Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Het analyseren van de effecten van stromale cellen op de recrutering van leukocyten van Flow

9.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52480

⸱

7 januari 2015

 ,  ,  , 
1School of Clinical and Experimental Medicine, University of Birmingham, 2College of Medical and Dental Sciences, University of Birmingham, 3School of Immunity and Infection, University of Birmingham

In dit artikel

Samenvatting

Het vermogen van ontstoken endotheel om leukocyten werven van stroom wordt geregeld door mesenchymale stromale cellen. We beschrijven twee in vitro modellen die primaire humane cellen die kunnen worden gebruikt om neutrofielen werving beoordelen van stroom en onderzoekt de rol van mesenchymale stromale cellen spelen in het reguleren van dit proces.

Samenvatting

Stromale cellen regelen de werving van circulerende leukocyten tijdens ontsteking door middel van cross-talk met naburige endotheelcellen. Hier beschrijven we twee in vitro "vasculaire" modellen voor het bestuderen van de werving van circulerende neutrofielen uit stroom door ontstoken endotheelcellen. Een groot voordeel van deze modellen is de mogelijkheid om elke stap in de leukocyt adhesie cascade analyseren om, zoals zou optreden in vivo. We beschrijven ook hoe beide modellen kunnen worden aangepast om de rol van stromale cellen, in dit geval mesenchymale stamcellen (MSC) bestuderen reguleren rekrutering van leukocyten.

Primaire endotheelcellen werden alleen of tezamen gekweekt met menselijke MSC in direct contact IBIDI microslides of aan weerszijden van een Transwell filter gedurende 24 uur. De kweken werden gestimuleerd met tumornecrosefactor alfa (TNFa) gedurende 4 uur en opgenomen in een stroomgebaseerde adhesietest. Een bolus van neutrofielen werd geperfuseerdvia endotheel gedurende 4 min. De vangst van stromende neutrofielen en hun interacties met het endothelium werd gevisualiseerd door fase contrast microscopie.

In beide modellen, cytokine-stimulatie verhoogde endotheliale rekrutering van neutrofielen stroomt op een dosis-afhankelijke wijze. Analyse van het gedrag gerekruteerde neutrofielen vertoonden een dosisafhankelijke afname walsen en een dosisafhankelijke toename transmigratie door het endotheel. In co-cultuur MSC onderdrukt neutrofiel adhesie aan TNFa-gestimuleerd endotheel.

Onze flow-based-adhesie-modellen na te bootsen de eerste fasen van rekrutering van leukocyten uit de circulatie. Naast leukocyten, kunnen zij worden gebruikt om de rekrutering van andere celtypen, zoals therapeutisch toegediend MSC of circulerende tumorcellen onderzocht. De meerlagige co-cultuur modellen hebben aangetoond dat MSC communiceren met endotheel hun respons op pro-inflammatoire cytokines te wijzigen, Altering de rekrutering van neutrofielen. Verder onderzoek met behulp van dergelijke modellen is nodig om volledig te begrijpen hoe stromale cellen uit verschillende weefsels en voorwaarden (inflammatoire aandoeningen of kanker) invloed hebben op de werving van leukocyten tijdens ontsteking.

Inleiding

Ontsteking is een beschermende reactie op microbiële infectie of weefselschade dat strakke regulering van leukocyten binnenkomst in en vertrek uit het ontstoken weefsel vereist om de resolutie 1,2 toe te staan. Cross-talk tussen de endotheelcellen (EC) die lijn bloedvaten, circulerende leukocyten en weefsel-resident stromale cellen is essentieel voor de coördinatie van dit proces 3. Echter, ongecontroleerde werving van leukocyten en hun ineffectieve klaring ondersteuning van de ontwikkeling van chronische ontstekingsziekten 4. Ons huidige begrip van leukocyt rekrutering in gezondheid en ziekte onvolledig en robuuster modellen zijn nodig om dit te analyseren.

De mechanismen ter ondersteuning van de werving van leukocyten uit het bloed door vasculaire EG in post-capillaire venulen zijn goed beschreven 1,2,5. Circulerende leukocyten worden opgevangen door gespecialiseerde receptoren (bijvoorbeeld, VCAM-1, E-selectine, P-selectine), datzijn up-gereguleerd op ontstoken endotheel. Deze voorbijgaande interacties laten leukocyten te interageren met het oppervlak gebonden chemokinen en lipide-afgeleide mediatoren (hetzij endotheliale of stromale oorsprong) die integrinen van leukocyten 6- 11 expressie activeren. Dit op zijn beurt stabiliseert hechting en drives migratie over het endotheel en in het weefsel 12- 15. Binnen weefsel, aangeworven leukocyten worden onderworpen aan stroma afgeleide middelen die hun beweeglijkheid, functie en overleving 16,17 beïnvloeden. Steeds meer bewijs suggereert sterk dat signalen ontvangen in elke fase van het wervingsproces voorwaarden leukocyten voor de volgende. Echter, ons begrip van leukocytaantrekking blijft onvolledig en is zeer weinig bekend over de componenten vormgeven leukocyten verkeer binnen weefsel.

In Birmingham hebben we verschillende in vitro "vasculaire" modellen ontwikkeld om de rekrutering van leukocyten bestuderen vanstromen 9,18,19. We begrijpen nu dat vasculaire EG-besluit als onmiddellijke regulatoren van leukocytaantrekking reageren op veranderingen in hun lokale micro-omgeving. Specifiek kan weefsel-resident stromale cellen actief reguleren van de ontstekingsreactie, voor een deel door het converseren met naburige vasculaire EG om hun rol te beïnvloeden bij de werving 3. We hebben eerder aangetoond dat verschillende stromale cellen moduleren het vermogen van EG adhesie en migratie van leukocyten ondersteunen in een weefsel-specifieke wijze, en dat deze effecten worden veranderd in chronische ziekten 13,16,20,21. Zo stromale cellen vast weefsel 'adres-codes' die de context van elke ontstekingsreactie 22 definiëren. Onlangs hebben we aangetoond dat beenmerg afgeleide MSC (BMMSC) krachtig neerwaarts reguleren van de respons van EG cytokines, wat een verlaging van het werven van neutrofielen en lymfocyten 23.

De mechanismen govinrichtende recruitment toegelicht in vitro zijn grotendeels gebruikt assays opnemen van een enkele cel type (bijvoorbeeld, EG) of eiwit in isolement. Echter, deze studies geen rekening met de effecten van de lokale weefsel omgeving (dwz de aanwezigheid van stromale cellen) over de recrutering van leukocyten en de daaropvolgende migratie in het weefsel. Hier beschrijven we twee stroomgebaseerde werkwijzen waarbij stromale cellen, mesenchymale stamcellen (MSC), samen worden gekweekt met EC 23. Dergelijke modellen kunnen we het effect van de stromale cellen op endotheliale reacties, in het bijzonder hun vermogen om leukocytaantrekking ondersteunen van stroom te onderzoeken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Isolatie en Cultuur van primaire humane endotheelcellen en mesenchymale stamcellen

  1. Isolatie en kweek van humane navelstreng endotheelcellen (HUVEC):
    1. Zet navelstreng op een dienblad met keukenpapier en spuit met 70% ethanol. Leg ze in een weefselkweek kap. Identificeer de ader en canule aan beide uiteinden. Plaats een kabelbinder om de gecannuleerd einde om het te beveiligen.
    2. Spoel de veneuze bloed met PBS met behulp van een injectiespuit. Vul de spuit met lucht en passeren de ader te verwijderen en gooi de resterende PBS.
    3. Ontdooi 10 mg / ml collagenase type Ia en verdund 1:10 in PBS (met calcium en magnesium chloride) tot een uiteindelijke concentratie van 1 mg / ml. Pass collagenase oplossing in de ader totdat beide buisjes gevuld. Sluit de klemmen op canules aan beide uiteinden.
    4. Bedek de lade met weefsel en nevel met 70% ethanol. Plaats het snoer in een incubator gedurende 20 minuten bij 37 ° C en 5% CO2.
    5. Neem het snoer uitvan de incubator en draai kabelbinders. Masseer zachtjes aan het snoer voor 1 min. Spoelen van de celsuspensie met 10 ml PBS en te verzamelen in een centrifugebuis van 50 ml.
    6. Vul de spuit met lucht en passeren de ader om eventuele resten PBS twee keer te verwijderen, het verzamelen van de PBS in een centrifugebuis van 50 ml gebruikt in stap 1.1.5. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    7. Zuig supernatant en resuspendeer pellet in 1 ml compleet EG medium. EG medium omvat M199 aangevuld met 35 ug / ml gentamicine sulfaat, 10 ng / ml humane epidermale groeifactor, 1 ug / ml hydrocortison, 2,5 pg / ml amfotericine B en 20% foetaal kalfserum.
    8. Voeg 4 ml van EG medium en het EG-ophanging aan een 25 cm 2 kolf. Verander het medium op de volgende dag en dan om de 2 dagen.
    9. EG vertonen een geplaveide-achtige morfologie (figuur 1ai). Voor adhesietesten, worden EC algemeen gezaaid wanneer ze 100% samenvloeiing bereiken (zie paragraaf 1.4 ).
  2. Isolatie van de gelei van Wharton mesenchymale stamcellen (WJMSC) uit menselijke navelstrengen:
    1. Isoleer Wharton-jelly afgeleid MSC (WJMSC) uit verse navelstrengen of van snoeren die al zijn gebruikt om EG te isoleren. Snijd navelstreng in 5 cm lange stukken. Snij elk stuk in de lengte om de bloedvaten te openbaren (2 slagaders [wit, stijve] en 1 ader [geel, opgezwollen]).
    2. Met behulp van een steriele schaar en pincet verwijder de bloedvaten en gooi ze weg. Snijd alle weefsel in 2 - 3 mm 3 stuks. Met behulp van een tang plaats 2-3 mm 3 stuks in een centrifugebuis van 50 ml.
    3. Ontdooi 100 mg / ml stock collagenase type II en verdund 1: 100 in 10 ml PBS tot een eindconcentratie van 1 mg / ml. Ontdooi 20.000 U / ml stock hyaluronidase en verdund 1: 400 tot een eindconcentratie van 50 U / ml in de collagenase oplossing.
    4. Voeg enzymatische cocktail aan de centrifugebuis die de weefselfragmenten. Incubeer het weefsel Fragments gedurende 5 uur bij 37 ° C op een rotator langzaam.
    5. Verdun de celsuspensie 1: 5 in PBS. Plaats een 100 pm porie filter in een nieuwe centrifugebuis van 50 ml. Giet de celsuspensie op de 100 um porie filter.
      OPMERKING: Resterende weefselfragmenten zal op het filter worden bewaard en cellen zullen worden verzameld in de 50 ml centrifugebuis.
    6. Gooi het filter. Centrifugeer de celsuspensie bij 400 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Zuig supernatant en resuspendeer WJMSC pellet in 12 ml compleet WJMSC kweekmedium (DMEM met een laag glucosegehalte, 10% FCS en 100 U / ml penicilline + 100 pg / ml streptomycine mix).
    7. Seed alle cellen in een 75 cm2 weefselkweek kolf. Verander het medium na 24 uur met 12 ml compleet WJMSC kweekmedium. Vervang medium elke 2 - 3 dagen. 80% samenvloeiing binnen 2 weken - De cellen moeten 70 jaar bereiken. Passage wanneer WJMSC bereiken 70-80% samenvloeiing (zie paragraaf 1.4).
  3. Uitbreiding van beenmerg afgeleide MSC (BMMSC):
    1. Isoleer humane beenmerg-afgeleide MSC (BMMSC) zoals eerder beschreven 24. Voeg 10 ml voorverwarmde MSC groeimedium (MSCGM) in een 15 ml centrifugebuis.
    2. Dooi een flacon van p2 BMMSC door het plaatsen in een 37 ° C waterbad gedurende 2 min. Voeg de BMMSC schorsing aan de centrifuge buis met MSCGM. Meng goed door pipetteren.
    3. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Zuig supernatant volledig.
    4. Resuspendeer cellen in 1 ml MSCGM en tel de cellen met een hemocytometer of digitale celteller zoals een cellometer.
    5. Zaad cellen in 75 cm2 cultuur flessen in een dichtheid van 5.000 - 6.000 cellen per cm2 in 12 ml MSCGM. Verander het medium na 24 uur met 12 ml MSCGM. Feed cellen met 12 ml MSCGM elke 2-3 dagen.
    6. Passage wanneer BMMSC bereiken 70-80% samenvloeiing (zie paragraaf 1.4). Cellen vertonen een fibroblastische morfologie (figuur 1Aii).
  4. Detachement van EG en MSC:
    1. Zuig medium van 25 cm 2 kweekflessen. Voeg 2 ml van 0,02% EDTA gedurende ongeveer 2 min. Zuig EDTA en 2 ml trypsine (2,5 mg / ml). Bekijk onder de microscoop totdat de cellen ronde.
    2. Tik op de kolf aan de cellen los. Inactivatie van het trypsine door toevoeging 8 ml kweekmedium (afhankelijk van celtype, EG medium voor HUVEC, DMEM LG voor WJMSC en MSCGM voor BMMSC) de cultuur kolf en ophanging aan een 15 ml centrifugebuis.
    3. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Zuig supernatant en resuspendeer de pellet zoals hieronder beschreven.
      1. Voor de passage van MSC, resuspendeer pellet in 3 ml kweekmedium. Voeg 11 ml kweekmedium in drie afzonderlijke 75 cm 2 kweekflessen. Voeg 1 ml celsuspensie aan iedere kolf (1: 3 split). Passage WJMSC en BMMSC 3 keer (p3) voor gebruik in co-cultuur assays.
      2. Voor het zaaien EG of MSC in adhesietesten - zie de punten 2 en 3.
  5. Bevriezing MSC:
    1. Bij passage 3 Maak MSC zoals beschreven in paragraaf 1.4. Zuig supernatant en resuspendeer in 3 ml ijskoude CryoSFM. Pipetteer 1 ml porties van celsuspensie in 1,5 ml ijskoude cryovials. Zet cryovials in een bevriezing container.
    2. Bewaar de container bij -80 ° CO / N. Transfer naar vloeibare stikstof. Dooi flacon van MSC (follow stappen 1.3.1 - 1.3.6). Hersuspendeer MSC in 5 ml kweekmedium (kies een geschikt medium voor WJMSC of BMMSC) en zaad in een 25 cm 2 kolf.

2. Vaststelling van endotheliale-mesenchymale stamcellen Co-culturen op IBIDI microglaasjes

  1. Trypsinize een samenvloeiende 25 cm2 kolf van EG (~ 1,5 x 10 6 cellen; als paragraaf 1.4). Hersuspendeer EG in 380 ul MSCGM (1 x 25 cm 2 kolf zal twee 6-kanaals IBIDI microglaasjes (~ 1,25 x 10 5 / kanaal), voor adhesietesten alle cel ty zaadpes zijn gekweekt in MSCGM). Voeg 30 ul van EG-ophanging aan elk kanaal (dit zal betrekking hebben op de groei gebied door middel van capillaire werking). Incubeer IBIDI microscoopglaasje bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 1 uur.
  2. Voeg 140 ul MSCGM naar elk kanaal en zuig hem dan uit. Herhaal tweemaal voor een totaal van 3 wassingen. Voeg 140 ul MSCGM en plaats in de incubator bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 24 uur.
  3. Voor co-culturen los MSC (paragraaf 1.4). Voer een celgetal met behulp van een hemocytometer of een cellometer. Stel de concentratie van MSC 1,5 x 10 5 cellen / ml.
  4. Zuig overtollige medium uit de IBIDI kanalen (waardoor alleen de groei gebied van het kanaal in het medium). 30 pl van MSC schorsing toe te voegen aan de IBIDI kanalen. Zuig het medium dat werd verwijderd uit het groeigebied van het kanaal en voeg nog eens 30 pl MSC suspensie. Herhaal opnieuw en plaats de IBIDI microscoopglaasje in de incubator bij 37 ° C en 5% CO2 </ Sub> 1 uur.
  5. Voeg 140 ul MSCGM naar elk kanaal en zuig hem dan uit. Herhaal tweemaal voor een totaal van 3 wassingen. Voeg een eindvolume van 140 pl MSCGM elk kanaal en plaats in de incubator bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 24 uur.
  6. Ontdooi 1 x 10 5 U / ml stock TNFa en verdund 1: 1.000 in MSCGM tot een eindconcentratie van 100 U / ml (equivalent aan ~ 10 ng / ml). Voer een seriële verdunning door verdunning 100 U / ml TNFa van 1:10 in MSCGM tot 10 U / ml. Verdun 10 U / ml TNFa van 1:10 in MSCGM 1 U / ml.
  7. Behandel kanalen met TNFa bij 37 ° C gedurende 4 uur voorafgaande aan de assay. Temperatuurschommelingen tijdens de cytokine behandeling patronen neutrofiele rekrutering waargenomen wijzigen. Voeg verse MSCGM met onbehandelde kanalen.

3. Vaststelling van endotheliale-mesenchymale stamcel Co-culturen op Filters

  1. Los WJ of BMMSC zoals beschreven in paragraaf 1.4. Resuspendeer de pelletin 1 ml MSCGM. Voer een celgetal cellen met een hemocytometer of cellometer.
  2. Het volume aanpassen, zodat de uiteindelijke concentratie is 5 x 10 5 MSC in 500 pi van MSCGM.
  3. Met behulp van een steriel pincet inverteren 6-well, 0,4 micrometer PET Transwell filters en plaats in een steriele doos.
  4. Seed 5 x 10 5 MSC op het buitenoppervlak van de filters. Incubeer filters bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 1 uur.
  5. Verzamel media van het buitenoppervlak van het filter. Tel het aantal niet-hechtende MSC in de media. Re-omkeren filters met behulp van een steriel pincet en plaats in een bijpassende 6-wells plaat met 3 ml MSCGM.
  6. Voeg 2 ml van MSCGM op het binnenoppervlak van het filter (Figuur 1B). Plaats in een incubator bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 24 uur. Trypsinize een samenvloeiende 25 cm2 kolf van EG (figuur 1ai; als paragraaf 1.4).
  7. Resuspendeer EG in 8 ml MSCGM (1 x 25cm 2 fles will zaad vier 6-well filters; ~ 5 x 10 5 EC / filter). Zuig medium van de bovenkant en onderkant van de poreuze filters. Voeg 3 ml vers MSCGM in de onderste kamer (onder het filter). Voeg 2 ml EG suspensie aan het binnenoppervlak van elk filter. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C en 5% CO2.
  8. Zuig medium af te wassen niet hechtende EG en te vervangen door verse MSCGM. Stel parallel EC monocultuur filters door zaaien cellen op het binnenoppervlak zonder eerst enten MSC. Incubeer O / N bij 37 ° C en 5% CO2.
  9. Controleer of de EG-monolaag is samenvloeiende en bevat geen hiaten. Sub-confluente monolagen kunnen niet worden gebruikt voor hechting assays (figuur 1B).
  10. Behandel de bovenste en onderste kamers van de filters met 1, 10 of 100 U / ml TNFa (equivalent aan ~ 10 ng / ml) bij 37 ° C gedurende 4 uur voorafgaande aan de assay (beschreven in punt 2).

4. Isolatie van leukocyten

  1. Neem veneuzebloed van gezonde vrijwilligers en aliquot onmiddellijk in EDTA-buisjes. Omkeren buizen voorzichtig te mengen.
  2. Layer 2,5 ml Histopaque 1077 op 2,5 ml Histopaque 1119 in een 10 ml ronde bodem buis. Laag 5 ml bloed op de Histopaque verloop. Centrifugeer bij 800 xg gedurende 40 min bij kamertemperatuur.
  3. Oogst perifere polymorfonucleaire neutrofielen (PMN) op het snijvlak van Histopaque 1077 en 1119 (boven de erytrocyten laag). Leg ze in een 10 ml ronde bodem buis en vul aan tot 10 ml met PBSA. Zwenk buis en centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  4. Verdund 7,5% BSA-oplossing 1:50 in 100 ml PBS (met calcium en magnesium chloride) tot een eindconcentratie van 0,15% (w / v; PBSA). Zuig supernatant en resuspendeer in 10 ml PBSA. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  5. Resuspendeer in 1 ml PBSA. Neem een ​​20 pl aliquot van de celsuspensie en voeg 380 ul PBSA (1:20 verdunning). Tellen cellen met een hemocytometer of cellometer. Verdun tot het gewenste concentration (1 x 10 6 / ml voor Transwell filters en IBIDI microscoopglaasje) in PBSA. Handhaaf neutrofiel suspensie bij kamertemperatuur tot de test.

5. Montage van de Flow System

  1. Stel de stroom zoals weergegeven in figuur 1C. Zet de verwarming en op 37 ° C. Bevestig een 20 ml spuit (verwijder de zuiger) en een spuit 5 ml van een 3-weg kraan. Bevestig de kraan om de Perspex kamer met behulp van Micropore tape.
  2. Meten en een lang stuk silicium 2/4 mm (dik) slangen dat is ongeveer de afstand tussen de klep en de 3-weg kraan. Snij een 8 - 10 mm lang stuk van 1/3 mm (dun) buizen en invoegen in een uiteinde van de dikke buis. Bevestig de dikke buis zijde op de 3-weg kraan.
  3. Sluit de dunne slang einde op een poort van de elektronische 3-weg microklep. Dit is de "wash reservoir". Snijd een 6-8 mm lang stuk dik en dun slangetje.
  4. Steek de dunne buis in een einde van de dikke buis. Attach de dikke buis eindigen op een spuit 2 ml (verwijder de zuiger).
  5. Sluit het dunne buiseinde van de spuit 2 ml op een poort op de elektronische microklep de "sample reservoir" maken. Sluit de klep aan het filter stroomkamer door het meten en snijden van een lang stuk dunne buis die de afstand tussen de microklep en het centrum van de microscoop podium.
  6. Voor het microscoopglaasje model bevestigen een 8-10 mm dik stuk slang aan het einde van de dunne buis. Een L-vormige connector aan het einde van de dikke buis. Dit zal aansluiten op de microglaasje. Voor de filtermodel Bevestig een 8-10 mm stukje Portex Blue Line Manometer verbindingsslangen aan het einde van de dunne buis.
  7. Plaats de dunne slang uiteinde op de microklep. Dit is de gemeenschappelijke uitgang voor het wassen en monsterreservoirs. Vul reservoirs met PBSA. Prime slangen door stromend PBSA door hen om eventuele luchtbellen te verwijderen.
  8. Bevestig Manometer slang aan een 29 mm (50 ml) glazen syringe. Prime de spuit door het vullen met 10 ml PBSA. Inverteer de spuit zodat het uiteinde verbonden met de buis naar boven wijst en duwen luchtbellen. Vul bij met 5 ml PBSA.
  9. Alleen het microscoopglaasje model, hechten 10 - 12 mm stuk dik slang aan het einde van de Manometer buis die naar de glazen spuit. Een L-vormige connector op het einde van de dikke buis. Plaats de glazen spuit in een injectiepomp voor infusie / terugtrekking.
  10. Bereken de vulling debiet (Q) nodig om de gewenste wandschuifspanning genereren (τ w in Pascal, Pa) van 0,1 Pa (Transwell filters) of 0,05 Pa (IBIDI microslides) volgens de volgende formules:
    γ w = (6.Q) / (wh 2)
    τ = n.γ
    Waar interne w = breedte en h = interne diepte van de stroom kanaal. n = viscositeit van de stromende oplossing; PBSA n = 0,7 mPa.s. Voor de parallelle plaat filter stroom kamer, de breedte (w) is 4 mm en de diepte (h) is 0,133 mm. De depth van de kamer kan iets afwijken als gevolg van verschillen in de dikte van de Parafilm pakking gebruikt. Voor de IBIDI microscoopglaasje, breedte 3,8 mm en diepte 0,4 mm.
    OPMERKING: Vanwege de verschillen in de afmetingen van het stromingskanaal, en capture dynamiek we verschillende schuifspanningen het microscoopglaasje model opzichte van de filter model 6.

6. Opstellen van de parallelle plaat stroom kamer Integratie Filters

  1. Snijd een stuk Parafilm (dezelfde grootte als de glazen dekglaasje) met een metalen mal. Knip een 20 x 4 mm sleuf in de Parafilm (om de stroom kanaal aan te maken) met behulp van een metalen mal. Gebruik de pakking aan het stromingskanaal op de glazen dekglaasje markeren.
  2. Lijn de randen van de 6-well-filter op het glas dekglaasje. Zorg ervoor dat het filter dekt de stroom kanaal markeringen. Knip voorzichtig het filter met behulp van een type 10A scalpel.
  3. Omvatten het filter voorzichtig met een Parafilm pakking, zodat het stromingskanaalsleuf in het midden van het filter (figuur 1D). Gebruik een stuk schone tissue en duw eventuele luchtbellen.
  4. Plaats het dekglaasje in de uitsparing van de bodemplaat van het Perspex stromingskamer. Plaatst u de bovenkant perspex plaat over de bovenkant van de pakking en schroef de platen aan elkaar (figuur 1D).
  5. Draai de 3-weg kraan te laten wassen buffer (PBSA) te laten stromen door de klep. Sluit Manometer slang aan op de inlaatpoort van de top Persex plaat. Ren PBSA door de stroom kanaal te laten bellen door te laten.
  6. Sluit de manometer slang van de injectiepomp in de uitlaatopening van de perspex plaat. Stel de injectiepomp te vullen en druk run. Reinig elke PBSA dat gedruppeld is op de bovenste plaat van de kamer.
  7. Plaats de kamer op het podium van een omgekeerde fase-contrast microscoop. Pas focus naar de EG boven de filters (Figuur 1B) te visualiseren.

7. Opstellen microglaasjes voor Flow

  1. Plaats de microglaasje op het podium van een omgekeerde fase contrast microscoop. Sluit de L-vormige connector in de inlaatpoort van een kanaal. Ren PBSA door de stroom kanaal.
  2. Plaats de L vormige connector van de spuitpomp in de uitlaatopening van het kanaal. Stel de injectiepomp te vullen en druk run. Reinig elke PBSA dat druppels op het veld microglaasje. Pas de focus naar het EG monolaag te visualiseren.

8. Perfusie leukocyten Over endotheelcellen

  1. Breng 2 ml gezuiverd neutrofielen in het monster reservoir en laat opwarmen gedurende 2 minuten. Was het endotheel met PBSA gedurende 2 minuten.
  2. Draai de klep op te neutrofielen perfuseren dan endotheel. Lever de neutrofielen bolus gedurende 4 min. Draai de klep uit en perfuse PBSA van de was reservoir voor de rest van het experiment.
  3. Zorg ervoor dat de luchtbellen niet door de stroom kanaal op enig moment tijdens de test, omdat dit de EC monolay zal verstorenER en oorzaak detachement van aanhangend neutrofielen.

9. Opname Neutrofiel Capture and Behavior

  1. Record recruitment neutrofielen hetzij tijdens neutrofielen stroom of post-perfusie.
  2. Maak alle digitale opnamen van tenminste 5-10 velden in het midden van het stroomkanaal. Bepaal het midden van het kanaal bewegen als doel de rand van het kanaal op de inlaatpoort en identificatie midden van de poort.
    1. Voor het opnemen tijdens neutrofielen stroom, neem foto's van een enkel veld elke 10 sec voor 1 min. Bewegen langs het kanaal en neem een ​​ander veld voor 1 min. Herhaal dit voor de duur van de bolus.
    2. Voor opnamen na perfusie, maakt 10 sec opnemen van 5-10 velden in het midden van het stroomkanaal voor de beoordeling leukocyt gedrag (normaal 2 min na het einde van het neutrofiel bolus). Neem beelden per seconde binnen de 10 sec interval. Dit laat voldoende tijd voor het vastleggen van de stroom en het gedrag van aanhangend neutroPhils te analyseren.
    3. Neem een ​​gebied dat ten minste 10 transmigrated neutrofielen gedurende 5 min, waarbij beelden elke 30 sec. Dit kan worden gebruikt om de snelheid van gemigreerde cellen (hetzij boven of onder het endotheel) berekenen.
    4. Noteer een andere reeks van 10 sec velden (meestal 9 min post-perfusie). Hierdoor neutrofielen tijd migreren door de endotheliale monolaag.
    5. Stoppen met de spuit pomp en verwijder de slang. Demonteer de stroom kamer en spoel het monster reservoir en slangen. Herhaal dit voor de volgende filters / microglaasje kanalen.

10. Analyse van Leukocyte Werving en Gedrag

  1. Tel het aantal neutrofielen in elk veld tijdens de 10 seconden registratie op de 2 min tijdstip. Alle cellen moeten volledig aanwezig in de eerste tweede veld te tellen. Cellen die gedeeltelijk in het veld aan 2 zijden (bijvoorbeeld boven / rechter grens) van het gezichtsveld worden inhet telt, zolang ze in het veld gedurende de volledige 10 sec.
  2. Bereken het gemiddelde aantal hechtende neutrofielen per veld. Meet de lengte en breedte van het opgenomen veld. Bereken de oppervlakte van het veld. Berekenen hoeveel velden er op 1 mm 2. Vermenigvuldig het gemiddelde aantal neutrofielen door het aantal velden in 1 mm 2.
  3. Bereken het totale aantal neutrofielen geperfuseerd door de hoeveelheid neutrofielen geperfundeerde vermenigvuldigen (bijvoorbeeld 2 x 10 6 / ml * Q [bijvoorbeeld 0,0999 ml / min gedurende parallelle plaat stroming kamer]) van de duur van de bolus (bijvoorbeeld 4 min ).
  4. Verdeel het aantal neutrofielen / mm2 door het totale aantal neutrofielen geperfuseerd het totale aantal cellen die gehecht (hechtende cellen / mm 10/02 6 geperfuseerd) te bepalen.
  5. Beoordelen of de aanhanger neutrofielen rollen, stevig aanhanger of transmigrated (Aanvullende Video 1 en 2).
    1. Eenrollend neutrofielen fase helder en langzaam bewegen langs de endotheliale monolaag (1-10 um / sec; aanvullende Video 1).
    2. Stevig hechtende cellen zijn fase heldere en gebonden aan de EG-oppervlak, ofwel stilstaat (dat wil zeggen, niet bewegen tijdens het opnemen) of vormverandering hebben ondergaan en migreert over het EG-oppervlak (zie 1Ei).
    3. Een transmigrated neutrofielen is fase donker en onder de EG-laag (Figuur 1Eii).
  6. Bereken het percentage van de hechtende cellen die zijn rollen, stationaire en transmigrated. Als alternatief kan neutrofielen gedrag worden uitgedrukt als totale aantal cellen dat de verschillende gedragingen vertonen door het toepassen van dezelfde formule gebruikt om de totale adhesie te berekenen (zoals beschreven in de stappen 10,6-10,7).
    1. Markeer de voorrand van een rollende neutrofielen. Markeer de voorrand van dezelfde cel aan het einde van de 10 seconden sequentie. Teken een lijn inzetween de 2 punten en meet de afstand die de cel heeft afgelegd.
    2. Deel deze waarde met de duur van de opname waarbij de cel rolt (bijv 10 sec). Proberen en selecteer neutrofielen die in het veld voor de gehele 10 sec interval.
  7. Om de snelheid van neutrofielen migreren over het oppervlak (in de vorm veranderde fase helder) of onder het endotheel (fase donker) te berekenen gebruik maken van de 5 min opname (Aanvullend Video 2).
    1. Teken de omtrek van gemigreerde cellen bij het begin van de sequentie en volgen de bewegingen gehele sequentie. Noteer de X- en Y-posities van het zwaartepunt bij elk 1 min interval voor elke cel. Trek waarden van de X- en Y-positie van het eerste beeld van de sequentie van de waarden in de tweede afbeelding. Dit is gebaseerd op de stelling van Pythagoras.
    2. Aftrekken van de waarden uit het tweede beeld van de derde afbeelding. Doe dit voor alle beelden in de reeks. Vierkant thij X- en Y-waarden en voeg ze samen.
    3. Vierkantswortel van de resulterende waarde. Bereken de snelheid voor elke cel door het gemiddelde van de snelheden berekend bij elke minuut interval. Track 10 gemigreerd neutrofielen en berekent de gemiddelde snelheid.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In eerste instantie is het effect van het stimuleren van EG met TNFa op de rekrutering van neutrofielen van stroom met behulp van de IBIDI microglaasje model (- 9 hoofdstuk 7) hebben we geanalyseerd. Aangezien TNFa, weinig of geen neutrofielen gehecht aan de endotheliale monolaag (Figuur 2A). Dit werd verwacht, omdat onbehandelde / rusten EG niet de nodige adhesiemoleculen (selectines) of chemokines niet uitdrukken te steunen bindend 25,26. Daarentegen cytokine stimulering aa...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier beschrijven we twee in vitro "vasculaire" modellen voor het bestuderen van de werving van circulerende neutrofielen door ontstoken endotheel. Een groot voordeel van deze modellen is de mogelijkheid om elke stap in de leukocyt adhesie cascade analyseren om, zoals zou optreden in vivo. We hebben eerder waargenomen dosis-afhankelijke toename van neutrofielen hechting aan en transmigratie door TNFa-gestimuleerde EC 9,29. We beschrijven ook hoe beide modellen kunnen worden aangepas...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflicten hebben.

Dankbetuigingen

Navelstrengen werden verzameld met de hulp van de Birmingham Women's Health Care NHS Trust. HMM werd ondersteund door een Arthritis Research UK Career Development Fellowship (19899) en Systems Science for Health, University of Birmingham (5212).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Collagenase Type IaSigmaC2674Verdunn in 10 ml PBS om een eindconcentratie van 10 mg/ml te krijgen. Bewaren bij -20 °C in 1 ml aliquots.
Dulbecco's PBSSigmaD8662Met calcium en magnesiumchloride. Houd steriel en bewaar bij RT.
1X Medium M199Gibco31150-022Verwarm in 37 °C waterbad voor gebruik.
GentamicinesulfaatSigmaG1397Bewaren bij 4 °C. Toevoegen aan M199 500 ml fles.
Humane epidermale groeifactorSigmaE9644Bewaren bij -20 °C in 10 μl aliquots.
Fetaal runder serum (FCS)SigmaF9665FCS moet per batch getest worden om de groei en levensvatbaarheid van geïsoleerde EC te waarborgen. Inactief maken door verhitting bij 56 °C. Bewaren in 10 ml aliquots bij -20 °C.
Amphotericine BGibco15290-026Krachtig en wordt binnen een week toxisch, dus vers compleet HUVEC-medium moet elke week vers gemaakt worden. Bewaren bij -20 °C in 1 ml aliquots.
HydrocortisonSigmaH0135Voorraad is in ethanol. Bewaren bij -20 °C in 10 μl aliquots.
Collagenase Type IISigmaC6885Verdun stock in PBS tot een eindconcentratie van 100 mg/ml. Bewaren bij -20 °C in 100 μl aliquots.
HyaluronidaseSigmaH3631Verdun stock in PBS tot een eindconcentratie van 20.000 U/ml. Bewaren bij -20 °C in 100 μl aliquots.
100 μm celzeef voor 50 ml centrifugeerbuisScientific Lab Supplies (SLS)352360Andere commercieel verkrijgbare celzeef (bijv. Greiner bio-one) kunnen ook gebruikt worden.
DMEM laag glucoseBioseraLM-D1102/500Verwarm in 37 °C waterbad voor gebruik.
Penicilline/Streptomycine mixSigmaP4333Bewaren bij -20 °C in 1 ml aliquots.
25 cc weefselkweekflesSLS353109
75 cc weefselkweekflesSLS353136
Botmarrow mesenchymale stamcelflesLonzaPT-2501Opslaan in vloeibaar stikstof bij aankomst. Cellen zijn bij aankomst in passage 2 maar worden aangeduid als passage 0. Uitbreiden tot passage 3 en opslaan in vloeibaar stikstof voor later gebruik.
Mesenchymale stamcelgroeimedium (MSCGM)LonzaPT-3001Verwarm in 37 °C waterbad voor gebruik. Voor Cell Tracker Green kleuring gebruik medium zonder FCS.
EDTA (0,02%) oplossingSigmaE8008Bewaren bij 4 °C. Verwarm in 37 °C waterbad voor gebruik.
Trypsine oplossingSigmaT4424Bewaren bij -20 °C in 2 ml aliquots. Ontdooi bij RT en onmiddellijk gebruiken.
CryovialsGreiner bio-one2019-02Houd op ijs voordat u de celsuspensie toevoegt.
Mr. Frosty InvriescontainerNalgene5100-0001Bewaren bij RT. Bij het toevoegen van cryovials met cellen bewaren bij -80 °C gedurende 24 uur voordat u de cellen overbrengt naar vloeibare stikstof.
Ibidi u-Slide VI (0,4), T/C behandeld, sterielIbidiIB-80606Alternatieve modellen omvatten glazen capillairen, Cellix Biochips (www.cellixltd.com), BioFlux Plates (www.fluxionbio.com/bioflux/) en GlycoTech parallelle plaat stroomkamers (http://www.glycotech.com/apparatus/parallel.html).
Cel tracker groen kleurstofLife technologiesC2925Bewaren in 5 μl aliquots bij -20 °C. Verdun in 5 ml voorverwarmd (bij 37 °C) MSCGM.
CeltelkamersNexcelomSD-100Alternatief kan een hemocytometer worden gebruikt.
Cellometer auto T4 celtellerNexcelomAuto T4-203-0238
Tumor necrose factor α (TNFα)R&D Systems210-TA-100Verdun stock in PBS tot een eindconcentratie van 100.000 U/ml. Bewaren bij -80 °C in 10 μl aliquots.
6-well, 0,4 μm PET Transwell filtersSLS353090
K2-EDTA in 10ml buisjesSarstedtBewaren bij RT.
Histopaque 1119Sigma11191Bewaren bij 4 °C. Verwarm tot RT voor gebruik.
Histopaque 1077Sigma10771Bewaren bij 4 °C. Verwarm tot RT voor gebruik.
10 ml ronde bodembuisAppleton WoodsSC211 142 AS
7,5% BSA Fractie V oplossingLife technologies15260-037Bewaren bij 4 °C.
20 ml Plastipak spuitenBD falcon300613
5 ml Plastipak spuitenBD falcon302187
2 ml Plastipak spuitenBD falcon300185
3M hypo-allergene chirurgische tape 9 m x 2,5 cmMicropore1530-1Gebruik om de spuitplug op de muur van de perspex kamer te bevestigen.
Siliconen rubberen buis, binnendiameter/buitendiameter (ID/OD) van 1/3 mm (dunne buis)Fisher ScientificFB68854Snijd de siliconen buis op de juiste grootte. Alle buizen die direct naar de elektronische microklep leiden, moeten dun zijn.
Siliconen rubberen buis ID/OD van 2/4 mm (dikke buis)Fisher ScientificFB68855
Portex Blue Line ManometerbuisSmiths200/495/200Buis die naar de spuitpomp leidt.

Referenties

  1. Springer, T. A. Traffic signals on endothelium for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration. Ann. Rev. Physiol. 57, 827-872 (1995).
  2. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
  3. McGettrick, H. M., Butler, L. M., Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. Tissue stroma as a regulator of leukocyte recruitment in inflammation. Journal of leukocyte biology. 91 (3), 385-400 (2012).
  4. Serhan, C. N., Savill, J. Resolution of inflammation: the beginning programs the end. Nature immunology. 6 (12), 1191-1197 (2005).
  5. Schmidt, S., Moser, M., Sperandio, M. The molecular basis of leukocyte recruitment and its deficiencies. Molecular immunology. 55, 49-58 (2013).
  6. Luu, N. T., Rainger, G. E., Nash, G. B. Differential Ability of Exogenous Chemotactic Agents to Disrupt Transendothelial Migration of Flowing Neutrophils. The Journal of Immunology. 164 (11), 5961-5969 (2000).
  7. Smith, C. W., Rothlein, R., et al. Recognition of an endothelial determinant for CD 18-dependent human neutrophil adherence and transendothelial migration. The Journal of clinical investigation. 82 (5), 1745-1756 (1988).
  8. Luscinskas, F. W., Brock, A. F., Arnaout, M. A., Gimbrone, M. A. Endothelial-leukocyte adhesion molecule-1-dependent and leukocyte (CD11/CD18)-dependent mechanisms contribute to polymorphonuclear leukocyte adhesion to cytokine-activated human vascular endothelium. J. Immunol. 142 (7), (1989).
  9. Bahra, P., Rainger, G. E., Wautier, J. L., Nguyet-Thin, L., Nash, G. B. Each step during transendothelial migration of flowing neutrophils is regulated by the stimulatory concentration of tumour necrosis factor-alpha. Cell adhesion and communication. 6 (6), 491-501 (1998).
  10. Piali, L., Weber, C., et al. The chemokine receptor CXCR3 mediates rapid and shear-resistant adhesion-induction of effector T lymphocytes by the chemokines IP10 and Mig. European journal of immunology. 28 (3), 961-972 (1998).
  11. McGettrick, H. M., Smith, E., et al. Fibroblasts from different sites may promote or inhibit recruitment of flowing lymphocytes by endothelial cells. European journal of immunology. 39 (1), 113-125 (2009).
  12. McGettrick, H. M., Hunter, K., Moss, P. a, Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. Direct observations of the kinetics of migrating T cells suggest active retention by endothelial cells with continual bidirectional migration. Journal of leukocyte biology. 85 (1), 98-107 (2009).
  13. McGettrick, H. M., Buckley, C. D., Filer, A., Rainger, G. E., Nash, G. B. Stromal cells differentially regulate neutrophil and lymphocyte recruitment through the endothelium. Immunology. 131 (3), 357-370 (2010).
  14. Tull, S. P., Yates, C. M., et al. Omega-3 Fatty acids and inflammation: novel interactions reveal a new step in neutrophil recruitment. PLoS biology. 7 (8), e1000177(2009).
  15. Ahmed, S. R., McGettrick, H. M. Prostaglandin D2 regulates CD4+ memory T cell trafficking across blood vascular endothelium and primes these cells for clearance across lymphatic endothelium. Journal of immunology. 187 (3), 1432-1439 (2011).
  16. Bradfield, P. F., Amft, N., et al. Rheumatoid fibroblast-like synoviocytes overexpress the chemokine stromal cell-derived factor 1 (CXCL12), which supports distinct patterns and rates of CD4+ and CD8+ T cell migration within synovial tissue. Arthritis and rheumatism. 48 (9), 2472-2482 (2003).
  17. Filer, A., Parsonage, G., et al. Differential survival of leukocyte subsets mediated by synovial, bone marrow, and skin fibroblasts: site-specific versus activation-dependent survival of T cells and neutrophils. Arthritis and rheumatism. 54 (7), 2096-2108 (2006).
  18. Lally, F., Smith, E., et al. A novel mechanism of neutrophil recruitment in a coculture model of the rheumatoid synovium. Arthritis and rheumatism. 52 (11), 3460-3490 (2005).
  19. Chakravorty, S. J., McGettrick, H. M., Butler, L. M., Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. An in vitro. model for analysing neutrophil migration into and away from the sub-endothelial space: Roles of flow and CD31. Biorheology. 43 (1), 71-82 (2006).
  20. Rainger, G. E., Nash, G. B. Cellular Pathology of Atherosclerosis Smooth Muscle Cells Prime Cocultured Endothelial Cells for Enhanced Leukocyte Adhesion. Circulation Research. 88 (6), 615-622 (2001).
  21. Kuravi, S. J., McGettrick, H. M. Podocytes regulate neutrophil recruitment by glomerular endothelial cells via IL-6-mediated crosstalk. Journal of immunology. 193 (1), 234-243 (2004).
  22. Parsonage, G., Filer, A. D. A stromal address code defined by fibroblasts. Trends in immunology. 26 (3), 150-156 (2005).
  23. Luu, N. T., McGettrick, H. M. Crosstalk between mesenchymal stem cells and endothelial cells leads to downregulation of cytokine-induced leukocyte recruitment. Stem cells. 31 (12), 2690-2702 (2013).
  24. Bevilacqua, M. P., Nelson, R. M., Mannori, G., Cecconi, O. Endothelial-leukocyte adhesion molecules in human disease. Annual review of medicine. 45, 361-378 (1994).
  25. Stanness, K. A., Beatty, P. G., Ochs, H. D., Harlan, J. M. An endothelial cell surface factor(s) induced in vitro. 136 (12), 4548-4553 (1986).
  26. Burton, V. J., Butler, L. M. Delay of migrating leukocytes by the basement membrane deposited by endothelial cells in long-term culture. Experimental cell research. 317 (3), 276-292 (2011).
  27. Luu, N. T., Rainger, G. E., Buckley, C. D., Nash, G. B. CD31 Regulates Direction and Rate of Neutrophil Migration over and under Endothelial Cells. Journal of Vascular Research. 40 (5), 467-479 (2003).
  28. McGettrick, H. M., Buckley, C. D., Ed Rainger, G., Nash, G. B. Influence of stromal cells on lymphocyte adhesion and migration on endothelial cells. Methods in molecular biology. 616, 49-68 (2010).
  29. Butler, L. M., McGettrick, H. M., Nash, G. B. Static and dynamic assays of cell adhesion relevant to the vasculature. Methods in molecular biology. 467, 211-228 (2009).
  30. Jeffery, H. C., Buckley, C. D., Moss, P., Rainger, G. E., Nash, G. B., McGettrick, H. M. Analysis of the effects of stromal cells on the migration of lymphocytes into and through inflamed tissue using 3-D culture models. Journal of immunological methods. 400-401, 45-57 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Rekrutering van leukocytenmesenchymale stamcellenendotheelcellenflow adhesieassayneutrofieladhesieTNF alfastimulatiemicroslidemodelfiltermodelfasecontrastmicroscopie
Het analyseren van de effecten van stromale cellen op de recrutering van leukocyten van Flow
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.