Dit artikel beschrijft een methode voor het creëren van een mechanische vaatbeschadiging bij zebravisembryo's. Dit verwondingsmodel biedt een platform voor het bestuderen van hemostasis, verwondingsgerelateerde ontsteking en wondgenezing in een organisme dat bij uitstek geschikt is voor real-time microscopie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Mechanische vatverwonding in zebravis embryo's
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Zebravisembryo's (Danio rerio) hebben zich bewezen als een krachtig model voor het bestuderen van een verscheidenheid aan ontwikkelings- en ziekteprocessen. Externe ontwikkeling en optische transparantie maken deze embryo's bijzonder geschikt voor microscopie, en er zijn talrijke transgene lijnen die specifieke celtypen labelen met fluorescerende eiwitten, waardoor de zebravisembryo een ideaal systeem is voor het visualiseren van de interactie van vasculaire, hematopoietische en andere celtypen tijdens letsel en reparatie in vivo. Voorwaartse en omgekeerde genetica in zebravis zijn goed ontwikkeld, en farmacologische manipulatie is mogelijk. We beschrijven een mechanisch vasculair letselmodel dat gebruikmaakt van micromanipulatietechnieken en dat verschillende van deze kenmerken benut om reacties op vasculair letsel te bestuderen, inclusief hemostase en bloedvatreparatie. Met behulp van een combinatie van video- en timelapse-microscopie tonen we aan dat deze methode van vasculair letsel resulteert in meetbare en reproduceerbare reacties tijdens hemostase en wondreparatie. Deze methode biedt een systeem voor het bestuderen van vasculaire letsels en reparatie in detail in een volledig dierenmodel.
Inleiding
Zebravissen zijn uitgebreid gebruikt om een verscheidenheid aan onderwerpen in de vasculaire biologie te bestuderen, waaronder vasculaire ontwikkeling, angiogenesis en hematopoietische ontwikkeling en pathologie1-3. Embryo's ontwikkelen een functionele circulatie evenals leukocyten en andere componenten van het aangeboren immuunsysteem binnen 1 dag na bevruchting (dpf) 1,4,5. De conservering van de inflammatoire en leukocytaire respons op verwonding heeft het zebravis-embryo tot een informatief model gemaakt voor diverse inflammatoire processen zoals tuberculeuze infectie, enterocolitis en weefselregeneratie6-9. Zebravis-embryo's zijn ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
OPMERKING: De procedures met behulp van zebravis werden goedgekeurd door UCSF Institutional Animal Care en gebruik Comite.
1. Voorbereiding van Gereedschap
- Steek minutia pin in een penhouder en klem de pin.
- Met behulp van fijne punt tang, buig de punt van de pen om een lichte haak te creëren.
- Voor manipulatie en stabilisatie van het embryo tijdens blessure, buig het einde van een 28 gauge ½ inch naald gemonteerd op een insulinespuit behulp punttang.
2. Voorbereiding van de zebravis embryo's voor letsel
- Opgezet zebravis broedparen en het verzamelen van eiere....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Mechanische vaatletsel werd uitgevoerd op 2 dpf embryo (Figuur 2A - C). Letsel leidt tot een snelle en betrouwbare coagulatie respons, zoals gemeten door de tijd om het stoppen bloedingen (figuur 2D). Om te bepalen of verschillen in de coagulatie reactie meetbaar is het antistollingsmiddel hirudine toegediend aan het embryo door injectie in het kanaal van Cuvier onmiddellijk voor verwonding (5-10 nl van 1 eenheid per pl hirudine opgelost in water) (voor demonstratie van.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Zebravis zijn met succes gebruikt als model voor verschillende soorten wonden waaronder laser verwonding 13-15, laser geïnduceerde trombose 16 en epitheliale 10 verwonden. Wij rapporteren een methode mechanische verwonding die eenvoudig uit te voeren en geeft een gecontroleerde letsel bij een in vivo model dat zeer vatbaar realtime microscopie. Letsel heeft een snelle en meetbare hemostatische reactie en reproduceerbare wondherstel programma dat kan worden gevolgd met video en t.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
De auteurs willen Drs. Stephen Wilson en Lisa Wilsbacher bedanken voor de nuttige discussies. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door NIH HL054737.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Minutia Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Tip diameter 0.0125 mm, rod diameter 0.1 mm |
| Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Dumont #5 Fine Tip Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Glass Depression Slide | Aquatic Eco-Systems | M30 | |
| Low Melting Agarose | Lonza | 50081 | Voorgeverfd tot 42 º C |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| 3-aminobenzoic acid (Tricaine) | Sigma Aldrich | E10521 | |
| Hirudin | Sigma Aldrich | H7016 | |
| Glass bottom imaging dishes | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZH10 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axio Observer | |
| Aquarium salts | Instant Ocean | ||
| Insulin syringe with 28.5 G needle | Becton Dickinson | 329461 |
Referenties
- Gore, A. V., Monzo, K., Cha, Y. R., Pan, W., Weinstein, B. Vascular development in the zebrafish. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (5), a006684(2012).
- Boatman, S., et al. Assaying hematopoiesis using zebrafish. Blood Cells Mol Dis. 51 (4), 271-276 (2013).
- Ellett, F., Lieschke, G. J.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
