Onderzoekt Single Molecule Hechting van Atomic Force Spectroscopie

Samenvatting

Er wordt een protocol gepresenteerd om een grote verscheidenheid aan enkele moleculen covalent aan een AFM-tip te koppelen. Procedures en voorbeelden om de adhesiekracht en vrije energie van deze moleculen op vaste ondergronden en bio-interfaces te bepalen, worden gegeven.

Samenvatting

Atomic force spectroscopie is een ideaal hulpmiddel om moleculen aan oppervlakken en interfaces te bestuderen. Een experimentele protocol te koppelen een grote verscheidenheid van afzonderlijke moleculen covalent op een AFM tip wordt gepresenteerd. Tegelijkertijd de AFM tip gepassiveerd om aspecifieke interacties tussen de tip en het substraat, hetgeen een vereiste om enkele moleculen aan de AFM tip bestuderen voorkomen. Analyses om de hechting van kracht, de hechting lengte, en de vrije energie van deze moleculen op vaste oppervlakken en bio-interfaces worden binnenkort gepresenteerd en externe verwijzingen voor verdere lectuur worden verricht. Voorbeeld moleculen zijn de poly (aminozuur) polytyrosine, het entpolymeer PI- g-PS en het fosfolipide POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine). Deze moleculen gedesorbeerd van verschillende oppervlakken, zoals _CH3 -SAMs, waterstof beëindigd diamant en ondersteund lipide dubbellagen onder verschillende omstandigheden oplosmiddel. Ten slottevoordelen kracht spectroscopische single molecule experimenten besproken middelen omvat om te beslissen of werkelijk een enkel molecuul is onderzocht in het experiment.

Inleiding

In de afgelopen 30 jaar heeft atomic force microscopie (AFM) bleek een waardevolle beeldvormingstechniek bestuderen biologische ^1,2 en ³ synthetische materialen en oppervlakken aangezien het voorziet moleculaire ruimtelijke resolutie in alle drie dimensies en kan op verscheidene oplosmiddel worden bediend omgevingen. Daarnaast AFM-single molecule kracht spectroscopie (SMF) in staat stelt om de krachten variërend van de PN-regime μN meten en heeft ongekend inzicht bijvoorbeeld in eiwitvouwing ^4,5, polymeerfysica ⁶ gegeven ^{- 8,} en single molecule-oppervlak interactie ^{9 - 12} .De gedachte achter het bestuderen van enkele moleculen in plaats van een ensemble van moleculen is om te voorkomen dat een gemiddelde effecten die vaak maskeren zeldzame gebeurtenissen of verborgen moleculaire toestanden. Bovendien kan een veelheid aan moleculaire parameters zoals het contour lengte, de lengte Kuhn, de hechting vrije energie, etc. zijnverkregen. Dit wordt in onderstaande voorbeelden. In een typische AFM-SMF experiment wordt de probe molecuul gekoppeld aan een zeer scherpe punt via een linker-molecule. De tip zelf is gelegen aan het einde van een buigzame cantilever. Als de punt in contact met het oppervlak wordt gebracht de probe molecuul interactie met dit oppervlak. Door het observeren van de doorbuiging van de cantilever bij het terugtrekken van de tip, de kracht en daardoor de vrije energie, aan het molecuul los te maken van het oppervlak worden bepaald. Om zinvolle statistiek, een groot aantal zogenaamde kracht-afstand curves moeten worden verworven. Bovendien true single molecule experimenten (bijv via een en dezelfde probe molecuul gedurende de duur van het gehele experiment) het probe-molecuul dient covalent gekoppeld aan de AFM tip bevatten. Hier wordt een experimenteel protocol voor cantilever functionalisering met een enkel molecuul via een covalente binding gepresenteerd. De single molecule kan ofwel gekoppeld via een amino- of thiol groep aan de AFM tip. De conjugatie werkwijze kan worden uitgevoerd in een grote verscheidenheid van oplosmiddelen (organisch en waterig) overeenkomt met het solvatatie eigenschappen van de gebruikte polymeren.

In het eerste deel, een algemeen protocol covalent een enkel molecuul ("probe molecule") te bevestigen via een linker-molecuul aan een AFM tip wordt beschreven. Hiertoe wordt organisch NHS- of maleïmide-chemie gebruikt ^13. Samen met het protocol voor drie bijvoorbeeld moleculen, worden de data-acquisitie en data-analyse processen beschreven en referenties voor verdere lectuur zijn aanwezig. Het voorbeeld moleculen zijn: de (lineaire) polymeren tyrosine, het entpolymeer PI- g-PS en het lipide POPE. Dit omvat kleine variaties van het protocol, bijvoorbeeld om covalent cysteïnen. Daarnaast wordt een gedeelte gewijd aan de bereiding van diverse oppervlakken zoals een diamant oppervlak, een _CH3--Self monolaag en lipide dubbellagen. Deze interfaces hebben proven zijn goede referenties en voorbeelden.

Protocol

OPMERKING: Zie figuur 2 voor een overzicht van de procesflow bestaande uit de voorbereiding, de data-acquisitie en data-analyse stappen.

1. Reagens Setup

OPMERKING: Alle chemicaliën moeten met zorg worden behandeld, en dus een lab jas, handschoenen en een bescherming voor de ogen zou moeten worden gebruikt. Alle bewerkingen moeten worden uitgevoerd in een laboratorium kap. In het bijzonder moet handschoenen te dragen bij chloroform gebruikt.

1. Gebruik chemische stoffen met een laag watergehalte zoals droge chloroform snel en op te slaan droog, maar niet langer dan een week. Bewaar beide stoffen bij -20 ° C onder stikstof of argon gas omdat APTES ((3-aminopropyl) triethoxysilan) (zie tabel 1) en PEG (polyethyleenglycol) zijn hygroscopisch en PEG is onderworpen aan oxidatie in lucht.
2. Frequente blootstelling van de voorraad aan zuurstof in de lucht en vocht te voorkomen, bereiden kleinere porties, idealiter binnen een dashboardkastje systeem met een stikstof atmosphere.

2. Apparatuur Setup

OPMERKING: Om mogelijke kruisbesmetting te vermijden, gebruiken verse en schone schepen voor elke stap.

1. Schoon glaswerk en pincet reinigingsoplossing gedurende 30 minuten in een ultrasoon bad bij 60 ° C.
2. Spoel en ultrasone trillingen apparatuur uit stap 2.1 twee keer grondig met ultrapuur water.
3. Warmte machines van stap 2.1 in RCA-oplossing (ultrazuiver water, waterstofperoxide en ammoniak (5: 1: 1)) tot 75 ° C in een oven gedurende 45 min en vervolgens spoelen met ultrapuur water.
4. Tenslotte wordt het glaswerk en pincet onder een stroom van droge stikstof of in een oven (100 ° C, 3 uur).

3. Tip Functionalisering

OPMERKING: pincet, schepen, etc. gemaakt van roestvrij staal, PTFE, glas of elk ander materiaal dat chemisch stabiel in organische oplossingen als toepasselijk. Tenzij anders vermeld, het uitvoeren van alle stappen op RT. De hoeveelheid incubatieoplossing nodig afhankelijk van het aantal cantilever chips. Zorg ervoor dat de uitkragingen worden ondergedompeld in de respectieve oplossingen te allen tijde.

OPMERKING: Gebruik een kap om inademing van organische dampen te voorkomen.

1. Vorming van OH-groepen op cantilever oppervlak ('activering') (ongeveer 0,5 uur):
   1. Gebruik een pincet om verse cantilever chips plaatsen (materiaal: zonde, veerconstante: 10-100 pN / nm) op een schoon glasplaatje en leg ze in een plasma kamer (100 W).
   2. Evacueren kamer (~ 0,1 mbar).
   3. Overstroming kamer met zuurstofgas en evacueren opnieuw.
   4. Activeer de plasma-proces (power: 20%, duur: 15 min, proces druk: 0,25 mbar).
2. Amino-silanisatie van cantilevers (ongeveer 1 uur):
   1. Bereid de 2,5 ml APTES oplossing (zie tabel 1) in een glazen petrischaal - doe dit ideaal tijdens het plasma proces.
   2. Immediately na het plasma proces, dompel elke cantilever voor 1 sec in aceton en leg ze direct daarna in de APTES oplossing.
   3. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
   4. Spoel voorzichtig de cantilever chips tweemaal in 10 ml aceton en eenmaal in 10 ml chloroform.
   5. Optioneel laatste stap: Plaats cantilever chips uit de vorige stap op een schoon glasplaatje en bak ze gedurende 30 minuten bij 70 ° C. Merk op dat er ook alternatieve strategieën voor oppervlakte-activering, bijvoorbeeld, UV-behandeling ^12.
3. PEGylatie (ongeveer 2 uur):
   OPMERKING: Voer de stappen 3.3.1-3.3.4 tijdens amino-silanisatie. NHS en maleïmide groepen onderworpen aan hydrolyse in waterige milieus en PEG op zich aan oxidatie in lucht. Daarom timing (vooral tussen de stappen) is een kritische parameter. Zie ¹³ voor meer informatie.
   1. Bereid de chloroformoplossing (zie tabel 1).
   2. Om condensatie te voorkomen, Warme PEG poeders tot RT vóór het openen van de hoeveelheid en het gewicht van de juiste hoeveelheid.
   3. Voor de koppeling van polymeren of lipiden met aminogroepen, afzonderlijk oplossen NHS-PEG-NHS (6 kDa) en methyl-PEG-NHS (5 kDa) in chloroform oplossing door vortexen totdat ze volledig zijn opgelost. Zie tabel 1 voor de concentraties.
      1. Als alternatief. voor de koppeling van polymeren met thiolgroepen afzonderlijk oplossen Mal-NHS- PEG en methyl-PEG-NHS in de chloroformoplossing.
   4. Meng de oplossingen zoals vereist om een ​​bepaald aantal verhouding tussen de NHS- of maleimide- en methyl beëindigde PEG-moleculen (gewoonlijk 1: 500) aan te passen. Merk op dat de ideale verhouding moet iteratief worden bepaald in een reeks preparaat-experiment cycli.
   5. Incubeer cantilever chips in de PEG-oplossing gedurende 1 uur in een verzadigde atmosfeer chloroform verdamping van het chloroform voorkomen.
4. Probemolecuul vervoeging(> 1 uur):
   Opmerking: In de volgende 3.4.1-3.4.3 worden drie voorbeelden van de covalente koppeling van verschillende probe-moleculen de AFM tip beschreven. Voor elk molecuul het protocol moet worden aangepast. Merk verder op, dat in voorbeeld 1 en 3 NHS-chemie wordt gebruikt terwijl in voorbeeld 2 de thiol gefunctionaliseerde polymeer PI g-PS is gekoppeld met de PEG via maleïmide-chemie. Voor details zie ^14.
   1. Voor poly (aminozuur) poly-D-tyrosine (40-100 kDa)
      1. Los de polytyrosine geconjugeerd probemolecuul in 1 M NaOH. Stel de concentratie 1 mg / ml.
      2. Wisselen de NaOH voor natriumboraatbuffer (pH 8,1) gebruik makend van spin ontzouten kolommen (7 kDa MWCO) onmiddellijk vóór de functionalisering
      3. Spoel de cantilevers eerst met 5 ml chloroform, gevolgd door 5 ml ethanol en tenslotte met 5 ml boraatbuffer.
      4. Incubeer de cantilever chips voor 1 uur in de polytyrosine boraatbufferoplossing en spoel na met boraatbufferen ultrapuur water. Opslaan in ultrapuur water totdat de meting.
   2. Voor polymeren met een lineaire hoofdketen (polyisopreen, 119 kDa) met geënte zijketens (polystyreen, 88 kDa) ¹⁴
      1. Ontbinding van de PI-g -PS in droge chloroform. Stel de concentratie van de conjugatie oplossing van 4 mg / ml.
      2. Spoel de cantilevers met 5 ml chloroform en incubeer gedurende ten minste 1 uur in de conjugatie oplossing.
      3. Spoel opnieuw in 5 ml chloroform en opslaan in chloroform in een chloroform-verzadigde omgeving tot de meting (chloroform verdamping te voorkomen).
   3. Voor de lipide POPE
      1. Ontbinden PAUS in droge chloroform. Stel de concentratie 20 mM.
      2. Spoel de cantilevers met 5 ml ethanol en 5 ml ultrazuiver water voor de incubatie van de cantilevers gedurende 1 uur in de lipideoplossing.
      3. Na incubatie, spoelen cantilevers met 5 ml chloroform, 5 ml ethanol en 5 ml warm, ultrapuur water (in deze volgorde) om ongebonden probemoleculen te verwijderen en om zich te ontdoen van chloroform resten te krijgen. Gebruik gefunctionaliseerde tips onmiddellijk. Als alternatief, bewaar ze in chloroform totdat het nodig is.

Figuur 1. (A) Schematische tentoonstelling het topje functionalizering proces met behulp van het voorbeeld van de NHS chemie. (B) Chemische binding gebruikt om een sonde molecuul aan de tip hechten via een aminogroep. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

4. Voorbereiding van de oppervlakte

1. Zelf-geassembleerde monolaag (SAM)
   OPMERKING: oppervlak voor het eerste voorbeeld, werd een zelf samengestelde monolaag gekozen. Verwijzen naar literatuur ¹⁵ voor meer informatie.
   1. Schoon objectglaasjes met een reinigingsmiddel en vervolgens tweemaal in ultrazuiver water in een ultrasoon bad gedurende 30 minuten elk. Dan, als een extra reinigingsstap, plaats ze in de RCA-oplossing (zie stap 2.3) bij 75 ° C gedurende 15 min.
   2. De vacht van de dia's met 10 nm chroom nikkel en 100 nm goud in een vacuüm coater. Bewaar vervolgens in de koelkast en schoon weer de RCA oplossing onmiddellijk voor de volgende stap.
   3. Incubeer de glaasjes van de voorgaande stap in 2 mM 1-dodecanthiol / ethanol oplossing gedurende 12 uur. De thiolgroepen binden aan het gouden oppervlak en een hydrofobe monolaag zelf assembleert. De dia's met ethanol en ultrapuur water en daarna droog te spoelen door een stroom van stikstofgas. Bevestig de hydrofobiciteit van het voorbereide oppervlak met statische contacthoek metingen in een goniometer met een CCD-camera ^10.
2. Waterstof beëindigd diamant
   OPMERKING: als oppervlak voor het tweede voorbeeld werd een waterstof beëindigd diamant gekozen. De voorbehandeling werd uitgevoerd zoals eerder ¹⁶ beschreven.
3. Ondersteunde lipide dubbellaag
   Opmerking: In het laatste voorbeeld een oppervlak ondersteunde lipide dubbellaag (SLB) werd gebruikt als een oppervlak. Om zo'n oppervlak te verkrijgen, een oplossing (0,1 mg / ml) van grote unilamellaire vesicles (LUV), bestaande uit het fosfolipide POPC werden gevormd door de extrusiewerkwijze. Dan 50 ul van de LUV oplossing werd op een vers gekliefd micablad (A = 1 cm²) gebracht en gedurende 30 min. Tenslotte wordt de oplossing werd gespoeld met 20 ml ultrazuiver water. Zie ^17,18 voor een uitgebreide beschrijving van de voorbereiding van SLBs.

5. Data Acquisition

OPMERKING: Voor de experimenten, gebruik een AFM, die de mogelijkheid om te meten in vloeistoffen biedt. De data-acquisitie en data-analyse procedures zijn van toepassing ongeacht de AFM gebruikte model. Voorts zijn op experimenten is het voordelig om de mogelijkheid om de temperatuur te regelene in de vloeistof cel. Cantilever doorbuiging werd ontdekt via de laserstraal doorbuiging methode ^19. Veerconstanten werden bepaald met de thermische ruis methode ^20.

1. Plaats de gefunctionaliseerde cantilever in een AFM cantilever houder die geschikt is voor het meten in fluïda.
2. Zet het oppervlak (bereiding zie hierboven) te bemonsteren in de AFM en bedek het met vloeistof. Beide, cantilever en oppervlak moet nu worden ondergedompeld in de vloeistof met de cantilever tip wees naar het oppervlak. Merk op dat in veel gevallen een druppel vloeistof voldoende. In elk geval verdamping van de vloeistof moet worden vermeden, bijvoorbeeld door het gebruik van een gesloten fluïdumcel.
3. Indien van toepassing, de gewenste temperatuur op de controller.
4. Laat het systeem in evenwicht komen voor ten minste een half uur.
5. Neem een ​​thermische ruis spectrum van de cantilever met cantilever ver van het vlak zodat elk oppervlak demping sluiten. Merk op dat gewoonlijk 10 of meer spectra moeten worden verzameld om een ​​voldoende signaal-ruisverhouding te verkrijgen.
6. Benader het oppervlak. Merk op dat om tipgeometrie en tip functionalisering instandhouding aanpak proces moet zorgvuldig worden uitgevoerd. Dit kan worden bereikt door bijvoorbeeld benaderen intermitterende contact mode.
7. Bepaal de inverse optische hendel gevoeligheid (InvOLS) gemeten in nm / volt. Doe dit door op de cantilever tip tegen een hard oppervlak.
   1. Bepaal de InvOLS door meting van de helling van de piëzo reisafstand versus verandering fotodiode spanning. Breng een lijn naar het gedeelte van de kracht-afstand curve waar de cantilever tip in contact is met het oppervlak. In experimenten met een zachte ondergrond, zoals lipidendubbellagen uitvoeren van deze stap op gebieden die niet zijn bedekt met een lipide dubbellaag ('defect spots').
8. Bepaal de veerconstante (PN / nm) door het aanbrengen van een harmonische oscillator naar de thermische ruis spectrum. Gebruikgeautomatiseerde software-functie voor veerconstante bepalen; literatuur ²⁰ anders te raadplegen.
9. Start het experiment.
   1. Record tal van kracht-afstand curves bij elke experimentele conditie. Typisch, gebruikt u de volgende waarden voor de experimentele parameters: sampling rate van 5 kHz, tip snelheid van 1 um / sec, intrekken afstand van 1 micrometer.
      OPMERKING: Soms, afhankelijk van de dynamiek van de onderzochte experiment, kan het nodig zijn om een ​​bepaalde tijd wacht met de punt in contact met het oppervlak ('dwell time).
      OPMERKING: Het experiment specifieke parameters kunnen aanzienlijk afwijken van de hierboven gegeven waarden.
   2. Bij langdurige metingen op nul laser positie op de fotodiode van tijd tot tijd door herpositionering van de fotodiode.
   3. Optioneel: Na elke kracht curve, verplaats de AFM-tip naar een andere xy positie.
   4. Aan het einde van het experiment, bepalen de gevoeligheid en de veer CONSTAnt nogmaals te controleren op consistentie en stabiliteit van het systeem.
      Opmerking: Het vergelijken van de veerconstante en de gevoeligheid voor en na het experiment ook worden gewaarborgd dat de eigenschappen van het systeem en de eigenschappen van de punt bleef onveranderd in de loop van het experiment. Als het verschil van de veerconstanten niet te groot (<= 15%), kunnen zij worden gemiddeld aangezien de intrinsieke onzekerheid van veerconstante bepaling is ongeveer 15%. Voor grotere verschillen, is het raadzaam om eerst vinden en het probleem op de veranderende schijnbare veerconstante daarna door met verdere experimenten.

6. Gegevens Voorbereiding

Opmerking: In deze sectie algemene gegevens bereidingsstappen die kenmerkend worden uitgevoerd onafhankelijk van het specifieke type experiment eenheden omschakelen Newton en nanometer alsmede corrigeren gegevens worden beschreven. Het experiment specifieke data analyses zijn briefly hieronder verder beschreven in de desbetreffende vertegenwoordiger voorbeeldsectie.

1. Gewoonlijk voert alle data en analyse stappen automatisch een huis geschreven algoritme, bijvoorbeeld op basis van de software IGOR Pro 6.
2. Zetten de rauwe doorbuiging signaal (Defl) [V] in werking door deze te vermenigvuldigen met de InvOLS [nm / V] en de veerconstante [nN / nm].
3. Offset de kracht zodanig dat de kracht op de cantilever voldoende afstand van het oppervlak (ongeladen cantilever) wordt 0 nN.
4. Bereken de actuele positie uiteinde (ook wel scheiding gemeten ten opzichte van het oppervlak) z *, die het buigen van de vrijdragende rekening houdt:
   
5. Offset z * zodanig dat z * = 0 overeenkomt met de Z-positie van het oppervlak.
   LET OP: Hier, F is de kracht die inwerkt op de punt en dus bochts de cantilever (vastgesteld in punt 6.2.), z is de gemeten z-sensor positie (rechtstreeks gegeven door het instrument) en k staat voor de veerconstante (vastgesteld in punt 5.8).

Figuur 2. Proces stroomdiagram waarop het monster voorbereiding, de data-acquisitie en data-analyse. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Resultaten

Hieronder zijn de resultaten voor de bovengenoemde voorbeeld moleculen, namelijk de polymeren poly (aminozuur) polytyrosine, het entpolymeer PI- g-PS en het fosfolipide POPE, gepresenteerd. Eerst voor elk voorbeeld, experimenteren specifieke details voor de data-acquisitie en data voorbereiding zijn aanwezig. Vervolgens de illustratieve resultaten voor experimenten waarbij deze moleculen werden gedesorbeerd uit verschillende oppervlakken _(CH3 -SAMs, waterstof beëindigd diamant en lipide dubbellagen) ...

Discussie

Tijdens de laatste decennia hebben enkel molecuul experimenten ongekende inzichten in de moleculaire mechanismen en bleek een aanpak van onschatbare waarde in de life science en daarbuiten. Om een ​​goede en zinvolle statistieken van SMF experimenten idealiter een en hetzelfde molecuul wordt gebruikt over de gehele loop van het experiment te bereiken. In tegenstelling tot experimenten met ensembles van moleculen, SMF's experimenten zijn in staat om zeldzame gebeurtenissen en verborgen moleculaire toestanden te detec...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Materialen
Hellmanex III alkalisch vloeibaar concentraat (detergensoplossing)	Hellma
RCA (ultrapuur water, waterstofperoxide (35%), ammoniak (32%); 5:1:1(v/v/v))	Sigma
Vectabond reagens / APTES (3-Aminopropyl)triethoxysilaan	Vectorlabs
Drooggeaceton (< 50 ppm H2O)	Sigma
Droogge chloroform (> 99,9%)	Sigma
Triethylamine	Sigma
Ultrapuur water	Biochrom, Duitsland
Dinatriumtetraboraat (> 99,5%)	Biochrom, Duitsland
Boorzuur	Biochrom, Duitsland
Monofunctioneel α-methoxy-ω-NHS PEG, 5 kDa, “methyl-PEG-NHS”	Rapp, Duitsland
Heterobifunctioneel α,ω-bis-NHS PEG, 6 kDa, “NHS-PEG-NHS”	Rapp, Duitsland
Heterobifunctioneel α-maleimidohexaanzuur- ω-NHS PEG, 5 kDa, “Mal-PEG-NHS”	Rapp, Duitsland
Probe molecuul (polymeer, lipide, etc.)
Apparatuur
Voldoende glaskristallisatie schaaltjes met uitloop (10 ml), glas Petri schoteltjes (500 µl) en glazen deksels	VWR International GmbH, Duitsland
[header]
Laboratoriumoven model UF30	Memmert, Duitsland
Temperatuur gecontroleerde sonicator	VWR International GmbH, Duitsland
Plasma systeem "Femto", 100 W	Diener, Duitsland
Een aparte glazen spuit voor elk organisch oplosmiddel	VWR International GmbH, Duitsland
Vortexmixer	VWR International GmbH, Duitsland
Microcentrifugebuisjes (0,5 ml of 1,5 ml)	Eppendorf
Pipetten: 10-100 µl, 50-200 µl en 100-1.000 µl	Eppendorf
AFM met temperatuur gecontroleerde vloeistofcel (bv. MFP-3D met BioHeater)	Asylulm Research, Santa Barbara
Zachte SiN cantilevers, typisch gemaakt van siliciumnitride (SiN) (veerconstante minder dan 100 pN/nm, bv. MLCT)	Bruker AXS, Santa Barbara