Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Mechanische vatverwonding in zebravis embryo's

7.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52460

⸱

17 februari 2015

 , 
1Cardiovascular Research Institute, University of California

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel beschrijft een methode voor het creëren van een mechanische vaatbeschadiging bij zebravisembryo's. Dit verwondingsmodel biedt een platform voor het bestuderen van hemostasis, verwondingsgerelateerde ontsteking en wondgenezing in een organisme dat bij uitstek geschikt is voor real-time microscopie.

Samenvatting

Zebravisembryo's (Danio rerio) hebben zich bewezen als een krachtig model voor het bestuderen van een verscheidenheid aan ontwikkelings- en ziekteprocessen. Externe ontwikkeling en optische transparantie maken deze embryo's bijzonder geschikt voor microscopie, en er zijn talrijke transgene lijnen die specifieke celtypen labelen met fluorescerende eiwitten, waardoor de zebravisembryo een ideaal systeem is voor het visualiseren van de interactie van vasculaire, hematopoietische en andere celtypen tijdens letsel en reparatie in vivo. Voorwaartse en omgekeerde genetica in zebravis zijn goed ontwikkeld, en farmacologische manipulatie is mogelijk. We beschrijven een mechanisch vasculair letselmodel dat gebruikmaakt van micromanipulatietechnieken en dat verschillende van deze kenmerken benut om reacties op vasculair letsel te bestuderen, inclusief hemostase en bloedvatreparatie. Met behulp van een combinatie van video- en timelapse-microscopie tonen we aan dat deze methode van vasculair letsel resulteert in meetbare en reproduceerbare reacties tijdens hemostase en wondreparatie. Deze methode biedt een systeem voor het bestuderen van vasculaire letsels en reparatie in detail in een volledig dierenmodel.

Inleiding

Zebravissen zijn uitgebreid gebruikt om een verscheidenheid aan onderwerpen in de vasculaire biologie te bestuderen, waaronder vasculaire ontwikkeling, angiogenesis en hematopoietische ontwikkeling en pathologie1-3. Embryo's ontwikkelen een functionele circulatie evenals leukocyten en andere componenten van het aangeboren immuunsysteem binnen 1 dag na bevruchting (dpf) 1,4,5. De conservering van de inflammatoire en leukocytaire respons op verwonding heeft het zebravis-embryo tot een informatief model gemaakt voor diverse inflammatoire processen zoals tuberculeuze infectie, enterocolitis en weefselregeneratie6-9. Zebravis-embryo's zijn gebruikt om verwondinggerelateerde ontstekingen te bestuderen, met name in de context van epitheelverwonding en de neutrofielrespons10,11. Verwonding van het embryo resulteert in een sterk geconserveerde cellulaire respons van cellen op de verwondingsplaats en de aangeboren immuuncellen die worden gerekruteerd om op de verwonding te reageren en de resolutie ervan te reguleren11,12. Andere verwondingsmodellen hebben gefocuste laserpulsen gebruikt om verwonding ruimtelijk te lokaliseren naar specifieke celtypen, waaronder neuronen, spiercellen en cardiomyocyten13-15.

Zebravis-embryo's zijn gebruikt als model om hemostase en trombose te bestuderen in omstandigheden van farmacologische en genetische manipulatie, met behulp van zowel mechanische als laser-geïnduceerde trombusvorming16-19. Componenten van de coagulatiecascade lijken goed geconserveerd te zijn en transgenen hebben gedetailleerde studies mogelijk gemaakt van trombocyten- en fibrinedeposities op de plaats van coagulatie17,20,21. De procedure gepresenteerd in dit artikel complementeert deze methoden door een systeem te bieden voor het bestuderen van mechanische vaatbeschadiging die resulteert in vaatbreuk, trombusvorming en resolutie, en vaatreparatie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: De procedures met behulp van zebravis werden goedgekeurd door UCSF Institutional Animal Care en gebruik Comite.

1. Voorbereiding van Gereedschap

  1. Steek minutia pin in een penhouder en klem de pin.
  2. Met behulp van fijne punt tang, buig de punt van de pen om een ​​lichte haak te creëren.
  3. Voor manipulatie en stabilisatie van het embryo tijdens blessure, buig het einde van een 28 gauge ½ inch naald gemonteerd op een insulinespuit behulp punttang.

2. Voorbereiding van de zebravis embryo's voor letsel

  1. Opgezet zebravis broedparen en het verzamelen van eieren in ei water (60ug / ml aquarium zouten) zoals eerder 22 getoond.
  2. Voeg 0,003% N-fenylthioureum (PTU) om het ei water wanneer de embryo's zijn ongeveer 8 uur na de bevruchting (HPF) om melanisatie voorkomen.
  3. Dechorionate twee dagen na de bevruchting (DPF) embryo's voorafgaand aan het experiment met behulp van fijne punt tang.
    OPMERKING: Embryo's kunnen op elk moment worden gewond na circulatie begint. De hier gepresenteerde gegevens voor 2 dpf embryo, maar de techniek is met succes toegepast in embryo tot 5 dpf.
  4. Verdoven het embryo met 0,02% gebufferde 3-aminobenzoëzuur (tricaïne) ongeveer 10 min voor manipulaties.

3. mechanische Vessel Letsel van embryo's

  1. Transfer narcose embryo's tot een depressie dia op een dissectie stereomicroscoop met behulp van een transfer pipet.
  2. Met behulp van de korte platte kant van de naald naar het embryo met de dominante hand te manipuleren, de positie van de embryo op zijn kant met het ventrale oppervlak afgekeerd van de naald.
  3. Plaats de munitia pin met de tip wees direct tegen het ventrale oppervlak van de vis posterior naar de urogenitale opening. Plaats de minutia pen onder een lichte hoek zodat de gebogen tip rechtstreeks kan doorboren de periderm in de staartader (figuur 1 </ Strong>).
  4. Met behulp van de naald aan het embryo te manipuleren, doorboren de caudale ader met de minutia pin door het embryo te tikken in de pen om iets te haken de pin in de ader.
  5. Met behulp van de naald, trek het embryo uit de buurt van de minutia pin om een ​​klein scheurtje in het vat te maken.
    OPMERKING: Een succesvolle letsel zal leiden tot onmiddellijke bloeden uit de ader.

4. Analyse van Hemostasis

  1. Kies alleen embryo's met zichtbaar circulerende bloedcellen voor deze procedure.
  2. Bereid de timer zodra de minutiae pen wordt getrokken uit het vat begint.
  3. Start de timer zodra bloedverlies gevisualiseerd worden uit de wond. Wanneer bloedverlies uit de wond ophoudt, stopt de timer en noteer de totale tijd als Bloeden Time. Als coagulatie wordt geremd, om de tijd wanneer er niet langer zichtbaar circulerende bloedcellen.

5. Analyse van de Wound Healing

  1. Transfer post-letsel dieren op glazen bodem beeldvorming gerechten voor microscopie.
  2. Verwijder het merendeel van het ei water.
  3. Bedek de embryo's in 0,3-1,2% laag smeltpunt agarose opgelost in ei water, verwarmd tot tussen de 42 en 45 ºC en aangevuld met 0,02% tricaïne.
  4. Plaats embryo op hun kant behulp van een tang.
  5. Na de agarose afkoelt, vul de schaal met 0,02% tricaïne in ei water.
  6. Verwerven van beelden met behulp van helderveld, epifluorescentie of confocale microscopie.
  7. Verwijder embryo uit de agarose behulp van een tang en transfer terug naar ei water.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Mechanische vaatletsel werd uitgevoerd op 2 dpf embryo (Figuur 2A - C). Letsel leidt tot een snelle en betrouwbare coagulatie respons, zoals gemeten door de tijd om het stoppen bloedingen (figuur 2D). Om te bepalen of verschillen in de coagulatie reactie meetbaar is het antistollingsmiddel hirudine toegediend aan het embryo door injectie in het kanaal van Cuvier onmiddellijk voor verwonding (5-10 nl van 1 eenheid per pl hirudine opgelost in water) (voor demonstratie van...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Zebravis zijn met succes gebruikt als model voor verschillende soorten wonden waaronder laser verwonding 13-15, laser geïnduceerde trombose 16 en epitheliale 10 verwonden. Wij rapporteren een methode mechanische verwonding die eenvoudig uit te voeren en geeft een gecontroleerde letsel bij een in vivo model dat zeer vatbaar realtime microscopie. Letsel heeft een snelle en meetbare hemostatische reactie en reproduceerbare wondherstel programma dat kan worden gevolgd met video en t...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

De auteurs willen Drs. Stephen Wilson en Lisa Wilsbacher bedanken voor de nuttige discussies. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door NIH HL054737.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Minutia PinsFine Science Tools26002-10Tip diameter 0.0125 mm, rod diameter 0.1 mm
Pin HolderFine Science Tools26016-12
Dumont #5 Fine Tip ForcepsFine Science Tools11254-20
Glass Depression SlideAquatic Eco-SystemsM30
Low Melting AgaroseLonza 50081Voorgeverfd tot 42 º C
N-Phenylthiourea (PTU)Sigma AldrichP7629
3-aminobenzoic acid (Tricaine)Sigma AldrichE10521
HirudinSigma AldrichH7016
Glass bottom imaging dishesMattekP35G-1.5-14-C
Dissecting microscopeOlympusSZH10
Fluorescence microscopeZeissAxio Observer
Aquarium saltsInstant Ocean
Insulin syringe with 28.5 G needleBecton Dickinson 329461

Referenties

  1. Gore, A. V., Monzo, K., Cha, Y. R., Pan, W., Weinstein, B. Vascular development in the zebrafish. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (5), a006684(2012).
  2. Boatman, S., et al. Assaying hematopoiesis using zebrafish. Blood Cells Mol Dis. 51 (4), 271-276 (2013).
  3. Ellett, F., Lieschke, G. J. Zebrafish as a model for vertebrate hematopoiesis. Curr Opin Pharmacol. 10 (5), 563-570 (2010).
  4. Liu, J., Stainier, D. Y. Zebrafish in the study of early cardiac development. Circ Res. 110 (6), 870-874 (2012).
  5. Traver, D., et al. The zebrafish as a model organism to study development of the immune system. Adv Immunol. 81, 253-330 (2003).
  6. Lieschke, G. J., Trede, N. S. Fish immunology. Curr Biol. 19 (16), R678-R682 (2009).
  7. Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Curr Opin Microbiol. 11 (3), 277-283 (2008).
  8. Oehlers, S. H., et al. A chemical enterocolitis model in zebrafish larvae that is dependent on microbiota and responsive to pharmacological agents. Dev Dyn. 240 (1), 288-298 (2011).
  9. Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends Genet. 29 (11), 611-620 (2013).
  10. LeBert, D. C., Huttenlocher, A. Inflammation and wound repair. Semin Immunol. , (2014).
  11. Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology. J Leukoc Biol. 94 (4), 633-642 (2013).
  12. Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).
  13. Rosenberg, A. F., Wolman, M. A., Franzini-Armstrong, C., Granato, M. In vivo nerve-macrophage interactions following peripheral nerve injury. J Neurosci. 32 (11), 3898-3909 (2012).
  14. Otten, C., Abdelilah-Seyfried, S. Laser-inflicted injury of zebrafish embryonic skeletal muscle. J Vis Exp. (71), e4351(2013).
  15. Matrone, G., et al. Laser-targeted ablation of the zebrafish embryonic ventricle: a novel model of cardiac injury and repair. Int J Cardiol. 168 (4), 3913-3919 (2013).
  16. Jagadeeswaran, P., Carrillo, M., Radhakrishnan, U. P., Rajpurohit, S. K., Kim, S. Laser-induced thrombosis in zebrafish. Methods Cell Biol. 101, 197-203 (2011).
  17. Vo, A. H., Swaroop, A., Liu, Y., Norris, Z. G., Shavit, J. A. Loss of fibrinogen in zebrafish results in symptoms consistent with human hypofibrinogenemia. PLoS One. 8 (9), e74682(2013).
  18. Liu, Y., et al. Targeted mutagenesis of zebrafish antithrombin III triggers disseminated intravascular coagulation and thrombosis, revealing insight into function. Blood. , (2014).
  19. Jagadeeswaran, P., Liu, Y. C. A hemophilia model in zebrafish: analysis of hemostasis. Blood Cells Mol Dis. 23 (1), 52-57 (1997).
  20. Jagadeeswaran, P., Gregory, M., Day, K., Cykowski, M., Thattaliyath, B. Zebrafish: a genetic model for hemostasis and thrombosis. J Thromb Haemost. 3 (1), 46-53 (2005).
  21. Lin, H. F., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106 (12), 3803-3810 (2005).
  22. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
  23. Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. J Vis Exp. (61), (2012).
  24. Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P. Analysis of blood coagulation in the zebrafish. Blood Cells Mol Dis. 25 (3-4), 3-4 (1999).
  25. Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132 (23), 5199-5209 (2005).
  26. Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat Immunol. 4 (12), 1238-1246 (2003).
  27. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev Biol. 248 (2), 307-318 (2002).
  28. Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  29. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Dev Biol. 7, 48(2007).
  30. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).
  31. Gray, C., et al. Simultaneous intravital imaging of macrophage and neutrophil behaviour during inflammation using a novel transgenic zebrafish. Thromb Haemost. 105 (5), 811-819 (2011).
  32. Bellido-Martin, L., Chen, V., Jasuja, R., Furie, B., Furie, B. C. Imaging fibrin formation and platelet and endothelial cell activation in vivo. Thromb Haemost. 105 (5), 776-782 (2011).
  33. Bielczyk-Maczynska, E., et al. A loss of function screen of identified genome-wide association study Loci reveals new genes controlling hematopoiesis. PLoS Genet. 10 (7), e1004450(2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Beoordeling van de hemostasetime lapse microscopieanalyse van wondherstelmicromanipulatietechniekenconfocale microscopietransgene lijnenmeting van de bloedingstijdvasculair letselmodel
Mechanische vatverwonding in zebravis embryo's
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.