Tracking muisbeenmerg Monocyten In Vivo

Samenvatting

Monocyten zijn belangrijke regulatoren van aangeboren immuniteit en spelen een cruciale rol bij de vernieuwing van het perifere mononucleaire fagocytische systeem en in geval van ontsteking. Dit manuscript beschrijft de procedure van realtime beeldvorming van het muiscalvaria beenmerg om het mechanisme van monocytmobilisatie te bestuderen.

Samenvatting

Real-time multifoton-beeldvorming biedt een geweldige gelegenheid om celverkeer en cel-tot-cel interacties in hun fysiologische 3-dimensionale omgeving te bestuderen. Biologische activiteiten van immuuncellen zijn voornamelijk gebaseerd op hun beweeglijkheid. Bloedmonocyten hebben een korte halfwaardetijd in de bloedbaan; ze ontstaan in het beenmerg en worden er voortdurend uit vrijgegeven. In inflammatoire omstandigheden wordt dit proces versterkt, wat leidt tot monocytose in het bloed en vervolgens tot infiltratie van de perifere inflammatoire weefsels. Het identificeren van de biomechanische gebeurtenissen die het verkeer van monocyten van het beenmerg naar het vasculaire netwerk controleren, is een belangrijke stap om de fysiologisch-pathologische relevantie van monocyten te begrijpen. We voerden in vivo time-lapse beeldvorming uit door middel van twee-foton microscopie van het schedelbeenmerg van de Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue) muis. De MacBlue muis drukt de fluorescente verslaggevers verbeterd cyaan fluorescent eiwit (ECFP) uit onder controle van een myeloid-specifiek promotor ¹, in combinatie met markering van het vasculaire netwerk. We beschrijven hoe deze benadering het mogelijk maakt om individuele medullaire monocyten in real time te volgen om verder het migratiegedrag binnen het beenmergparenchym en de vasculaire structuur te kwantificeren, evenals cel-tot-cel interacties. Deze benadering biedt nieuwe inzichten in de biologie van de beenmergmonocytensubsets en maakt het mogelijk om verder te onderzoeken hoe deze cellen in specifieke pathologische omstandigheden kunnen worden beïnvloed.

Inleiding

Het beenmerg speelt een centrale rol in hematopoëse en vertegenwoordigt het belangrijkste reservoir van monocyten die constitutief circuleren tussen het bloed en het medullaire parenchym, de pool van circulerende monocyten met een korte levensduur vernieuwen ^2,3 en deelnemen aan de reconstitutie van de steady state weefsel-macrofagen en dendritische cellen ⁴. Tijdens ontsteking of na tijdelijke aplasie worden monocyten actief gemobiliseerd uit het beenmerg of de milt ^{5, 6, 7} en koloniseren ontstoken organen. Verschillende chemoattractant-assen zijn betrokken bij het proces van mobilisatie van myeloïde cellen uit het beenmerg ^{8, 5, 6,9}. Voorbij het myeloïde compartiment is het beenmerg ook een belangrijke plaats voor T-lymfocyten priming ¹⁰ en een niche van immunologische herinnering ^11,12. Dus, dit weefsel is centraal voor talrijke onderzoeken op het gebied van hematologie en immunologie. Onze kennis over de structurele organisatie van medullaire myeloïde cellen komt voornamelijk voort uit de analyse van histologische secties van gefixeerde weefsels ¹³. Deze statische weergave staat geen studie toe van de dynamische uitwisseling van cellen tussen de verschillende compartimenten van het beenmerg, wat de basis is van zijn functionele activiteit.

Intravitale beeldvorming vormt een belangrijke biologische input in de studie van celmobiliteit, celadhesie en cel-tot-cel interacties, die eerder alleen werden beschreven uit in vitro systemen. Technische uitdagingen voor goede intravitale beeldvorming omvatten de mogelijkheid om het weefsel van belang in een optisch punt van gezicht te bereiken, en om zijn isolatie te maximaliseren van fysiologische (ademhaling, spier- of peristaltiekcontracties) of mechanische driften (weefselverstoring en uitbreiding na chirurgie, en blootstelling aan microscoopobjectief evenals temperatuur- en vasculaire/oxygenatieverstoringen). Microscopische driften kunnen de mogelijkheid beperken om de focus langdurig te houden en kunnen artefacten introduceren in de kwantificering van celmotiliteit. Een alternatief, gevalideerd voor verschillende weefsels om deze technische moeilijkheden te verminderen, is om te werken op geëxplanteerd weefsel geïncubeerd in een gethermostateerde en geoxygeneerde medium; echter, volledige verstoring van de lymfatische en vasculaire circulatie kan problematisch zijn. Intravitale beeldvorming van het beenmerg van de schedel heeft verschillende voordelen met betrekking tot deze problemen. Ten eerste vereist het minimale chirurgische actie. Ten tweede maakt de dikte van het bot in dit gebied directe visualisatie van beenmergniches mogelijk zonder slijpwerking, waardoor fysiologische verstoringen worden verminderd. Het medullaire netwerk kan worden afgebeeld in de parasagittale regio van het bot; echter zijn de sinusoïden meer zichtbaar in het fronto-parietale gebied waar de botmatrix dunner is^12,14.

Intravitale beeldvorming is gebaseerd op de beschikbaarheid van de meest nauwkeurige fluorescente reporter die de populatie van belang markeert. In vitro markering van gezuiverde celpopulatie vóór adoptieve overdracht leidde tot belangrijke karakterisering van hematopoëtische stamcel niches ¹⁵ of beenmerg-endotheel microdomeinen die tumoraanplanting bevorderen ¹⁶, en leverde verschillende fundamentele inzichten op belangrijke concepten in immunologie ¹⁷. Deze benadering vereist echter meestal honderdduizenden cellen om een kans te krijgen om ze achteraf in vivo te detecteren. Dit kan worden verklaard door de hoge sterfteratio na kleuring, de verdunning in het hele lichaam en de verandering in de activeringstoestand, wat kan leiden tot bevooroordeelde homing. Endogeen markeren van transgenische muizensystemen overwint deze beperkingen enorm en heeft het mogelijk gemaakt om het gedrag van endogene osteoblast ⁸, megakaryocyten ¹⁸ of myeloide-lijn subsets ⁶ te beeldvormen. Niettemin moet men voorzichtig zijn bij het overwegen van de specificiteit van de fluorescente reporter onder de bestudeerde subset.

De Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP, genoemd MacBlue muis ¹, is een waardevol transgeen systeem om medullaire monocyten te bestuderen met real time beeldvorming ⁶. Intraveneuze injectie van hoog moleculair gewicht rhodamine-dextran onderscheidt het medullaire parenchym van het vasculaire sinusoïdennetwerk van het beenmerg. Met behulp van deze benadering is het mogelijk om het monocytengedrag in de verschillende medullaire compartimenten te volgen in een specifiek fysiologisch pathologisch context van belang. Bovendien stellen we een aanvullende strategie voor om monocytendynamiek te vergelijken met die van neutrofielen door in vivo markering met behulp van een specifiek antilichaam.

Protocol

OPMERKING: Alle experiment protocollen werden goedgekeurd door de Franse Dierproeven en ethische commissie en gevalideerd door de "Service Protection et Santé Animales, Environnement" met nummer A-75-2065. Steekproefomvang gekozen reproduceerbaarheid van de proeven te waarborgen, en volgens de 3R dieren ethische regelgeving.

1. Voorbereiding van de Muis

1. Anesthesie
   1. Voor korte beeldvorming (minder dan 1 uur), verdoven de muis met een intraperitoneale injectie van 200 pl van een zoutoplossing met ketamine (100 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg).
   2. Alternatief, gedurende langere beeldvorming (maximaal 4 uur), verdoven de muis met een inhalatie van isofluraan 2.5% verdampt in een 70/30 mengsel van _O2 / _N2 O, via een aangepaste masker.
   3. LET OP: Op deze manier zorgt voor meer stabiele bewusteloosheid en vermijdt seriële intraperitoneale injectie van drugs.
   4. Zodra de muis wordt verdoofd, controleert bewusteloosheid door stimulatie van de voet pad met een kniptang.
2. Vaatverkleuring / extra kleuring
   1. Voor vaatverkleuring: Injecteer intraveneus in de staartader, 200 ui Rhodamine-Dextran (2 MDa, 10 mg / ml in zoutoplossing buffer).
   2. Voor neutrofiel kleuring: injecteer 2 ug Ly6G-PE (kloon 1A8) in 100 pl zoutoplossing intraveneus in de staartader.
3. Immobilisatie
   1. Voor immobilisatie, gebruik dan een op maat gemaakte stereotactische houder aangepast aan de microscoop en de narcosegas inhalator.
      OPMERKING: De sterotactic houder is een metalen steun met twee metalen plaat beugels, een wordt vast en de andere verwijderbare en aanpasbaar, aan het hoofd van het dier vast te zetten.
   2. Installeer het hoofd van de muis tussen de vasthoudplaten tot isolatie zorgen van de ademhaling bewegingen. Draai de oren tussen behoud van platen en ga naar het sk rekkenin. Controleer voor stabiliteit en ademhaling welzijn van het dier.
4. Verwijder de hoofdhuid
   1. Zorgvuldig gebruik van ethanol 70% aan het haar van de hoofdhuid te bevochtigen met een steriele applicator, het vermijden van contact met de ogen.
   2. Snijd de huid met een steriele schaar en tangen op de hoofdhuid van de achterlijke van de pariëtale bot volledig te verwijderen om de frontale bot. Weg te houden tot 3 mm van de ogen en oren om uitgebreide bloeden te voorkomen. Verwijder de losse bindweefsel die de schedel (periost). Spoel de resterende haren met warm PBS-doordrenkte papieren handdoek.
5. Onderdompeling systeem opgezet
   1. Plak een rubberen ring van 18 mm diameter met chirurgische lijm direct op de schedel met een kleine naald om de distributie te beheersen. Lijm de gehele omtrek van de rubberen ring om lekkage te voorkomen (30 ui moet voldoende zijn).
   2. Reinig de schedel onder de ring nog een laatste keer met PBS-doordrenkte papieren handdoek en voeg dan 37 ° C PBS voor een volledige onderdompeling van deschedel. Voeg een daling van 0,9% NaCl-oplossing of specifieke oogzalf op elk oog van de muis om droge ogen te voorkomen. Sleep de stereotactische houder onder de doelstelling.
   3. Ongeveer positioneren het veld met behulp van de microscoop oculair door rechtstreekse toezending.

2. Twee-foton Imaging Acquisition

1. Gebruik een multifoton microscoop in combinatie met een Ti: Sapphire crystal laser, die 140fs pulsen van NIR licht geeft, selectief regelbaar van 680 tot 1080 nm, en een akoestisch-optische modulator voor laser power control. Gebruik een configuratie met 3 externe niet descanned detectoren (NDD) met een combinatie van 2 dichroïsche spiegels (565 nm en 690 nm), 565/610 en 500/550 banddoorlaatfilters (dat gelijktijdige opname van 3 fluorescerende kanalen inschakelen), en een 485 korte pass filter, met een plan apochromaat × 20 (NA = 1) water immersie objectief.
2. Zet de verwarming kamer om goede homeothermie van de ANAES toestaanthetized muis.,
   LET OP: De temperatuur kan worden ingesteld 1 uur voor de beeldvorming sessie voor een betere stabiliteit. In ons geval is 32 ° C gekozen optimale lichaamstemperatuur van de verdoofde muizen (36-37 ° C) af en wordt gehandhaafd gedurende 4 uur. Deze temperatuur kan worden aangepast aan het gebruikte (digitale probe kan worden gebruikt om dit punt te controleren). Bovendien, de verwarmingskamer gebruikte donker / zwart en dekt een deel van het systeem (doelstellingen en gemotoriseerd plaat) externe licht te voorkomen.
3. Schakel het systeem
   1. Zet de Ti: Sapphire laser, dan is het hele microscoop systeem. Start de acquisitie software. Stel de laser golflengte tot 870 nm. Kies de juiste NDD voor opname.
      LET OP: In ons geval, tweede harmonische generatie (SHG) ¹⁹ en cyaan fluorescente eiwit (ECFP) worden gedetecteerd door de NDD na de 485 korte pass filter. ECFP wordt ook gedetecteerd door de NDD na 500/550 banddoorlaatfilter en rhodamine-dextran wordt gedetecteerd door thij NDD na de 565/610 bandfilter.
4. Pas overname instellingen
   1. Gebruik de "live-overname" imaging bevel van de software en het gebruik van de microscoop directionele controle, past u de focus op een regio met ECFP en Rhodamine signaal. Stel het laservermogen aan de minimum beste signaal-ruisverhouding met minimale foto-schade vorderen.
      OPMERKING: De kracht instelling die wordt gebruikt is afhankelijk van de diepte van de regio van belang. Typisch de AOM-instellingen zijn ingesteld rond de 20%, wat een laservermogen dan de doelstelling rond 15 mW vertegenwoordigt. Het is beter om winst macht te vergroten op de PMT's voor elke NDD om foto-bleken en foto-schade te beperken. Typische overname instellingen zijn enkel scannen met een pixelverblijftijd van 1,58 microseconden, en een resolutie van 512 x 512 pixels met een 1,5 vergroting.
5. Kies een regio van belang
   1. Zodra de opname parameters worden ingesteld, gebruik opnieuw de "live" overname commando,en enquête het weefsel tot een gewenste (x, y, z) veld worden gevolgd in real time te kiezen.
      OPMERKING: Typisch, kozen we voor een gebied met inbegrip van zowel vasculaire en parenchymatisch gebieden.
   2. Registreer het veld met de "positie" programmatuur.
      LET OP: Dit commando onthoudt x, y, z-coördinaten van verschillende verafgelegen gebieden.
   3. Selecteer en registreer extra velden van belang (maximaal 3) volgens dezelfde procedure.
   4. Stel een 3D z-stack met de "z-stack" programmatuur op de eerste opgeslagen positie volgens het gewenste volume met de gekozen vergroting. Onthoud diepere positie, en dan de hoogste stand. Normaliseren laservermogen met de diepte.
      OPMERKING: Voor meerdere gelijktijdige beeldveld, verkrijgen we 5 segmenten gescheiden door 3 urn z-stappen voor elk veld tot een volume van 12 urn dikte te verkrijgen. Deze instellingen kunnen worden aangepast aan het type cel bestudeerd.
6. Overname lancering
   1. Selecteer220; tijdreeksen "software commando en kies de duur van de tijd interval en het aantal cycli. Begin time-lapse imaging volgens de time lapse en de duur vereist door het selecteren van de "start experiment" programmatuur.
      LET OP: In ons geval hebben we een volume van elke 30 sec verwerven tijdens 60 cycli vertegenwoordigt 30 min real time. Kleinere time lapse kan worden uitgevoerd om snel cel proefbaan in het bloedvat. In dit geval dunnere z-stack en niet meer dan 2 verschillende velden worden geregistreerd op hetzelfde moment.
   2. Regelmatige controle van de set-up.
      1. Let altijd op het dier om ervoor te zorgen dat het onbewuste.
         LET OP: Het schudden van de snorharen of benen van het dier zijn indicatoren van opwekking. Indien de ademhaling van het dier schokkerig, kan de hoeveelheid isofluraan iets afneemt. Sterke weefsel drift tijdens acquisitie is een indicator van de muis revival.
      2. Zorg ervoor dat het doel goed is ondergedompeld. Renew 37 ° C PBS between twee overnames (30 min).
         OPMERKING: Progressieve verdwijnen van het signaal tijdens de overname is de aanduiding van PBS lekkage.
7. Einde van de procedure
   1. Zodra de benodigde video's worden opgenomen, euthanaseren het dier door cervicale dislocatie snel voordat reanimatie.
      OPMERKING: wondgenezing leidt tot de vorming van een korst in 24 tot 48 uur die de mogelijkheid longitudinale beeldvorming voeren beperkt.

3. Data Analysis

1. Drift correctie
   1. Gebruik Imaris Bitplane software voor 3D-automatische tracking.
   2. Open het 3D-beeld volgorde op Imaris. Selecteer "spot" commando, en genereert handmatig volgen (muisklik + shift) voor alle tijdstippen gedurende ten minste 4 verschillende ankerpunten zo mogelijk homogeen verdeeld in het veld.
   3. Breng de drift correctie met behulp van "juiste drift" opdracht in het tabblad "edit track".
   4. Controleer voor tHij kwaliteit van de correctie in x, y en z name om artefact wankelen voorkomen.
      OPMERKING: Als de correctie niet bevredigend is, probeer dan andere ankerpunten of de video te sluiten van de analyse.
2. Cell tracking
   1. Gebruik "add new spots" commando en selecteer "spoor vlekken na verloop van tijd" algoritme setting. Ga naar de volgende stap.
   2. Solliciteer automatische cell tracking procedure, hetzij op de hele kanaal van belang het gebruik van "bron kanaal" commando. Set voorwerpen (dwz cellen) diameter 10 urn. Ga naar de volgende stap.
      OPMERKING: De keuze hangt af van het onderscheid tussen objecten en specificiteit van het gemeten signaal. Kortom, automatisch volgen van het gehele kanaal is alleen mogelijk als gedetecteerde signaal specifiek is voor het object of interest. Omdat zowel SHG en ECFP worden gedetecteerd door de NDD na 485 korte pass filter, zal volgen specifieker en efficiënter gebruik van de ECFP signaal opgenomen door de NDD na 5 zijn00/550 banddoorlaatfilters. Geclusterd of dichte verpakt voorwerpen zullen handmatige selectie van individuele objecten vergelijkbaar met stap 3.1.2 nodig.
   3. Selecteer "kwaliteit" type filter, zet de drempel tot het volgen van niet-specifieke objecten uit te sluiten. Ga naar de volgende stap.
   4. Kies "Brownse Algorithm Motion" met nauwkeurige parameters van "Maximale afstand" en "Spleetgrootte" tussen twee plekken. Valideren spoor generatie.
   5. Zodra tracks automatisch worden berekend, selecteer "Tijdsduur" type filter, zet de drempel om tracks te elimineren korter dan 120 sec (die 4 keer punten).
   6. Verplichte: Na het automatische volgen, controleren de kwaliteit van de tracks.
      1. Rol de tijdbalk om te controleren of de objecten volgen het spoor paden. Zo niet, gebruik maken van de mogelijkheden van het spoor punt correctie beschikbaar op het tabblad "edit": Verwijder valse of onjuiste tracks met "delete" commando (schrappen een track point individueel met behulp van "disconnect" commando). Als pad van de track is discontinu, voeg ontbrekende tijdstippen (muisklik + shift), selecteert u alle punten op een bepaalde baan, en gebruik "connect" opdracht in het tabblad "edit track".
3. Kwantificering parameters
   1. Selecteer het tabblad "Statistiek" in "Preferences" commando, kies de dynamische parameters die van belang in de lijst. Selecteer "Exporteer alle statistieken naar bestand" commando en sla het Excel-bestand gegenereerd.
      OPMERKING: Verscheidene dynamische parameters worden direct uit de software verkregen zoals trajectlengte, instantane snelheid, gemiddelde snelheid, en volgen rechtheid. Motiliteit coëfficiënt ^{6, 20} kan worden bepaald, maar is niet rechtstreeks door de software.
   2. Voor elke cel, berekent het gemiddelde van de verplaatsingen voor elke tijdsperiode (AT) (voor een 30 sec time lapse film, zal AT zijn 30, 60, 90 sec, etc).Zet de gemiddelde kwadraat van de verplaatsing als een functie van de tijd interval. Verkrijgen motiliteit coëfficiënt door het berekenen van de helling van het lineaire gedeelte van de curve.

Resultaten

Muis schedel structuur biedt een goede gelegenheid om het beenmerg fysiologie te bestuderen door intravitale beeldvorming. Het bot dun rond de voorkant-parietale gebied, is het mogelijk om toegang tot medullaire niches slijtvaste van het bot krijgen. Figuur 1 een breed 2D gebied van de schedel van een MacBlue transgene muis. Het bot matrix bestaat hoofdzakelijk uit collageen I gemakkelijk door SHG ^19. Injectie van rhodamine-dextran kleurt het vasculaire netwerk van het beenmerg en maakt de id...

Discussie

De kritische punten in vivo beeldvorming methodologie stabiliteit van de focus, teneinde de duur van beeldvorming maximaliseren en het risico van bacteriële besmetting en ontsteking, die de dynamiek van de ontstekingscellen kan van invloed minimaliseren. Beeldvorming van de schedel beenmerg volgt deze doelstellingen als de operatie uitgevoerd om toegang tot het beenmerg krijgen is minimaal. Het gebruik van steriel materiaal en antiseptica is essentieel om het risico van infectie die storing kunnen veroor...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Ketamin	Merial		100 mg/ml, anesthetisch middel
Xylazin	Bayer HealthCare		10 mg/ml, anesthetisch middel
Isofluran	Baxter		2,5%, anesthetisch middel
O2/NO2			70/30 mengsel, anesthetisch middel
Rhodamin-Dextran	Invitrogen		2 MDa, 10 mg/ml, vasculaire kleuring
Ly6G-PE	Becton-Dickinson		clone 1A8, neutrofielen kleuring
Stereotactische houder	Zelf gemaakt		chirurgie
Ethanol 70%			chirurgie
Steriele schaar en pincet			chirurgie
Rubberen ring			18 mm diameter, chirurgie
Glubran 2	Queryo Medical		Chirurgische lijm, rubberen ring bevestiging
Kleine naalden	Terumo		chirurgie
Zeiss LSM 710 NLO multifotonmicroscoop	Carl Zeiss		Microscoop
Ti:Saffier kristal laser	Coherent Chameleon Ultra		140 fsec pulsen van NIR licht
Zen 2010	Carl Zeiss		Acquisitie Software
Imaris Bitplane	Bitplane		Analyse Software, 3D automatische tracking
PBS 1X	D. Dutscher		chirurgie
Thermostaatkamer	Carl Zeiss		intravitale beeldvorming