Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Technieken voor de Analyse van de extracellulaire blaasjes Met behulp van flowcytometrie

23.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52484

⸱

17 maart 2015

 ,  , 
1Blood Systems Research Institute, 2Department of Medicine, University of California, San Francisco, 3Department of Laboratory Medicine, University of California, San Francisco

In dit artikel

Samenvatting

Veel verschillende methoden bestaan ​​voor de meting van extracellulaire blaasjes (EV) met flowcytometrie (FCM). Verschillende aspecten moeten worden overwogen bij het bepalen van de meest geschikte methode om te gebruiken. Twee protocollen voor het meten van EV's worden gepresenteerd, met behulp van individuele detectie of een kraal-gebaseerde benadering.

Samenvatting

Extracellulaire Vesicles (EV's) zijn kleine, membraan-afgeleide blaasjes gevonden in lichaamsvloeistoffen die zeer betrokken bij cel-cel communicatie en helpen reguleren van een breed scala van biologische processen. Analyse van EV's met behulp van flowcytometrie (FCM) is notoir moeilijk geweest vanwege hun geringe omvang en het ontbreken van discrete populatie positief voor markers van belang. Methoden voor EV-analyse, terwijl aanzienlijk verbeterd in de afgelopen tien jaar, zijn nog steeds een work in progress. Helaas, er is geen one-size-fits-all-protocol, en een aantal aspecten moeten worden overwogen bij het bepalen van de meest geschikte methode om te gebruiken. Hier gepresenteerde zijn verschillende technieken voor de verwerking van EV's en twee protocollen voor het analyseren van EV's met behulp van individuele detectie of een kraal-gebaseerde benadering. De hier beschreven zal helpen bij het elimineren van het antilichaam aggregaten aangetroffen in commerciële preparaten werkwijzen toenemende signaal-ruisverhouding en het instellen poorten rationeel fashion dat detectie van de achtergrond fluorescentie minimaliseert. Het eerste protocol gebruikt individuele detectiemethode die bijzonder geschikt voor het analyseren van een grote hoeveelheid klinische monsters, terwijl het tweede protocol gebruikt een kraal benadering te vangen en detecteren kleinere EV en exosomes.

Inleiding

Extracellulaire Vesicles (EV's) zijn kleine, membraan-afgeleide blaasjes gevonden in lichaamsvloeistoffen die zeer betrokken bij cel-cel communicatie en helpen reguleren van een breed scala van biologische processen. Analyse van EV's met behulp van flowcytometrie (FCM) is notoir moeilijk geweest vanwege hun geringe omvang en het ontbreken van discrete populatie positief voor markers van belang. Methoden voor EV-analyse, terwijl aanzienlijk verbeterd in de afgelopen tien jaar, zijn nog steeds een work in progress. Helaas, er is geen one-size-fits-all-protocol, en een aantal aspecten moeten worden overwogen bij het bepalen van de meest geschikte methode om te gebruiken. Hier gepresenteerde zijn verschillende technieken voor de verwerking van EV's en twee protocollen voor het analyseren van EV's met behulp van individuele detectie of een kraal-gebaseerde benadering. De hier beschreven zal helpen bij het elimineren van het antilichaam aggregaten aangetroffen in commerciële preparaten werkwijzen toenemende signaal-ruisverhouding en het instellen poorten rationeel fashion dat detectie van de achtergrond fluorescentie minimaliseert. Het eerste protocol gebruikt individuele detectiemethode die bijzonder geschikt voor het analyseren van een grote hoeveelheid klinische monsters, terwijl het tweede protocol gebruikt een kraal benadering te vangen en detecteren kleinere EV en exosomes.

EV's, ook wel bekend als microdeeltjes, zijn klein, membraan-afgeleide blaasjes aangetroffen in lichaamsvloeistoffen die betrokken zijn bij cel-cel communicatie en helpen reguleren van een breed scala van biologische processen 1. Door expressie van diverse oppervlakte markers en / of rechtstreekse overdracht van biologisch materiaal, EV kunnen de functie van ontvangende cellen veranderen spelen ofwel activeren of onderdrukken rollen in intercellulaire communicatie 2-4. Klinisch bloedplaatjes afgeleide EV bekend sterke anticoagulerende activiteit 5 hebben, terwijl andere zijn aangetoond te dragen aan een breed scala aan omstandigheden, het bevorderen van tumor metastasis 6 aan het beschermen tegen de ziekte 7. EV's kunnen worden onderverdeeld in kleinere groepen van cellen afgeleide blaasjes zoals exosomes en microvesicles (MV), afhankelijk van hun grootte en het mechanisme van de generatie 8. De nomenclatuur van de cel afkomstige vesikel subpopulaties steeds een onderwerp van debat 8,9, echter, exosomes algemeen beschreven als kleine, 40 tot 100 nm deeltjes afkomstig van endosomale fusie met de plasmamembraan, terwijl MV groter 100 tot 1000 nm deeltjes gevormd door het afstoten van de plasmamembraan 10. Hier wordt de algemene term "EV" worden gebruikt voor alle soorten van extracellulaire biologische blaasjes vrijgegeven door cellen.

Isolatie van EV uit volbloed een meerstaps procedure en vele bewerkingsvariabelen is aangetoond EV inhoud, waaronder opslagtemperatuur en duur 11,12, antistollingsmiddel / conserveermiddel gebruikt 13 en beïnvloedencentrifugatie methode 14. Een behoefte aan standaardisatie van deze variabelen heeft geleid tot de aanbevelingen van de International Society op trombose en hemostase Wetenschappelijk Comité en normalisatie (ISTH SSC) voor een correcte verwerking van bloed en EV isoleringsprocedures 15,16, maar er bestaat geen consensus tussen onderzoekers op het optimale protocol gebruik 12. Meest echter over eens dat strak pre-analytische variabelen zijn cruciaal voor nauwkeurige en reproduceerbare gegevens.

Om EV's te analyseren, hebben de onderzoekers gebruik gemaakt van verschillende methoden, met inbegrip van transmissie elektronenmicroscopie 17, scanning elektronenmicroscopie 18,19, atomic force microscopie, dynamische lichtverstrooiing 20,21 en western blotting 22,23. Terwijl FCM is de voorkeursmethode voor veel onderzoekers 9,24 - 26 vanwege de hoge doorvoer capaciteit, analyse van EV gebruik FCM geweestnotoir moeilijk vanwege hun grootte en het ontbreken van discrete positieve populatie 27-32. Vergeleken analyse van cellen, de kleine afmeting van de EVS leidt 1) minder fluorescentie geëmitteerd door het kleinere aantal antigenen per deeltje en 2) beperkte haalbaarheid van post-vlek wassen, nodig om achtergrondfluorescentie te verminderen. Gemeenschappelijke uitdagingen onder onderzoekers onder meer signalen die voortvloeien uit immunoglobuline aggregaten 27,28 en zelf-aggregatie van antilichamen 29. Bovendien is de lange doorlooptijden en langdurige wassen / isolatieprocedures gebruikt door veel van de huidige protocollen 33,34 vereisen meerdaagse tijdverplichtingen een klein aantal te analyseren, waardoor ze minder dan ideaal voor high throughput toepassingen. Sommige onderzoekers af te zien van een wasstap helemaal, waardoor traditioneel gebruikt FCM negatieve controles, zoals fluorescentie min één (FMO) en antilichaamisotypen nutteloos voor nauwkeurig te beoordelen background fluorescentie 30.

De protocollen richten drie gemeenschappelijke problemen juiste FCM analyse van EV kan belemmeren: signalen die door antilichaam aggregaten en andere niet-vesicles, moeilijk verwijderen van ongebonden antilichaam en het gebrek aan waarneembare positieve populaties. De hier beschreven technieken zullen helpen bij het elimineren van het antilichaam aggregaten aangetroffen in commerciële preparaten, toenemende signaal-ruisverhouding en het instellen poorten beredeneerd dat detectie van de achtergrond fluorescentie minimaliseert. Twee verschillende detectiemethoden worden hier gepresenteerd: het eerste protocol gebruikt individuele detectiemethode is bijzonder geschikt voor het analyseren van een grote hoeveelheid klinische monsters, terwijl het tweede protocol gebruikt een kralen gebaseerde methode voor de weergave en sporen kleiner EV en exosomes.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: De volgende protocollen zijn uitgevoerd in overeenstemming met alle institutionele, nationale en internationale richtlijnen voor het menselijk welzijn. Alle menselijke subject monsters werden getest onder een institutionele Review Board (IRB) -gekeurd protocol en met geïnformeerde toestemming van de proefpersonen.

1. METHODE A: Individuele Detection Method

1.1) Verwerking van Bloedmonster / Isolatie van EV's

  1. Trekken bloed van de donor / patiënt in twee 10 ml glazen buizen met 1,5 ml van ACD-Solution Een of andere geschikte antistollingsmiddel en proces onmiddellijk (binnen 30 min max) met behulp van de volgende 2-step differentiële centrifugatie protocol.
    LET OP: Dit protocol zal ongeveer 10 ml van bloedplaatjes arm plasma (PPP) opbrengst uit de gecombineerde ~ 17 ml bloed getrokken. Indien meer of minder PPP nodig is, kan het aantal buisjes bloed verzameld dienovereenkomstig aangepast.
  2. Centrifugeer de monsters bij 1500 xg gedurende 10 min bij RThet plasma scheiden van de bufferlaag en de rode bloedcellen. Transfer 1,2 ml porties van het bovenstaande plasma tot 1,5 ml centrifuge buizen, dat evenwel niet tot de onderste lagen met de buffy coat en rode cellen verstoren.
  3. Spin bij 13.000 xg gedurende 10 min bij RT bloedplaatjes en grote cel fragmenten verwijderen. Breng zorgvuldig de PPP achterlating 200 pl niet te verstoren de pellet en voeg de PPP naar een nieuwe buis.
  4. Op dit moment, onmiddellijk PPP voor analyse of overdracht in 1.0 ml aliquots nieuwe 1,5 ml centrifugebuizen en bewaar bij -80 ° C gedurende twee jaar voor latere analyse (zie figuur 1A voor overzicht).
  5. Als gezuiverd EV nodig voor functionele experimenten overdracht 6 ml PPP een ultracentrifuge buis en voeg 28 ml van 0,2 urn gefiltreerd fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Centrifugeren gedurende 60 min bij 100.000 xg bij kamertemperatuur met een ultracentrifuge uitgerust met een swinging bucket rotor. Zuig supernatant en resuspendeer EV pellaat in 1,5 ml media.
    OPMERKING: Voor de hoogste reproduceerbaarheid, moeten bloedmonsters zo consequent mogelijk worden verwerkt van de donor tot donor. Variaties in de EV isolatie methode kan van grote invloed zijn het aantal en de aard van de EV's gedetecteerd.

1.2) Het voorbereiden van monsters voor analyse

Opmerking Vanaf dit punt, de stappen toelichten high throughput protocol voor de analyse van 12 monsters voor 14 markers in 3 panelen. Maar andere combinaties van antilichamen die hier worden gebruikt; het protocol kan worden aangepast aan andere EV populaties te bestuderen door het substitueren van de voorgestelde markers voor die plaats.

  1. Verwijder 12 monsters uit diepvriezer (indien opgeslagen bij -80 ° C) en ontdooien bij 37 ° C.
  2. Inhoud pipet op en neer meerdere malen om te mengen. Verwijder 320 pi van elk monster en aan de bovenste rij van een 96 putjesplaat.
    OPMERKING: breedte verstelbare multiwell-pipet is zeer nuttig voor deze en vele andere stappen gehele ezelay, met name bij de analyse van meerdere monsters tegelijk.

1.3) kleuring EV Monsters

  1. Voorafgaand aan vlekken, filteren alle antilichamen (Abs) om aggregaten te verwijderen, die positieve signalen kunnen veroorzaken.
    1. Combineer antilichamen worden gebruikt in elk van de 3 panelen in afzonderlijke 0,22 pm centrifugaal filter en centrifugeer met een vaste hoek single speed centrifuge (~ 750 xg) bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten, of totdat alle Ab mengsel door het filter en zonder antilichaam vloeistof achterblijft op het oppervlak van het filter. Store Ab cocktails in de koelkast voor maximaal twee weken, maar re-filter elke keer voor gebruik.
  2. Voeg de juiste hoeveelheid gefilterd Ab mengsel aan elk putje in rij 2 (bijvoorbeeld monsters Panel I worden gekleurd met 2 pl van elk Ab, dus een totaal van 12 ul van de gefiltreerde Ab cocktail toegevoegd per putje naar rij 2). Zie Figuur 1B voor een overzicht van de voorgestelde plaat kaart. Herhaal deze aanvullings om de rijen eronder als er meer panelen worden uitgebaat (hier, voeg 8 pl / putje van het Panel II cocktail naar rij 3 en 11 pl / putje van het Panel III cocktail naar rij 4; zie Materialen Lijst voor specifieke paneel informatie).
  3. Met de multichannel pipet, meng de PPP monsters in rij 1 op en neer en breng 100 ui van de putjes in rij 1 aan de putjes in rij 2. Meng en neer. Verandering tips en herhaal, overdragen 100 ul van rij 1 tot rijen 3 en 4. Incubeer bij 4 ° C gedurende 30 min.

1.4) Wassen MV Monsters

  1. Verwijder de plaat met 96 putjes bij 4 ° C en overdracht biologische veiligheidskast. Met een multichannel pipet wordt 220 pl PBS / putje rijen 6-8 (te gebruiken voor het spoelen / wassen van de putjes met gekleurd PPP).
  2. De inhoud van elk putje te gelabelde centrifugaal filter buizen met de breedte verstelbare multichannel pipet (voor 12 monsters, met 3 panelen van antilichamen, 12 x 3 = 36 filter eileidersvereist). Met dezelfde tips, verwijder 200 pl PBS wassen van de rijen en aan de corresponderende putten waaruit PPP net werd verwijderd.
  3. Meng en omlaag om de putjes te spoelen en breng de spoeloplossing dezelfde filters waarop de PPP is eerder toegevoegd. Sluiten toppen van centrifugale filters. Verandering tips.
  4. Herhaal dit proces met de resterende lood monsters totdat alle gekleurde PPP monsters zijn overgedragen samen met hun spoeloplossingen centrifugale filters.
  5. Breng de centrifugale filters om een ​​vast rotor centrifuge en centrifugeren bij 850 g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat er geen vloeistof blijft op het filter toppen. Na centrifugeren moet het filter verschijnen naar "dry" met geen zichtbare vloeistoflaag nog bovenop. Hoewel de kans kunnen bepaalde PPP monsters langere centrifugeertijd om effectief bewegen door het filter.
  6. Verwijder de centrifugaal filter buizen en terug te keren naar de biologische veiligheid kabinet.Met de multichannel pipet, resuspendeer de toppen van de filters in 300 pl PBS. Breng de geresuspendeerd inhoud naar vooraf gelabelde buizen voor onmiddellijke FCM analyse.
    Opmerking: Het is zeer belangrijk om de kracht en het aantal pipet zuiger depressies overeenstemming tussen monsters bij monster tot monster variatie voorkomen. Dit zou idealiter worden gemaakt van een elektronische pipet die is geprogrammeerd om op en neer specifiek volume pipet (bijvoorbeeld 280 ui) een geheel aantal keren (bijvoorbeeld 8 keer) voor elk monster.

1.5) Cytometer Setup

  1. Open de FCM-software. Voorafgaand aan de opstelling te experimenteren, uit te voeren dagelijkse kalibratie en setup met setup instrument kralen (volgens de instructies van de fabrikant).
  2. Als ES monsters werden gekleurd met meer dan één antilichaam en meerdere fluorochromen moeten worden gemeten tegelijk berekenen correctiewaarden als volgt:
    1. Voeg 2 druppels van de schadevergoeding kralen voor een pregemerkte buizen (1 buis voor elke fluorochroom-geconjugeerd antilichaam) en voeg de aanbevolen hoeveelheid antilichaam. Voeg 2 druppels van negatieve compensatie kralen aan een andere buis te gebruiken als de ongekleurd compensatieregeling.
    2. Incubeer bij 4 ° C gedurende 30 minuten, wassen met PBS en resuspendeer in 400 ul van PBS.
    3. Met behulp van de flowcytometer software die bij het ​​instrument, voert elke compensatie buis en pas fluorescerende spanningen aan elke piek plaats op ongeveer 10 4 op een 5-decennium log schaal. Zorg ervoor dat de fluorescentie piek hoogste (helder) in zijn eigen kanaal fluorescentie in vergelijking met alle andere kanalen en spanningen van fluorescerende parameters aan te passen indien nodig opnieuw. Run elk individueel gekleurd comping buis en vastleggen van minstens 5.000 evenementen per buis.
    4. Selecteer het tabblad "Experiment", selecteer vervolgens "Compensatie", selecteer vervolgens "Bereken Compensation" op schadevergoeding waarden gelden voor alle monsters.
  3. Stel de voorwaartse verstrooiing (FSC) en zijwaartse verstrooiing (SSC) spanning parameters op schaal te melden en selecteer de laagste drempels toegestaan ​​door de cytometer (FSC = 200 en SSC = 200) voor elk.
  4. Tijdens het uitvoeren van een buis van 0,22 pm gefiltreerd PBS, passen de FSC en SSC spanningen op de hoogste waarden die de meerderheid van achtergrondruis (dat wil zeggen, net onder de spanning drempel waarbij incidentie overtreft 5 events / sec) uitsluiten.
  5. Vervolgens voert u een buis met 0,2 micrometer - 1,0 micrometer kralen, verdund in PBS indien nodig. In een FCS vs. SSC plot, trek een hek rond de kraal bevolking om gebeurtenissen vast te leggen tussen 0,2 micrometer en 1,0 micrometer. Als alternatief, in een SSC-H histogram, trek je een poort naar alle evenementen kleiner dan de 1,0 micrometer kralen bevatten.
  6. Stel het debiet van de cytometer op "Lo" (ongeveer 8-12 pl / min). De kralen buis (of ander buisje dat een bekende concentratie van korrels) Stel het debiet knop op de cytometer tot de avondnt tarief bereikt ongeveer 200 evenementen / sec. Lees alle monster buizen bij hetzelfde debiet en maken gebruik van dezelfde kraal concentratie in toekomstige experimenten te zorgen voor een consistente tussen runs die debieten blijven.
  7. Voer een buis regenboog fluorescerende deeltjes verdund in PBS. Verwerven 5.000 evenementen. Noteer de gemiddelde intensiteit waarden voor FSC, SSC, en elk kleurkanaal. Met deze waarden spanningen in toekomstige experimenten aangepast om die fluorescentie-intensiteiten overeenstemming tussen experimenten blijven.

1.6) Monster Reading

  1. Stel stroomsnelheid van de cytometer op "Lo" (ongeveer 8-12 ul / min) en elk monster gedurende precies 1 of 2 min draaien.
  2. Na de eerste lezing, voeg 20 ui 10% NP-40 aan elk monster, pipet op en neer, en herlezen voor dezelfde tijd (1 of 2 min), om de aftrekking van positieve gebeurtenissen gedetecteerd in de gelyseerde steekproef over een gelijke periode.
    OPMERKING: Het is zeer important dat monsters gemengd worden met een pipet in plaats van een vortex. In onze ervaring, kunnen vortexen veroorzaken zelf-aggregatie van een aantal antilichamen, wat leidt tot-EV nabootsen positieve gebeurtenissen.
  3. Nadat alle monsters zijn gelezen, export .fcs alle bestanden in een apart bestand worden gebruikt voor verdere analyse met behulp FCM-analyse software.

1.7) Data Analysis

  1. Open de FCM analyse software. Importeer alle .fcs bestanden in een nieuw experiment bestand.
  2. Open de kralen alleen-buis. In het FSC-A vs. SSC-A plot, trek een hek rondom alle kralen grootte tussen 0,2 micrometer en 1,0 micrometer. Dit is de EV-poort. Sleep om toe te voegen aan alle monsters.
  3. Met behulp van de gelyseerde monsters als negatieve controles, trekken poorten aan de rand van de achtergrond fluorescentie in elke fluorescentie kanaal gebruikt. Sleep fluorescerende poorten in de EV poort van elke overeenkomstige niet-gelyseerde monster.
    LET OP: Op dit punt is het ook nuttig om twee fluorescerende bi-parameter plots onderzoeken. Raket vormen indubbele-positieve kwadrant (zie figuur 8), met name wanneer de merkers bekend-verbonden celtypen te wonen, kan een aanwijzing artefact door aggregatie of andere vesikels nabootsen evenementen.
  4. Voor elke fluorescerende marker, aftrekken van het aantal gebeurtenissen in de gelyseerde monster van het aantal gebeurtenissen in de niet-gelyseerde monster. Eventueel verdeel dit aantal door het totale aantal EV binnen het niet-gelyseerde EV poort% positieve waarden krijgen.

2. B METHODE: Kralen Methode

2.1) Verwerking van Bloedmonster / Isolatie van EV's

  1. Raadpleeg het bloed verwerkingsmethode in methode A (punt 1.1) beschreven.

2.2) Het voorbereiden van monsters voor analyse

  1. Indien gewenst, fractioneren PPP of ultracentrifugeerd EV's in exosomen en microvesicles. Voeg 250 ul van PPP of geultracentrifugeerd EVs 0,22 pm centrifugale filters en over te dragen aan een vaste rotor centrifuge en draaien op 750 xg gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat er geen vloeistof blijft op het filter toppen. Na centrifugeren moet het filter verschijnen naar "dry" met geen zichtbare vloeistoflaag nog bovenop. Hoewel de kans kunnen sommige monsters een iets langere centrifugeertijd voor het fluïdum effectief bewegen door het filter vereist.
  2. Was ongecoat 6 urn polystyreen korrels (bijvoorbeeld negatief AbC korrels) 2x met RPMI media en resuspendeer in 2 ml. Voeg 6,000 kralen elke FACS buis. De negatieve controle buis, voeg 400 ul van RPMI medium alleen aan de kralen. Om alle andere buizen, voeg 200 ul van PPP of ultracentrifugeerd EV (of fracties) en 200 ul van RPMI media.
  3. Stel het uiteindelijke volume van alle buizen 400 ul met media en incubeer overnacht bij 4 ° C op een schudder.
  4. De volgende ochtend was kralen met 2 ml medium. Zuig het supernatant.
  5. Blokkeren met 5% bovine serum albumine (BSA) in medium (400 ul) gedurende 3 uur bij 4 &# 176, C op een schudder.
  6. Was kralen met 2 ml medium. Zuig en resuspendeer pellet in 100 pl medium.

2.3) kleuring EV Monsters

  1. Filter alle antilichamen. Gebruik hetzelfde antilichaam panelen van methode A, of indien gewenst, maakt een andere combinatie van antilichamen zolang hun fluorochromen verenigbaar zijn met elkaar.
  2. Combineer alle antilichamen voor gebruik in een paneel in een 0,22 urn filter centrifugale buis. Centrifuge met een vaste hoek enkele snelheid centrifugeer gedurende 2 minuten of totdat alle Ab mengsel door het filter en zonder antilichaam vloeistof achterblijft op het oppervlak van het filter.
  3. Voeg het juiste volume gefiltreerd antilichaam cocktail alle buizen en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
  4. Was kralen met 2 ml van de media, resuspendeer in 400 ul van media en onmiddellijk uit te voeren (of binnen dezelfde dag) op stroomcytometer.

2.4) Cytometer Setup en Sample Reading

  1. Open de FCM-software. Voorafgaand aan de opstelling te experimenteren, uit te voeren dagelijkse kalibratie en setup met setup instrument kralen (volgens de instructies van de fabrikant).
  2. Als ES monsters werden gekleurd met meer dan één antilichaam en meerdere fluorochromen moeten worden gemeten tegelijk berekenen correctiewaarden als volgt:
    1. Voeg 2 druppels van de schadevergoeding kralen om vooraf gelabelde buizen (1 buis voor elke fluorochroom-geconjugeerd antilichaam) en voeg de aanbevolen hoeveelheid antilichaam. Voeg 2 druppels van negatieve compensatie kralen aan een andere buis te gebruiken als de ongekleurd compensatieregeling. Incubeer bij 4 ° C gedurende 30 minuten, wassen met PBS en resuspendeer in 400 ul van PBS.
    2. Met behulp van de FCM-software, draaien elke compensatie buis en pas fluorescerende spanningen aan elke piek plaats op ongeveer 10 4 op een 5-decennium log schaal. Zorg ervoor dat de fluorescentie piek is het hoogst (helderste) in zijn eigen tl-kanaal in vergelijking met alle andere kanalen, eneventueel spanningen van fluorescerende parameters instellen weer. Run elk individueel gekleurd comping buis en vastleggen van minstens 5.000 evenementen per buis.
    3. Selecteer het tabblad "Experiment" en vervolgens "Compensatie" en vervolgens "Bereken Compensation" op schadevergoeding waarden gelden voor alle monsters.
  3. Wijzig de FSC en SSC spanning parameters op schaal te melden en selecteer de laagste drempels toegestaan ​​door de cytometer (FSC = 200 en SSC = 200) voor elk.
  4. Run monsters, hek aan de singlet kralen bevolking en het verwerven van 2.000 gebeurtenissen in deze poort. Bestanden export .fcs.
  5. Gebruik FCM analyse software om .fcs analyseren bestanden. Poort op singlet kralen. Bereken de geometrische gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) van elk fluorochroom en vergelijken met de MFI van de negatieve controle.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Figuur 1 schetst de algemene opzet voor de isolatie en detectie van EV behulp van de korrel gebaseerde methode of afzonderlijke detectiemethode verwerking. Individuele detectie van EV gebruik FCM werkt goed voor het analyseren grotere EV maar de meeste cytometers niet kunnen afzonderlijk detecteren deeltjes tot exosomes. Een kraal aanpak kunnen kleine EV's te detecteren, maar er zijn nadelen verbonden met deze methode, zoals aangegeven in tabel 1. In het algemeen, isolatie van...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Twee verschillende protocollen voor de isolatie, de behandeling en analyse van EV's werden gepresenteerd, met behulp van een individuele opsporing of-bead gebaseerde aanpak. Het selecteren van de meest geschikte methode te gebruiken is niet altijd eenvoudig en vereist een goed begrip van het monster wordt ook getest als de individuele subpopulaties van belang. Bovendien moet de gevoeligheid van de cytometer voor verwerving worden overwogen bij het kiezen van de meest geschikte methode. Vaak is er geen enkele beste p...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs willen graag Dale Hirschkorn van Blood Systems Research Institute bedanken voor zijn hulp bij doorstroomcytometer instrument instellingen. Dit werk werd ondersteund door NIH verleent HL095470 en U01 HL072268 en DoD contracten W81XWH-10-1-0023 en W81XWH-2-0028.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
LSR II benchtop flow cytometerBD Biosciences3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm blauw, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violet, en 17 mW JDS Uniphase HeNe 633 nm rood)
FACS Diva software BD BiosciencesPC versie 6.0
FlowJo software Treestar USMac versie 9.6.1 of PC versie 7.6.5
Sphero Rainbow fluorescente deeltjesBD Biosciences556298gebruikt om alle kanaalspanningen aan te passen om de consistentie van de fluorescentie-intensiteit te behouden 
Ultra Rainbow fluorescente deeltjes SpherotechURFP-10-5gebruikt in aanvulling op Megamix-Plus SSC kralen om EV-gating consistentie van batch tot batch te waarborgen
Megmix-Plus SSC kralenBiocytex7803gebruikt om FSC en SSC  spanningen aan te passen om consistentie  tussen runs te behouden. Kan ook worden gebruikt om de stroomsnelheid te controleren en de stroomsnelheidsknop in te stellen om ervoor te zorgen dat in alle runs dezelfde stroomsnelheid wordt gebruikt
AbC Anti-Mouse Bead KitLife TechnologiesA-10344gebruikt voor compensatie controles & negatieve AbC kralen gebruikt voor kralen-gebaseerde methode
Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9)Santa Cruz sc-281108alleen gebruikt in de individuele detectiemethode om monsters te lyseren na de eerste lezing voor gebruik als negatieve controles. Stock kan worden verdund tot 1:10 in PBS en maximaal 1 maand in de koelkast worden bewaard.
BD TruCOUNT TubesBD Biosciences340334gebruikt wanneer absolute EV-concentraties nodig zijn
Ultrafree-MC, GV 0.22 µm Centrifugaal Filter UnitsMillipore UFC30GVNBgebruikt om Evs na het kleuren te wassen en/of EV's te fractioneren op basis van grootte
Vacutainer glas whole blood buizen ACD-ABD Biosciences364606
Facs buizen 12x75 polystreneBD Biosciences352058
50 ml Reservoirs individueel verpakt PhenixRR-50-1s
Green-Pak pipetten tips - 10 µlRaininGP-L10S
Green-Pak pipetten tips -200 µl RaininGP-L250S
Green -Pak pipetten tips - 1,000 µl RaininGP-L1000S
Stable Stack L300 tips voorgesteriliseerdeRaininSS-L300S
Pipet-Lite XLS 8 kanaals LTS Verstelbare Spacer RaininLA8-300XLS
96 wel weefselkweek platenE&K ScientificEK-20180
RPMI 1640 Media (zonder Hepes)UCSF Cell Culture FacilityCCFAE001media gebruikt voor kralen-gebaseerde detectiemethode
Dulbeccos PBS D-PBS, CaMg-vrij, 0.2 µm gefilterdUCSF Cell Culture FacilityCCFAL003
Ultracentrifugebuis, Thinwall, Ultra-ClearBECKMAN COULTER INC344058
PANEEL I
CD3 PerCP-Cy5.5Biolegend3448082 µl
CD14 APC-Cy7Biolegend3018202 µl
CD16 V450BD Biosciences5604742 µl
CD28 FITCbiolegend3029062 µl
CD152 APCBD Biosciences5558552 µl
CD19 A700Biolegend3022262 µl
PANEEL II
CD41a PerCP-Cy5.5BD Biosciences3409302 µl
CD62L APCBiolegend3048102 µl
CD108 PE BD Biosciences5528302 µl
CD235a FITCbiolegend3491042 µl
PANEEL III
CD11b PE-Cy7Biolegend3013222 µl
CD62p APCBiolegend3049102 µl
CD66b PE Biolegend3051062 µl
CD15 FITCexalphaX1496M5 µl
CD9 PEBiolegend555372
CD63 APCBiolegend353008
APC-Cy7 Ms IgG2a, κBiolegend400230

Referenties

  1. Andaloussi, S., Mäger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
  2. Sugawara, A., Nollet, K. E., Yajima, K., Saito, S., Ohto, H. Preventing platelet-derived microparticle formation--and possible side effects-with prestorage leukofiltration of whole blood. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 134 (5), 771-775 (2010).
  3. Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nature Reviews Immunology. 9 (8), 581-593 (2009).
  4. Mause, S. F., Weber, C. Microparticles Protagonists of a Novel Communication Network for Intercellular Information Exchange. Circulation Research. 107 (9), 1047-1057 (2010).
  5. Bouvy, C., Gheldof, D., Chatelain, C., Mullier, F., Dogne, J. -M. Contributing role of extracellular vesicles on vascular endothelium haemostatic balance in cancer. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
  6. Hood, J. L., San, R. S., Wickline, S. A. Exosomes Released by Melanoma Cells Prepare Sentinel Lymph Nodes for Tumor Metastasis. Cancer Research. 71 (11), 3792-3801 (2011).
  7. Gatti, S., Bruno, S., et al. Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury. Nephrology Dialysis Transplantation. 26 (5), 1474-1483 (2011).
  8. Barteneva, N. S., Fasler-Kan, E., et al. Circulating microparticles: square the circle. BMC Cell Biology. 14 (1), 23(2013).
  9. Van der Pol, E., Böing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. Classification functions, and clinical relevance of extracellular vesicles. Pharmacological Reviews. 64 (3), 676-705 (2012).
  10. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  11. Dinkla, S., Brock, R., Joosten, I., Bosman, G. J. C. G. M. Gateway to understanding microparticles: standardized isolation and identification of plasma membrane-derived vesicles. Nanomedicine (London, England). 8 (10), (2013).
  12. Witwer, K. W., Buzas, E. I., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
  13. Shah, M. D., Bergeron, A. L., Dong, J. -F., López, J. A. Flow cytometric measurement of microparticles: Pitfalls and protocol modifications. Platelets. 19 (5), 365-372 (2008).
  14. Dey-Hazra, E., Hertel, B., et al. Detection of circulating microparticles by flow cytometry: influence of centrifugation, filtration of buffer, and freezing. Vascular Health and Risk Management. 6, 1125-1133 (2010).
  15. Lacroix, R., Judicone, C., et al. Standardization of pre-analytical variables in plasma microparticle determination: results of the International Society on Thrombosis and Haemostasis SSC Collaborative workshop. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (6), 1190-1193 (2013).
  16. Mullier, F., Bailly, N., Chatelain, C., Chatelain, B., Dogné, J. -M. Pre-analytical issues in the measurement of circulating microparticles: current recommendations and pending questions. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (4), 693-696 (2013).
  17. Peramo, P., et al. Physical Characterization of Mouse Deep Vein Thrombosis Derived Microparticles by Differential Filtration with Nanopore Filters. Membranes. 2 (1), 1-15 (2012).
  18. Tilley, R. E., Holscher, T., Belani, R., Nieva, J., Mackman, N. Tissue Factor Activity is Increased in a Combined Platelet and Microparticle Sample from Cancer Patients. Thrombosis research. 122 (5), 604-609 (2008).
  19. Rood, I. M., Deegens, J. K. J., et al. Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome. Kidney international. 78 (8), 810-816 (2010).
  20. Van der Pol, E., Hoekstra, A. G., Sturk, A., Otto, C., van Leeuwen, T. G., Nieuwland, R. Optical and non-optical methods for detection and characterization of microparticles and exosomes. Journal of Thrombosis And Haemostasis: JTH. 8 (12), 2596-2607 (2010).
  21. György, B., Szabó, T. G., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).
  22. Miguet, L., Béchade, G., et al. Proteomic Analysis of Malignant B-Cell Derived Microparticles Reveals CD148 as a Potentially Useful Antigenic Biomarker for Mantle Cell Lymphoma Diagnosis. Journal of Proteome Research. 8 (7), 3346-3354 (2009).
  23. Smalley, D. M., Root, K. E., Cho, H., Ross, M. M., Ley, K. Proteomic discovery of 21 proteins expressed in human plasma-derived but not platelet-derived microparticles. Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 67-80 (2007).
  24. Lacroix, R., Robert, S., Poncelet, P., Dignat-George, F. Overcoming Limitations of Microparticle Measurement by Flow Cytometry. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 36 (08), 807-818 (2010).
  25. Mobarrez, F., Antovic, J., et al. A multicolor flow cytometric assay for measurement of platelet-derived microparticles. Thrombosis Research. 125 (3), e110-e116 (2010).
  26. Van der Pol, E., van Gemert, M. J. C., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry. Journal of Thrombosis And Haemostasis: JTH. 10 (5), 919-930 (2012).
  27. György, B., Szabó, T. G., et al. Improved Flow Cytometric Assessment Reveals Distinct Microvesicle (Cell-Derived Microparticle) Signatures in Joint Diseases. PLoS ONE. 7 (11), e49726(2012).
  28. György, B., Módos, K., et al. Detection and isolation of cell-derived microparticles are compromised by protein complexes resulting from shared biophysical parameters. Blood. 117 (4), e39-e48 (2011).
  29. György, B., Pasztoi, M., Buzas, E. I. Response: systematic use of Triton lysis as a control for microvesicle labeling. Blood. 119 (9), 2175-2176 (2012).
  30. Trummer, A., De Rop, C., Tiede, A., Ganser, A., Eisert, R. Isotype controls in phenotyping and quantification of microparticles: a major source of error and how to evade it. Thrombosis Research. 122 (5), 691-700 (2008).
  31. Shet, A. S., Aras, O., et al. Sickle blood contains tissue factor-positive microparticles derived from endothelial cells and monocytes. Blood. 102 (7), 2678-2683 (2003).
  32. Connor, D. E., Exner, T., Ma, D. D. F., Joseph, J. E. The majority of circulating platelet-derived microparticles fail to bind annexin V, lack phospholipid-dependent procoagulant activity and demonstrate greater expression of glycoprotein Ib. Thrombosis and Haemostasis. 103 (5), 1044-1052 (2010).
  33. Nolte-’t Hoen, E. N. M., van der Vlist, E. J., et al. Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, And Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).
  34. Van der Vlist, E. J., Nolte-’t Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).
  35. Orozco, A. F., Lewis, D. E. Flow cytometric analysis of circulating microparticles in plasma. Cytometry Part A. 77 A. 77A (6), 502-514 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Bead-gebaseerde detectieindividuele detectieplaatjesarm plasmaantilichaamkleuringinstelling van de cytometerfluorescerende deeltjespolystyreenbeadsforward scatter
Technieken voor de Analyse van de extracellulaire blaasjes Met behulp van flowcytometrie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.