Technieken voor de Analyse van de extracellulaire blaasjes Met behulp van flowcytometrie

Summary

Veel verschillende methoden bestaan ​​voor de meting van extracellulaire blaasjes (EV) met flowcytometrie (FCM). Verschillende aspecten moeten worden overwogen bij het bepalen van de meest geschikte methode om te gebruiken. Twee protocollen voor het meten van EV's worden gepresenteerd, met behulp van individuele detectie of een kraal-gebaseerde benadering.

Abstract

Extracellulaire Vesicles (EV's) zijn kleine, membraan-afgeleide blaasjes gevonden in lichaamsvloeistoffen die zeer betrokken bij cel-cel communicatie en helpen reguleren van een breed scala van biologische processen. Analyse van EV's met behulp van flowcytometrie (FCM) is notoir moeilijk geweest vanwege hun geringe omvang en het ontbreken van discrete populatie positief voor markers van belang. Methoden voor EV-analyse, terwijl aanzienlijk verbeterd in de afgelopen tien jaar, zijn nog steeds een work in progress. Helaas, er is geen one-size-fits-all-protocol, en een aantal aspecten moeten worden overwogen bij het bepalen van de meest geschikte methode om te gebruiken. Hier gepresenteerde zijn verschillende technieken voor de verwerking van EV's en twee protocollen voor het analyseren van EV's met behulp van individuele detectie of een kraal-gebaseerde benadering. De hier beschreven zal helpen bij het elimineren van het antilichaam aggregaten aangetroffen in commerciële preparaten werkwijzen toenemende signaal-ruisverhouding en het instellen poorten rationeel fashion dat detectie van de achtergrond fluorescentie minimaliseert. Het eerste protocol gebruikt individuele detectiemethode die bijzonder geschikt voor het analyseren van een grote hoeveelheid klinische monsters, terwijl het tweede protocol gebruikt een kraal benadering te vangen en detecteren kleinere EV en exosomes.

Introduction

Extracellulaire Vesicles (EV's) zijn kleine, membraan-afgeleide blaasjes gevonden in lichaamsvloeistoffen die zeer betrokken bij cel-cel communicatie en helpen reguleren van een breed scala van biologische processen. Analyse van EV's met behulp van flowcytometrie (FCM) is notoir moeilijk geweest vanwege hun geringe omvang en het ontbreken van discrete populatie positief voor markers van belang. Methoden voor EV-analyse, terwijl aanzienlijk verbeterd in de afgelopen tien jaar, zijn nog steeds een work in progress. Helaas, er is geen one-size-fits-all-protocol, en een aantal aspecten moeten worden overwogen bij het bepalen van de meest geschikte methode om te g....

Protocol

OPMERKING: De volgende protocollen zijn uitgevoerd in overeenstemming met alle institutionele, nationale en internationale richtlijnen voor het menselijk welzijn. Alle menselijke subject monsters werden getest onder een institutionele Review Board (IRB) -gekeurd protocol en met geïnformeerde toestemming van de proefpersonen.

1. METHODE A: Individuele Detection Method

1.1) Verwerking van Bloedmonster / Isolatie van EV's

1. Trekken bloed van de donor / patiënt in twee 10 ml glazen buizen met 1,5 ml van ACD-Solution Een of andere geschikte antistollingsmiddel en proces onmiddellijk (binnen 30 min max) me....

Results

Figuur 1 schetst de algemene opzet voor de isolatie en detectie van EV behulp van de korrel gebaseerde methode of afzonderlijke detectiemethode verwerking. Individuele detectie van EV gebruik FCM werkt goed voor het analyseren grotere EV maar de meeste cytometers niet kunnen afzonderlijk detecteren deeltjes tot exosomes. Een kraal aanpak kunnen kleine EV's te detecteren, maar er zijn nadelen verbonden met deze methode, zoals aangegeven in tabel 1. In het algemeen, isolatie van.......

Discussion

Twee verschillende protocollen voor de isolatie, de behandeling en analyse van EV's werden gepresenteerd, met behulp van een individuele opsporing of-bead gebaseerde aanpak. Het selecteren van de meest geschikte methode te gebruiken is niet altijd eenvoudig en vereist een goed begrip van het monster wordt ook getest als de individuele subpopulaties van belang. Bovendien moet de gevoeligheid van de cytometer voor verwerving worden overwogen bij het kiezen van de meest geschikte methode. Vaak is er geen enkele beste p.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
LSR II benchtop flow cytometer	BD Biosciences		3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm blue, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violet, and 17 mW JDS Uniphase HeNe 633 nm red)
FACS Diva software	BD Biosciences		PC version 6.0
FlowJo software	Treestar US		Mac version 9.6.1 or PC version 7.6.5
Sphero Rainbow fluorescent particles	BD Biosciences	556298	used to adjust all channel voltages to maintain fluorescence intensity consistency
Ultra Rainbow fluorescent particles	Spherotech	URFP-10-5	used in addition to Megamix-Plus SSC beads to ensure EV gating consistency from batch to batch
Megmix-Plus SSC beads	Biocytex	7803	used to adjust FSC and SSC  voltages to maintain  consistency  between runs. Can also used to monitor flow rate and ajust flow rate dial in order to ensure that same flow rate is used in all runs
AbC Anti-Mouse Bead Kit	Life Technologies	A-10344	used for compensation controls & negative AbC beads used for beads-based method
Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9)	Santa Cruz	sc-281108	used in the individual detection method only to lyse samples after initial reading for use as negative controls. Stock may be diluted to 1:10 in PBS and stored in fridge for up to 1 month.
BD TruCOUNT Tubes	BD Biosciences	340334	used whenver absolute EV concentrations are needed
Ultrafree-MC, GV 0.22 µm Centrifugal Filter Units	Millipore	UFC30GVNB	used to post-stain wash Evs and/or fractionate EVs based on size
Vacutainer glass whole blood tubes ACD-A	BD Biosciences	364606
Facs tubes 12x75 polystrene	BD Biosciences	352058
50 ml Reservoirs individually wrapped	Phenix	RR-50-1s
Green-Pak pipet tips - 10 µl	Rainin	GP-L10S
Green-Pak pipet tips -200 µl	Rainin	GP-L250S
Green -Pak pipet tips - 1,000 µl	Rainin	GP-L1000S
Stable Stack L300 tips presterilized	Rainin	SS-L300S
Pipet-Lite XLS 8 Channel LTS Adjustable Spacer	Rainin	LA8-300XLS
96 well tissue culture plates	E&K Scientific	EK-20180
RPMI 1640 Media (without Hepes)	UCSF Cell Culture Facility	CCFAE001	media used for bead-based detection method
Dulbeccos PBS D-PBS, CaMg-free, 0.2 µm filtered	UCSF Cell Culture Facility	CCFAL003
Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Ultra-Clear	BECKMAN COULTER INC	344058
PANEL I
CD3 PerCP-Cy5.5	Biolegend	344808	2 µl
CD14 APC-Cy7	Biolegend	301820	2 µl
CD16 V450	BD Biosciences	560474	2 µl
CD28 FITC	biolegend	302906	2 µl
CD152 APC	BD Biosciences	555855	2 µl
CD19 A700	Biolegend	302226	2 µl
PANEL II
CD41a PerCP-Cy5.5	BD Biosciences	340930	2 µl
CD62L APC	Biolegend	304810	2 µl
CD108 PE	BD Biosciences	552830	2 µl
CD235a FITC	biolegend	349104	2 µl
PANEL III
CD11b PE-Cy7	Biolegend	301322	2 µl
CD62p APC	Biolegend	304910	2 µl
CD66b PE	Biolegend	305106	2 µl
CD15 FITC	exalpha	X1496M	5 µl
CD9 PE	Biolegend	555372
CD63 APC	Biolegend	353008
APC-Cy7 Ms IgG2a, κ	Biolegend	400230