Generatie van muizen pacemaker celaggregaten Gebaseerd op ES-Cell-programmering in combinatie met Myh6-Promoter-Selection

Samenvatting

Dit protocol beschrijft hoe functionele sinus nodale weefsel van muizen pluripotente stamcellen (PSC) te produceren. T-Box3 (TBX3) overexpressie plus hartmyosine-zware-keten (Myh6) promotor antibiotische selectie leidt tot zeer zuivere cel pacemaker aggregaten. Deze "Induced-sinoatriale-lichamen" ("iSABs") bevatten meer dan 80% pacemaker cellen, vertonen een zeer verhoogde kloppend tarieven en zijn in staat om myocard ex vivo tempo.

Samenvatting

Behandeling van het "sick sinus syndrome" is gebaseerd op kunstmatige pacemakers. Deze van gevaren zoals batterij falen en infecties. Bovendien missen ze hormoon respons en de algemene procedure kostenintensief. "Biologische pacemakers" gegenereerd op basis van PSC's kan een alternatief zijn geworden, maar de typische inhoud van de pacemaker cellen in embryoiden Bodies (EBS) is extreem laag. De beschreven protocol combineert "forward programmering" van muizen PSC via de sinusknoop inductor TBX3 met Myh6-promotor gebaseerd antibiotische selectie. Dit levert cardiomyocyten aggregaten constante van> 80% fysiologisch functionele pacemaker cellen. Deze "geïnduceerde-sinoatriale-lichamen" ("iSABs") worden spontaan samentrekkende op nog onbereikte frequenties (400-500 bpm) overeenkomt met nodale cellen geïsoleerd van de muis harten en zijn in staat om muizen myocard ex vivo tempo. De beschreven protocol zeer zuivere sinusnodale enkele cellen worden gegenereerd die bijvoorbeeld kunnen worden gebruikt voor in vitro drug testen. Bovendien kan de gegenereerde volgens dit protocol iSABs essentieel om de kern tissue engineering worden.

Inleiding

De term "sick sinus syndroom" vat meerdere ziektes die de verslechtering van de cardiale pacemaker systeem. Het bestaat uit pathologische, symptomatische sinusbradycardie, sinoatriale blok, sinusstilstand evenals de tachycardie-bradycardie syndroom. Daarbij wordt een "sick sinus syndrome" vaak gepaard met algemene hartziekten, zoals een ischemische hartziekte, cardiomyopathie of myocarditis. Momenteel zijn therapeutische benaderingen gebaseerd op de implantatie van elektrische pacemakers. Echter, dit gaat gepaard met een aantal risico's zoals infecties en batterij defect. Kortom, de incidentie van complicaties is nog steeds zeer hoog bij patiënten met een pacemaker geïmplanteerd. Bovendien, in tegenstelling tot het endogene pacemaker, deze apparaten niet reageren op hormonale stimulatie.

Een toekomstig alternatief kan rekenen op de beschikbaarheid van "biologische pacemakers" waarvoor PSC's zou kunnen dienenals geschikte cellulaire bron en die zou ook zeer waardevol in vitro drug testen. Toch een groot probleem ligt in de zeer zeldzame verschijning van sinus nodale cellen binnen embryoid instanties (EBS) - dit meestal niet meer dan ~ 0,5% ^1.

Eerder werd aangetoond dat "forward programmering" van specifieke subtypen cardiomyocyten haalbaar door overexpressie van verschillende vroege cardiovasculaire transcriptiefactoren zoals Mesoderm-specifieke posterior 1 (MesP1) en NK2 transcriptiefactor verband, locus 5 (Nkx2.5) ^{2, 3.} Voor normale grootte en functie van de sinusknoop (SAN), het T-box transcriptiefactor Tbx3 cruciaal, waarvan is aangetoond dat de pacemaker genprogramma initiëren en differentiatie regelen van de SAN ^4. Hoewel deze verbeterde de verschijning van functionele pacemaker cellen, de inhoud nog niet in het gehele cardiomyocytic celpopulatie bedraagt ​​dan ~ 40%.

Daarom is een extra Myh6-promotor gebaseerd antibiotische selectie stap ⁵ werd geïntroduceerd door ons. Dit leidt uiteindelijk tot nog onopgemerkt cardiomyocyten aggregaten ("geïnduceerde sino-atriale organen;" iSABs "), die sterk verhoogde slaan frequentie (> 400 bpm) in vitro vertonen, voor het eerst benadert die van een muis hart en vergelijkbare in vitro gekweekt sinus nodale cellen geïsoleerd uit een muizen hart ^6. Onder Isoprenaline administratie zelfs kloppend frequenties van 550 bpm worden bereikt. Met name iSABs omvatten meer dan 80% functionele knooppunten cellen zoals blijkt uit uitgebreide fysiologische analyses ^7. Onlangs heeft een aantal benaderingen van sinus genereren nodale cellen met behulp van directe herprogrammering ^19, oppervlakte markers ¹⁴ of farmacologische behandeling met kleine moleculen ^16,17 werden beschreven. Maar geen van deze methoden tot een dergelijk hoge zuiverheid pacemakercellen en slaan frequenties dicht bij de murine hijkunst als waargenomen in iSABs.

Bovendien, in een ex vivo model van gecultiveerde volwassen muis ventriculaire schijfjes die hun spontane kloppend activiteit hebben verloren, de iSABs zijn in staat om te integreren in de slice weefsel, waardoor spontaan actief blijven en robuust pacing het hart plakjes om contracties ^7. Een gedetailleerd protocol voor het genereren van deze iSABs wordt beschreven in dit document.

Protocol

1. Aanbevelingen Voor het starten

1. Niet PSC's besmet met mycoplasma gebruiken omdat ze niet goed zullen differentiëren in de sinusknoop cellen. Test voor mycoplasmabesmetting voordat het protocol. Doe dit met behulp van een PCR-kit voor een snelle, zeer gevoelige detectie van mycoplasma en volg de fabrikant `protocol.
2. Voor elke petrischaal (stap 2.3.4), jas een 10 cm ² celkweek schotel met steriele 7 ml 0,1% gelatine uit koud water vissen huid gedurende 1 uur bij 37 ° C. Verwijder de gelatine en laat de schotel drogen onder steriele omstandigheden in een steriele bank.
3. I) Constitutieve overexpressie van TBX3 gebruik van een zoogdierexpressievector: Voordat u de differentiatie protocol kan beginnen met een dubbel getransfecteerde stabiele muis ES cellijn kloon die de volgende functies nodig. Ii) De G418 resistentiegen onder de controle van de Myh6-promoter ^5.
4. De ongedifferentieerde PSC cellen dient gelijktijdige cultiverend met bestraalde voedingscellen onder standaard omstandigheden zoals beschreven ^1.

2. Differentiatie Procedure

1. Twee dagen voor Differentiatie - Verwijder PSC uit feeder cellen.
   1. Zuig het medium, was de cellen met 10 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing PBS, 7 ml collagenase IV oplossing en incubeer de cellen gedurende 10 min bij 37 ° C. Plaats een steriele 40 um filter in een 50 ml buis.
   2. Spoel zorgvuldig het PVC kolonies (voorkomen dat de feeder-cellen te verwijderen) door pipetteren de collagenaseoplossing omhoog en omlaag 5 keer.
   3. Breng de celsuspensie om een ​​40 pm filter, spoel het filter driemaal met 8 ml PBS. Draai je om het filter en plaats het ondersteboven in een petrischaal. Verwijder het PVC celkolonies pipetteren 10 ml PBS aan de onderkant van de filter.
   4. Breng de celsuspensie aan een 15 ml buis en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 x g.
   5. Verwijder de PBS, schorten de cellen in 1 ml Accutase en incubate bij 37 ° C gedurende 5 min.
   6. Voeg 10 ml PBS, meng de celoplossing door pipetteren en neer 5 keer en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 x g.
   7. Verwijder de PBS, schorten de cellen in 10 ml kweekmedium en bepaal het aantal cellen.
   8. Seed 15.000 cellen / ^cm2 op een 75 ^cm2 fles en filter te kweken gedurende 2 dagen bij 37 ° C, 5% CO2. Na 2 dagen de kolf 50-70% confluent zouden zijn.
2. Dag 0 - Start van Differentiatie
   1. Verwijder het medium en spoelen van de cellen met 10 ml PBS.
   2. Zuig het PBS, 2 ml Accutase en incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 5 min. Plaats een steriele 40 um filter in een 50 ml buis.
   3. Voeg 10 ml PBS, breng de celsuspensie aan de 40 urn filter, spoel het filter door toevoeging van 10 ml PBS en centrifugeer de doorstroming gedurende 5 min bij 300 x g.
   4. Suspendeer de cellen in 10 ml differentiatiemedium en bepaal het aantal cellen.
   5. Verdunnen thij suspensie met differentiatiemedium cel tot een uiteindelijke concentratie van 20.000 cellen / ml.
   6. Pipetteer 20 ml water en 5 ml opknoping druppel (HD) oplossing in een kwadratische petrischaal om uitdroging van de HDS voorkomen.
      OPMERKING: Voor elke 24 wells plaat met iSABs (zie rubriek 2.8.6.4/2.8.7) beginnen met 16 petrischaaltjes.
   7. Pipetteer tot 50 ml celsuspensie in een lade.
   8. Draai om het deksel van de petrischaal. Plaats 180 HD's met elk 20 pi (400 cellen / HD) celsuspensie op het deksel met behulp van een 12-kanaals pipet.
   9. Draai rond de deksel en plaats deze op de petrischaal.
      OPMERKING: De snelheid van het draaien rondom de deksel zeer belangrijk. Wanneer het deksel wordt omgedraaid te langzaam of te snel, de oppervlaktespanning van de celsuspensie niet hoog genoeg behouden de hangende druppels op het deksel. Voordat je probeert om HD's produceren voor de eerste keer de praktijk draaien rond het deksel met 20 ul druppels medium.
   10. Kweek de cellen gedurende 2 dagen bij 37 ° C, 5% _CO2 te laten vormen EBS.
       OPMERKING: Plaats een petrischaal gevuld met water op de bovenkant van een stapel van 5 petrischalen. Anders de HD in de bovenste petrischaal droogt.
3. Dag 2
   1. Draai om het deksel van de kwadratische petrischaal en breng de EBS afgeleid van twee petrischalen (360 EBS) in een 50 ml buis.
   2. Wacht 10 minuten om te laten de EBS zich te vestigen op de bodem van de buis (niet centrifugeren de EBS).
   3. Zuig zoveel medium mogelijk, op te schorten de EBS in 10 ml differentiatie medium en de overdracht van de schorsing van een 10 cm petrischaal.
4. Dag 2-6 Schorsing cultuur
   1. Ontwikkel de EBS in suspensie gedurende 4 dagen bij 37 ° C, 5% _CO2, verandert gemiddeld na 2 dagen.
      OPMERKING: Hoewel de petrischaal niet gecoat (in tegenstelling tot een celkweekschaal) het EBS hechten vaak aan het oppervlak. De controle van de petrischalen voor aangesloten EVSA elke dag en indien nodig detach het EBSvan het oppervlak door zachte pipetteren. Optioneel: Schud de petrischaaltjes continu tijdens de schorsing kweekperiode. Wees voorzichtig met de snelheid van de shaker. De EBS moet niet ophopen in het midden noch zweven naar de grens van de petrischaaltjes.
5. Dag 6
   1. Transfer De EBS van de ene petrischaal op een gelatine gecoate 10 cm ² celkweek schotel.
6. Dag 7-12
   1. De cellen moeten beginnen te verslaan na 8-12 dagen. Controleer verslaan foci van cellen dagelijks onder een microscoop. De cellen beginnen om een ​​laag te vormen.
   2. Veranderen medium dagelijks.
      OPMERKING: Na het wijzigen van medium, de cellen vereisen 3-4 uur om te herstellen en weer te gaan kloppen.
7. Dag 12-15 Selectie van sinus nodale cellen.
   1. Drie dagen nadat de cellen begonnen slaan (rond dag 12-15), Zuig het medium en pipetteer 10 ml vers differentiatie medium dat 400 ug / ml G418 aan de cellen.
8. Vier dagen na het begin van de selectie dissociëren de cellaag.
   Opmerking: Het is mogelijk dat de cellaag al los van het oppervlak.
   1. Verwijder het medium zorgvuldig zonder opzuigen van de cellaag.
   2. Voeg 10 ml PBS en verwijder de PBS voorzichtig zonder opzuigen van de cellaag.
   3. Voeg 10 ml collagenase IV oplossing overdracht van de cellen in een 50 ml buis en incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 5 min.
   4. De suspensie krachtig mengen door pipetteren en neer 10 keer en incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 5 min. Een suspensie van kleine clusters optreedt. Als er nog steeds grote delen van de laag links, dan stap herhalen 2.8.4 twee keer.
   5. Voeg 20 ml PBS en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 x g.
   6. Zuig het PBS zorgvuldig.
      OPMERKING: Als iSABs moeten worden gegenereerd door te gaan met stap 2.8.7. Als ISAB afgeleid sinus nodale enkele cellen worden gegenereerd verder gaan met stap 2.9.
   7. Hang de cellenin 12 ml differentiatie medium dat 400 ug / ml G418 en zaden ze op 6 putjes gelatine beklede 24 putjes (2 ml / putje).
9. Generatie van single nodale cel.
   1. Suspendeer de cellen uit stap 2.8.6 in 5 ml Accutase en incubeer bij 37 ° C gedurende 5 min.
   2. De suspensie krachtig mengen door pipetteren en neer 10 keer en incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 5 min.
   3. Voeg 20 ml PBS en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 x g.
   4. Suspendeer de cellen in 12 ml differentiatie medium dat 400 ug / ml G418 en zaden ze op 6 putjes van een gelatine 24 putjes (2 ml / putje) bekleed.
10. Dag 2 na dissociatie, zuig het medium en was de cellen driemaal met PBS. Voeg 1 ml differentiatie medium / goed.
11. Dag 4-8 na dissociatie, veranderen Medium elke ^2e dag. Op dag 10 na Dissociation gebruik iSABs of ISAB afgeleid sinus nodale enkele cellen zijn beschikbaar voor verdere analyse.

Resultaten

De beschreven protocol maakt generatie iSABs met een pak slaag frequentie van rond de 450 bpm van PSC's (in de film), die in de buurt om de muis hartslag frequentie. Na dissociatie van iSABs (stap 2.8.8) de waargenomen afzonderlijke cellen tonen de typische vorm van cellen van de sinusknoop (spindel en spincellen) zoals getoond in figuur 1. Deze cellen zeer express eiwitten waarvan bekend is dat essentieel voor de functie van de sinusknoop zoals Hyperpolarization cyclisch nucleotide-gated kation kan...

Discussie

Het vermogen om te produceren stamcellen afgeleide pacemaker cellen reconstitutie van de juiste hartritme mogelijk in de betekenis van "biologische pacemakers". Evenzo zal drugstests in vitro profiteren van hun beschikbaarheid. PSC's kan aanleiding geven tot celtype van het lichaam van een zoogdier waaronder hartspiercellen met mobiele pacemaker eigenschappen ^{8,9,10,11,12,13} geven. Echter, meestal de celpopulaties binnen "embryoiden Bodies" zeer heterogeen, hetgeen onvermijdelijk leidt...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Iscove's liquid medium met stabiele glutamine	Biochrom AG	FG 0465
DMEM vloeibaar medium zonder Na-pyruvaat, met stabiele glutamine	Biochrom AG	FG 0435
CLS type IV, CLS IV	Biochrom AG	C4-22
Niet-essentiële aminozuren	Biochrom AG	K 0293
FBS Superior	Biochrom AG	S 0615
Natriumpyruvaat (100 mM)	Biochrom AG	L 0473
G 418-BC vloeistof (klaar voor gebruik oplossing), steriel	Biochrom AG	A 2912
Reagens reservoir PP voor multichannel pipetten 60ml, steriel	Brand	703409
Accutase	eBioscience,Inc.	00-4555-56
Eppendorf Xplorer/Xplorer plus, elektronische pipet	Eppendorf	4861000155
Falcon Cell Strainer 40 µm	Falcon	352340
Penicilline/Streptomycine	GE Healthcare	P11-010
Petri schotels	Greiner BioOne	663102
DPBS zonder Ca en Mg	PAN-Biotech	P04-36500
Foetaal bovien serum	PAN-Biotech	P30-3302
Leukemie remmende factor	Phoenix Europe GmbH	LIF-250
Vierkante petrischalen	Roth	PX67.1
Gelatine uit koude water vishuid	SigmaAldrich	G7765
2-Mercaptoethanol	SigmaAldrich	M3148
1-Thioglycerol	SigmaAldrich	M6145
Weefselkweek schotels	TPP	93100
Weefselkweek fles	TPP	90076
Weefselkweek test platen (24 putjes)	TPP	92424