices
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P5655
Rayon films for biological cultures	VWR	60941-086
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S5886
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher Scientific	S318
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)	VWR	BDH0316
Stereomicroscope	Nikon	SMZ 745	Deze microscoop heeft een totale vergroting van 3.35X tot 300X. Elke microscoop met vergelijkbare kenmerken zal werken.
TY2441 C. elegans, Pxol-1::GFP reporter strain	Caenorhabditis Genetics Center		http://www.cbs.umn.edu/cgc
Yeast extract	Becton Dickinson	212750