Monocyten zijn belangrijke regulatoren van aangeboren immuniteit en spelen een cruciale rol bij de vernieuwing van het perifere mononucleaire fagocytische systeem en in geval van ontsteking. Dit manuscript beschrijft de procedure van realtime beeldvorming van het muiscalvaria beenmerg om het mechanisme van monocytmobilisatie te bestuderen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Real-time multifoton-beeldvorming biedt een geweldige gelegenheid om celverkeer en cel-tot-cel interacties in hun fysiologische 3-dimensionale omgeving te bestuderen. Biologische activiteiten van immuuncellen zijn voornamelijk gebaseerd op hun beweeglijkheid. Bloedmonocyten hebben een korte halfwaardetijd in de bloedbaan; ze ontstaan in het beenmerg en worden er voortdurend uit vrijgegeven. In inflammatoire omstandigheden wordt dit proces versterkt, wat leidt tot monocytose in het bloed en vervolgens tot infiltratie van de perifere inflammatoire weefsels. Het identificeren van de biomechanische gebeurtenissen die het verkeer van monocyten van het beenmerg naar het vasculaire netwerk controleren, is een belangrijke stap om de fysiologisch-pathologische relevantie van monocyten te begrijpen. We voerden in vivo time-lapse beeldvorming uit door middel van twee-foton microscopie van het schedelbeenmerg van de Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue) muis. De MacBlue muis drukt de fluorescente verslaggevers verbeterd cyaan fluorescent eiwit (ECFP) uit onder controle van een myeloid-specifiek promotor 1, in combinatie met markering van het vasculaire netwerk. We beschrijven hoe deze benadering het mogelijk maakt om individuele medullaire monocyten in real time te volgen om verder het migratiegedrag binnen het beenmergparenchym en de vasculaire structuur te kwantificeren, evenals cel-tot-cel interacties. Deze benadering biedt nieuwe inzichten in de biologie van de beenmergmonocytensubsets en maakt het mogelijk om verder te onderzoeken hoe deze cellen in specifieke pathologische omstandigheden kunnen worden beïnvloed.
Inleiding
Het beenmerg speelt een centrale rol in hematopoëse en vertegenwoordigt het belangrijkste reservoir van monocyten die constitutief circuleren tussen het bloed en het medullaire parenchym, de pool van circulerende monocyten met een korte levensduur vernieuwen 2,3 en deelnemen aan de reconstitutie van de steady state weefsel-macrofagen en dendritische cellen 4. Tijdens ontsteking of na tijdelijke aplasie worden monocyten actief gemobiliseerd uit het beenmerg of de milt 5, 6, 7 en koloniseren ontstoken organen. Verschillende chemoattractant-assen zijn betrokken bij het proces van mobilisatie van myeloïde cellen uit het beenmerg....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
OPMERKING: Alle experiment protocollen werden goedgekeurd door de Franse Dierproeven en ethische commissie en gevalideerd door de "Service Protection et Santé Animales, Environnement" met nummer A-75-2065. Steekproefomvang gekozen reproduceerbaarheid van de proeven te waarborgen, en volgens de 3R dieren ethische regelgeving.
1. Voorbereiding van de Muis
- Anesthesie
- Voor korte beeldvorming (minder dan 1 uur), verdoven de muis met een intraperitoneale injectie van 200 pl van een zoutoplossing met ketamine (100 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg).
- Alternatief, gedurende langere beeldvorming (maximaal 4 uur),....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Muis schedel structuur biedt een goede gelegenheid om het beenmerg fysiologie te bestuderen door intravitale beeldvorming. Het bot dun rond de voorkant-parietale gebied, is het mogelijk om toegang tot medullaire niches slijtvaste van het bot krijgen. Figuur 1 een breed 2D gebied van de schedel van een MacBlue transgene muis. Het bot matrix bestaat hoofdzakelijk uit collageen I gemakkelijk door SHG 19. Injectie van rhodamine-dextran kleurt het vasculaire netwerk van het beenmerg en maakt de id.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De kritische punten in vivo beeldvorming methodologie stabiliteit van de focus, teneinde de duur van beeldvorming maximaliseren en het risico van bacteriële besmetting en ontsteking, die de dynamiek van de ontstekingscellen kan van invloed minimaliseren. Beeldvorming van de schedel beenmerg volgt deze doelstellingen als de operatie uitgevoerd om toegang tot het beenmerg krijgen is minimaal. Het gebruik van steriel materiaal en antiseptica is essentieel om het risico van infectie die storing kunnen veroor.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs willen Anne Daron en Pierre Louis Loyher bedanken voor redactionele ondersteuning, het Plateforme Imagerie Pitié-Salpêtrière (PICPS) voor hulp bij de twee-foton microscoop en het dier faciliteit "NAC" en Camille BAUDESSON voor muizen fokken hulp. Het onderzoek leidde tot deze resultaten heeft de financiering van het zevende kaderprogramma van de Europese Gemeenschap ontvangen (FP7 / 2007-2013) onder subsidieovereenkomst n ° 304.810 - RAID's, en n ° 241440-Endostem, van INSERM aan de Université Pierre et Marie Curie "Emergence ", van la" Ligue contre le cancer ", van" Association pour la Recherche sur le Cancer "en van" Agence Nationale de la Recherche ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Ketamin | Merial | 100 mg/ml, anesthetisch middel | |
| Xylazin | Bayer HealthCare | 10 mg/ml, anesthetisch middel | |
| Isofluran | Baxter | 2,5%, anesthetisch middel | |
| O2/NO2 | 70/30 mengsel, anesthetisch middel | ||
| Rhodamin-Dextran | Invitrogen | 2 MDa, 10 mg/ml, vasculaire kleuring | |
| Ly6G-PE | Becton-Dickinson | clone 1A8, neutrofielen kleuring | |
| Stereotactische houder | Zelf gemaakt | chirurgie | |
| Ethanol 70% | chirurgie | ||
| Steriele schaar en pincet | chirurgie | ||
| Rubberen ring | 18 mm diameter, chirurgie | ||
| Glubran 2 | Queryo Medical | Chirurgische lijm, rubberen ring bevestiging | |
| Kleine naalden | Terumo | chirurgie | |
| Zeiss LSM 710 NLO multifotonmicroscoop | Carl Zeiss | Microscoop | |
| Ti:Saffier kristal laser | Coherent Chameleon Ultra | 140 fsec pulsen van NIR licht | |
| Zen 2010 | Carl Zeiss | Acquisitie Software | |
| Imaris Bitplane | Bitplane | Analyse Software, 3D automatische tracking | |
| PBS 1X | D. Dutscher | chirurgie | |
| Thermostaatkamer | Carl Zeiss | intravitale beeldvorming |
Referenties
- Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. J Leukoc Biol. 83, 430-433 (2008).
- Parihar, A., Eubank, T. D., Doseff, A. I.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
