Driedimensionale Co-cultuur Model voor Tumor-stromale Interactie

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor co-cultuur in drie dimensies, wat nuttig is voor het onderzoeken van interacties tussen meerdere cellen en het beïnvloeden van het gedrag van kankercellen door de extracellulaire matrix. In dit experimentele model worden kankercellen gekweekt op collageengels ingebed met humane kanker-geassocieerde fibroblasten.

Samenvatting

Kankerprogressie (initiatie, groei, invasie en metastase) vindt plaats door interacties tussen maligne cellen en de omringende tumorstromacellen. Het tumormicro-omgeving bestaat uit verschillende celtypen, zoals fibroblasten, immuuncellen, vasculaire endotheelcellen, periccyten en beenmerg-afgeleide cellen, ingebed in de extracellulaire matrix (ECM). Kanker-geassocieerde fibroblasten (CAF's) hebben een pro-tumorigene rol door de secretie van oplosbare factoren, angiogenese en ECM-remodellering. De experimentele modellen voor kankerceloverleving, proliferatie, migratie en invasie zijn voornamelijk gebaseerd op twee-dimensionale monocellulaire en monolaag-weefselculturen of Boyden-kamer-assays. Deze experimenten weerspiegelen echter niet precies de fysiologische of pathologische omstandigheden in een aangetaste orgaan. Om een beter begrip te krijgen van tumorstroma of tumormatrixinteracties, bieden meercellige en driedimensionale culturen krachtigere hulpmiddelen voor het onderzoeken van intercellulaire communicatie en ECM-afhankelijke modulatie van het gedrag van kankercellen. Als platform voor dit type studie presenteren we een experimenteel model waarin kankercellen worden gekweekt op collageengels ingebed met primaire culturen van CAF's.

Inleiding

Kankerweefsel kan worden gezien als een soort orgaan, dat zich ontwikkelt door nauwe interacties tussen de kanker en de tumor-stromale micro-omgeving, bestaande uit kanker-geassocieerde fibroblasten (CAF's), immuuncellen, tumorvaten en de extracellulaire matrix (ECM). CAF's zijn de belangrijkste bron van oplosbare factoren (cytokinen, groeifactoren en chemokinen) die mitogene, pro-migratoire en pro-invasieve effecten hebben op kankercellen. Ze stimuleren ook de vorming van tumorvaten en rekruteren precursorcellen, zoals beenmerg-afgeleide cellen (BMDC). Geactiveerde CAF's zijn betrokken bij de productie en remodellering van de ECM, waardoor de groei en verspreiding van kankercellen wordt bevorderd¹. CAF's bieden ook een niche die tumorcellen kolonisatie en metastase vergemakkelijkt en in staat zijn om stamcelfenotypen over te brengen op naburige kankercellen. Pathologische waarnemingen suggereren dat stromareacties of fibrotische veranderingen in kankerweefsel indicatief zijn voor een slechte prognose. Recente studies hebben ook aangetoond dat tumor-stroma kenmerken, zoals het genpatroon, de prognose van patiënten kunnen voorspellen. Verder kunnen door CAF's afgegeven factoren de gevoeligheid voor chemotherapie moduleren, wat de rol van CAF's in het bepalen van geneesmiddelgevoeligheid en resistentie benadrukt².

Aangezien CAF's een veelzijdige rol spelen bij het bevorderen van tumorprogressie via signaalroutes die interacties tussen CAF's en verschillende celtypen binnen de tumormicro-omgeving mediëren, hebben ze steeds meer aandacht gekregen als nieuwe doelen voor kankertherapieën. De heterogeniteit van de celpopulaties binnen de kankermicro-omgeving vormt een obstakel voor het targeten van CAF's. Er zijn verschillende markeringen voor CAF's voorgesteld, zoals α-smooth muscle actin (α-SMA), fibroblast activatie-eiwit (FAP) en fibroblast specifiek proteïne-1 (FSP-1: ook wel S100A4 genoemd); echter, deze moleculaire markers zijn niet specifiek voor het onderscheid van CAF's van andere cellen die aanwezig zijn in niet-kankerweefsel³. Daarom zijn verdere studies nodig om meer kennis te vergaren over de specifieke eigenschappen van CAF's. Om dit te bereiken, is het informatief om primair gekweekte CAF's te karakteriseren in vergelijking met patiënt-gematchte normale fibroblasten.

Onlangs zijn analyses van patiënt-afgeleide CAF's gerapporteerd in verschillende kankertypen, waarbij unieke genexpressiepatronen en celgedragingen zijn onthuld in vergelijking met fibroblasten afgeleid van niet-kankerweefsel. Met behulp van geïsoleerde CAF's uit menselijk longkankerweefsel hebben we een driedimensionale co-cultuurmethode ontwikkeld, waarmee we de eigenschappen van long-CAF's kunnen evalueren. In dit model onderzochten we de effecten van de CAF's op longkankercel-invasie, proliferatie en collageengelcontractie, wat experimenteel de tumor-bevorderende rollen van long-CAF's nabootste⁴.

Protocol

LET OP: Deze studie werd goedgekeurd door de bevoegde ethische commissies.

1. Primaire cultuur van de mens longfibroblasten

1. Het verzamelen van longweefsel:
   1. Verkrijgen menselijk longweefsel monsters uit de chirurgische operatiekamer direct. Verzamel ongeveer 1 cm ³ blokken van kankerachtige en niet-kankerachtige longweefsel met de niet-kwaadaardige monster verzameld ver van de tumor mogelijk.
   2. Suspendeer de monsters in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 100 eenheden / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine en 0,25 pg / ml amfotericine B (serumvrij medium). Handhaaf de monsters gesuspendeerd in steriele 50 ml buizen en overbrengen naar het laboratorium.
      OPMERKING: Fibroblasten zijn sterk migrerende en proliferatieve vergelijking met andere celtypen, zoals epitheel, endotheel en gladde spiercellen. De uitgroei methode maakt gebruik van deze functies van fibroblasten, en outgrowing cellen van weefsel secties zijn er in overvloed in fibroblasten. Na diverse overentingen andere celtypen niet overleven en voortplanten in DMEM met 10% foetaal runderserum (FBS), resulterend in gezuiverde fibroblast celkweken. De cellen kunnen worden gebruikt 3-7 passages na primaire cultuur.
2. Explantaatkweek en conditionering voor mobiele uitgroei:
   1. Voeren primaire cultuur van fibroblasten met behulp van een eerder gemelde protocol met aanpassingen ^5.
   2. In het laboratorium, plaats het weefselmonster op een 10 cm weefselkweekschaal zonder kweekmedium en in kleine secties ~ 2-3 mm groot met steriele pincet en een scalpel. Daarbij vermijdt de sectie droge, anders de efficiëntie van de cel uitgroei wordt aangetast.
3. Scheiding van de epitheliale cellaag en bindweefsel:
   1. Week de cut weefselcoupes in kweekmedium bevattende 2000 PU / ml Dispase I en kweek gedurende 16 uur bij 4 ° C.
   2. Breng de weefselcoupes een schotel, en scheiden de epitheliale cellaag van het aangrenzende bindweefsel. Verwerk de secties in een schone werkbank om verontreiniging van micro-organismen te voorkomen.
      OPMERKING: Als de primaire cultuur van epitheelcellen nodig is, stap 1.3 uit te voeren. Als alleen fibroblasten zijn om geïsoleerd te worden, wordt punt 1.3, omdat de daaropvolgende explantaatkweek en celpassages zijn ongunstig voor de epitheelcellen, die gezuiverd fibroblast populatie opleveren.
4. Aanhechting van weefsel secties:
   1. Hak de weefsels tot 1 mm gesneden met twee scalpels. Als de stukken zijn niet klein genoeg, dat MOET gemakkelijker uit de schaal en de cellen niet ontgroeien op de schotel oppervlak.
   2. Plaats kleine longweefsel secties van elkaar naar een leeg gebied rond elk stuk handhaven. Maak krassen op het oppervlak van de weefselkweekschaal met een scalpel om hechting van weefselcoupes vergemakkelijken.
      OPMERKING: KrassenOok lijkt cel uitgroei bevorderen, waardoor sporen waarlangs cellen kunnen migreren.
      1. Als alternatief, plaats gehakt weefsel stukken individueel in elk putje van een 6-wells plaat, en bedek ze met een dekglas. Bevestig het deksel slip aan het oppervlak van de plaat met behulp van siliconenvet.
      2. Plaats siliconenvet op twee punten van 1,5 cm van elkaar in elk putje met behulp van een steriele pin. Dekking van het weefsel stukken verhoogt de effectiviteit van de cel uitgroei en cel voortplanting na verscheidene passages.
5. Daaropvolgende explantaatkweek:
   1. Voeg voorzichtig kweekmedium de schaal voor de weefselcoupes uitdrogen zo efficiënt cel uitgroei verloren grotendeels indien de monsters uitdrogen. Wees niet te snel als het weefsel secties zou losmaken giet het medium.
   2. Kweekcellen in DMEM met 10% FBS. Gebruik voldoende medium om alleen het weefsel omvatten, maar niet zo veel dat het mogelijk maakt drijven, als extra drijfvermogen bevordert onthechting van degerecht.
6. Passage van de cellen:
   1. Behandel het kweekmedium met zorg te allen tijde als herhaalde bewegingen van de cultuur schotel kan leiden tot onthechting van het weefsel secties.
   2. Plaats de kweekschalen in een incubator bij 37 ° C gedurende 5-7 dagen. Vernieuw het medium om de andere dag, en omgaan met de cultuur gerechten minimaal tijdens het medium verandert. Fibroblasten ontgroeien van de rand van het weefsel secties in de komende weken.
      OPMERKING: Na ~ 2-3 weken uitgroeiende fibroblasten bijna confluentie bereiken, afhankelijk van de hoeveelheid oppervlak.
   3. Was de cellen met 1x PBS, en voeg 1 ml trypsine ik aan de plaat.
   4. Na trypsinisatie, los de cellen met 9 ml DMEM aangevuld met 10% FBS. Verzamel cellen gesuspendeerd in het medium in een 10 ml buis, samen met de weefselcoupes. Na centrifugatie naar cel pellets, resuspendeer de verkregen pellets in het nieuwe medium.
   5. Zaad de cellen en weefselcoupes op een nieuw cultuur schotel, waarna het weefsel niet hechten aan de schotel, terwijl de cellen hechten en te groeien. De volgende dag, verwijder de drijvende stukken weefsel door aspiratie, en verander het medium. Bijgevoegde fibroblasten propageren met latere culturen.

2. Driedimensionale Co-cultuur van de Mens longfibroblasten en kankercellen

1. Bereiding van cellen en reagentia:
   1. Ongeveer gebruik 2 x 10 ⁵ epitheelcellen en 2,5 x 10 ⁵ fibroblasten per putje. Bereid collageen type IA (3 mg / ml, pH 3), FBS (100%), reconstitutie buffer (50 mM NaOH, 260 mM _NaHCO3, 200 mM HEPES), 5x DMEM, DMEM aangevuld met 10% FBS voor fibroblast cultuur, en een 3D co-kweekmedium (een 1: 1 mengsel van fibroblast kweekmedium en kweekmedium voor kankercellen).
   2. Cultuur A549 long adenocarcinoom cellen, fibroblasten en A549 3D co-cultuur in DMEM aangevuld met 10% FBS.
2. Collageen gel formatie:
   1. Was fibroblasten gekweekt op 10 cm schotel met 1x PBS, en voeg 1 ml trypsine ik aan de plaat. Na behandeling met trypsine gedurende ~ 5 min bij 37 ° C, los de cellen met 9 ml DMEM aangevuld met 10% FBS. Verzamel cellen gesuspendeerd in het medium in een 10 ml buis en centrifugeer ze op 200-300 xg naar cel pellets.
   2. Resuspendeer de verkregen pellets 100% FBS bij een dichtheid van 5 x 10 ⁵ / ml.
   3. Bereid de collageen-gel op ijs. Koel de reagentia, pipetten en buizen in een koelkast voor de volgende procedure. Zelfs op ijs, het mengsel stolt enigszins, en het totale volume kleiner is dan de som van alle bestanddelen.
   4. In elk putje, de voorbereiding van de collageen-gel door het mengen van 0,5 ml van fibroblast suspensie (2,5 x 10 ⁵ cellen) in FBS, 2,3 ml type IA collageen, 670 ul 5x DMEM, en 330 ul reconstitutie buffer. Laat de gels gemakkelijk ingesteld op kamertemperatuur.
      1. Krachtig pipet om een ​​homogene mi zorgenxture. Vermijd het creëren van bubbels tijdens het pipetteren proces.
   5. Voeg het mengsel (3 ml) aan elk putje van een 6-wells plaat en laat gelatineren in de incubator bij 37 ° C ongestoord gedurende 30-60 min.
3. Kankercel cultuur op het collageen gel:
   1. Voer driedimensionaal co-cultuur met een eerder beschreven protocol met ⁶ modificaties.
   2. Resuspendeer kankercellen in de 3D ​​co-kweekmedium (of DMEM met 10% FBS bij A549 cellen) in een dichtheid van 1 x 10 ⁵ / ml.
   3. Giet 2 ml van de geresuspendeerde cellen (2 x 10 ⁵ cellen) op het oppervlak van elke gel. Wijzig cel aantal kankercellen of fibroblasten in co-kweek afhankelijk van experimentele omstandigheden.
4. Gel samentrekking:
   1. Incubeer gels overnacht bij 37 ° C zodat de kankercellen kan hechten aan de collageengel. Losmaken elke gel, en het genereren van een 'zwevende cultuur' in elk putje of 6-wells plaat.
      Opmerking: Door een zwevende cultuur, zijn verschillende veranderingen in gel omvang veroorzaakt door mechanische spanning en collageen afbraak, die worden gemedieerd door cellulaire interactie tussen co-gekweekte kankercellen en fibroblasten.
   2. Gebruik een schuine 21 G naald of kleine spatel elke gel scheiden van de rand van de put. Elke 2-3 dagen, ververs de putjes met 2 ml 3D co-kweekmedium. Meet de grootte van elke gel elke dag gedurende 5 dagen.
5. Analyse van collageen gels:
   1. Meet het collageengehalte van elke gel met collageen kwantificatie werkwijzen, zoals Sircol assay. Voer transcriptoom analyse of kwantitatieve RT-PCR na het verzamelen van RNA uit de gels ^5.

3. Air-vloeistof Interface Cultuur en Invasion Assay

1. Na het kweken van de collageen gel bij 37 ° C gedurende 5 dagen, bloot de gecontracteerde gels lucht door ze op een mesh (70 um poriegrootte) in nieuwe 6-well platen. Maak het gaas uit commercieel beschikbare mobiele filters gebruikt voor flowcytometrie.
2. Vullen zachtjes elk putje met 11 ml van 3D co-kweekmedium.
3. Plaats de gels op het gaas met een steriele lepel, en verwijder alle resterende medium uit de gels. Op deze voorwaarde, onderdompelen gels in het medium terwijl het bovenoppervlak van de gel bloot aan de lucht. Definieer deze cultuur staat als lucht-water grensvlak.
   OPMERKING: Na 5-7 dagen handhaven lucht-water grensvlak kweek bij 37 ° C in de incubator, invasieve kankercellen migreren in de gel. Afhankelijk van het celtype en als gevolg van cellulaire interacties, wordt een variabele mate van cel morfologische veranderingen in de kankercellen geïnduceerd door de lucht-vloeistof grensvlak kweek.
4. Voor histologische evaluatie, bevestig de gel in formaline oplossing overnacht bij kamertemperatuur en inbedden in paraffine. Vlek verticale secties (4 micrometer) met hematoxyline en eosine (H & E). Voeren immunohistochemische analyse on de hoofdstukken ^4.

Resultaten

Deze samenwerking kweekmethode nabootsen van de tumor micro-omgeving is een nuttig hulpmiddel om de interacties tussen kankercellen en fibroblasten ingebed in collageen gels onderzoeken. In de vorige studie werden drie parameters geëvalueerd in dit experimentele model: collageengel contractie, kankercel invasie en morfologische verandering. Kankercelproliferatie werd ook geschat met behulp van Ki67 immunostaining ^4. Lung weefselmonsters werden verzameld van kankerachtige en niet-kankerachtige gedeelten van ee...

Discussie

CAF vormen een belangrijke component van de ECM omringende kankercellen en niet alleen een ondersteuning voor de tumor, maar ook actief deelnemen aan tumorontwikkeling ^7. Accumuleren bewijs ontrafelt de impact van CAF of hun verwante moleculen op de uiteindelijke prognose, aandacht voor de cruciale rol van de CAF-gemedieerde tumorprogressie ^8.

In eerder onderzoek gebruikten we uitgroei methode long CAF ⁴ isoleren. In dit experiment, de handhaving van weefsels...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796
FBS	GIBCO	10437
Collagen type IA	Nitta gelatin Inc.	CELL-1A
Reconstitution buffer	Nitta gelatin Inc.
Cover slip	NUNC	174934
Silicone grease	Dow Corning Toray	High vacuum grease
Dispase I	WAKO	386-02271
6-well plate	BD Falcon	353046
Cell strainer (70 μm)	BD Falcon	352350