Dit protocol beschrijft hoe neurale stamcellen kunnen worden gedifferentieerd van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen, om een robuuste en replicerende neurale celpopulatie op te leveren, die kan worden gebruikt om de ontwikkelingspaden te identificeren die bijdragen aan ziekte-ontstaan bij vele neurologische aandoeningen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een gids voor het genereren en gebruiken iPSC Afgeleid NPC's voor de studie van neurologische aandoeningen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Post-mortem onderzoek naar neurologische ziekten is niet ideaal voor het identificeren van de onderliggende oorzaken van ziekte-initiatie, omdat veel ziekten een lange periode van ziekteprogressie omvatten voorafgaand aan het begin van symptomen. Omdat fibroblasten van patiënten en gezonde controles efficiënt kunnen worden gereprogrammeerd tot humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) en vervolgens kunnen worden gedifferentieerd in neurale stamcellen (NPC's) en neuronen voor de studie van deze ziekten, is het nu mogelijk om de ontwikkelingsgebeurtenissen na te bootsen die zich voorafgingen aan het begin van symptomen bij patiënten. We presenteren een methode waarmee hiPSC's efficiënt kunnen worden gedifferentieerd in NPC's, die niet alleen in staat zijn tot verdere differentiatie in functionele neuronen, maar ook robuust kunnen worden gepasseerd, ingevroren en ontdooid of omgezet om te groeien als neurosferen, waardoor snelle genetische screening mogelijk is om de moleculaire factoren te identificeren die invloed hebben op cellulaire fenotypes, waaronder replicatie, migratie, oxidatieve stress en/of apoptose. Van patiënten afgeleide hiPSC NPC's zijn een unieke platform, ideaal geschikt voor het empirisch testen van de cellulaire of moleculaire gevolgen van het manipuleren van genexpressie.
Inleiding
Genexpressiestudies van neuronen onderscheiden in vitro van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) door ons 1 en anderen 2,3 geven aan dat iPSC neuronen lijken foetale eerder dan volwassen hersenweefsel. Momenteel kan iPSC-gebaseerde modellen geschikter voor de studie van aanleg voor, dan laat kenmerken van neurologische ziekte. We hebben eerder gemeld dat een aanzienlijke fractie van de genen profiel van schizofrenie-iPSC afgeleide neuronen is geconserveerd in schizofrenie-iPSC afgeleide neurale progenitorcellen (NPC), wat aangeeft dat NPC nuttig celtype kan worden voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen die bi....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. iPSC Differentiatie naar neurale progenitorcellen
- Groeien en uitbreiden hiPSCs in menselijke embryonale stamcellen (HES) media (tabel 1) samen gekweekt op een muis embryonale fibroblasten (MEF) voedingslaag tot grote (maar subconfluente) kolonies zijn klaar voor neurale differentiatie via een embryoid lichaam (EB) tussenliggende (Figuur 2). Routine iPSC kweekomstandigheden zijn goed elders 16,17 beschreven; kort, groeien hiPSCs in HES media op een MEF feeder laag tot samenvloeiing, vervolgens enzymatisch passage met collagenase (1 mg / ml in DMEM) en uitbreiden van ongeveer 1: 3 elke 7 dagen.
- Poly-L....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Neurale rozetten kunnen morfologisch worden geïdentificeerd met een helderveld microscoop, door hun karakteristieke uiterlijk als ronde clusters van neuro-epitheelcellen met apico-basale polariteit (figuur 1). Hoewel NPC zijn meestal gekweekt bij zeer hoge celdichtheid, onmiddellijk na passage, enigszins piramidale vorm soma en neurieten bipolaire structuur zichtbaar (figuur 1D). Gevalideerde NPC express nestine en SOX2 in de meeste cellen, maar III tubuline kleuring zichtbaar in alle N.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
We hebben beschreven methoden om te differentiëren hiPSCs in NPCs, een neuraal celtype waarin een aanzienlijk deel van het gen handtekening van iPSC-afgeleide neuronen wordt behouden en dat kan dienen als een proxy voor de ontwikkelingstrajecten potentieel bijdragen aan de ziekte pathogenese 8, 11. Bovendien, zoals we hebben beschreven, NPC's zijn een robuust replicatief en gemakkelijk getransduceerde neurale bevolking, die naar onze mening kan geschikt zijn voor moleculaire en biochemische studies van de.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Kristen Brennand is een New York Stem Cell Foundation - Robertson Onderzoeker. Het Brennand Laboratorium wordt ondersteund door een Brain and Behavior Young Investigator Grant, National Institute of Health (NIH) grant R01 MH101454 en de New York Stem Cell Foundation.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
```html
```
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| DMEM/F12 | Life Technologies | #11330 | voor HES-media |
| DMEM/F12 | Life Technologies | #10565 | voor neurale media |
| KO-Serum Replacement | Life Technologies | #10828 | Moet worden getest op partij |
| Glutamax | Life Technologies | #35050 | |
| NEAA | Life Technologies | #11140 | |
| N2 | Life Technologies | #17502-048 | Moet worden getest op partij |
| B27-RA | Life Technologies | #12587-010 | Moet worden getest op partij |
| FGF2 | Life Technologies | #13256-029 | Opnieuw suspenderen in PBS + 1% BSA |
| LDN193189 | Stemgent | #04-0074 | |
| SB431542 | Stemgent | #04-0010 | |
| BDNF | Peprotech | #450-02 | Opnieuw suspenderen in PBS + 0.1% BSA |
| GDNF | Peprotech | #450-10 | Opnieuw suspenderen in PBS + 0.1% BSA |
| Dibutyryl cyclic-AMP | Sigma | #D0627 | Opnieuw suspenderen in PBS + 0.1% BSA |
| L-ascorbinezuur | Sigma | #A0278 | Opnieuw suspenderen in H20 |
| STEMdiff Neural Rosette Selection Reagent | Stemcell Technologies | #05832 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | |
| Collageenase IV | Life Technologies | #17104019 | |
| CF1 mEFs | Millipore | #PMEF-CF | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P3655 | |
| Laminin, Natural Mouse 1 mg | Life Technologies | #23017-015 | |
| BD Matrigel | BD | #354230 | Opnieuw suspenderen op ijs in koud DMEM bij 10 mg/ml, gebruik 1 mg per twee 6-well platen equivalent |
| Weefselkweekbehandelde 6-well platen | Corning | 3506 | |
| Ultra laag hechting 6-well platen | Corning | 3471 | |
| geit anti-Sox2 | Santa Cruz | sc17320 | gebruiken bij 1:200 |
| muis anti-human Nestin | Millipore | MAB5326 | gebruiken bij 1:200 |
| konijn anti-βIII-tubulin | Covance | PRB435P | gebruiken bij 1:500 |
| muis anti-βIII-tubulin | Covance | MMS435P | gebruiken bij 1:500 |
| muis anti-MAP2AB | Sigma | M1406 | gebruiken bij 1:200 |
| Centrifuge voor platen | Beckman Coulter | Beckman Coulter Allegra X-14 (met SX4750 platendrager) |
Referenties
- Brennand, K., et al. Phenotypic differences in hiPSC NPCs derived from patients with schizophrenia. Mol Psychiatry. , (2014).
- Nicholas, C. R., et al. Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneuron....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
