Methodenartikel

Manipulatie en

24.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52496

⸱

9 februari 2015

 ,  , 
1Wellcome Trust/Cancer Research UK Gurdon Institute, University of Cambridge, 2Department of Zoology, University of Cambridge

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven methoden om onrijpe eicellen van Xenopus laevis te manipuleren, in vitro rijping van eicellen tot eieren, en intracytoplasmatische sperma-injectie. Dit protocol maakt degradatie van sommige maternale eiwitten en overexpressie van interessante genen bij bevruchting mogelijk, en is daarom waardevol om de rollen van specifieke factoren in de vroege embryonale ontwikkeling te bestuderen.

Samenvatting

Amfibische eieren zijn veel gebruikt om embryonale ontwikkeling te bestuderen. Vroege embryonale ontwikkeling wordt aangedreven door maternale factoren die tijdens de oogenese zijn opgeslagen. Om de rollen van dergelijke maternale factoren in de vroege embryonale ontwikkeling te bestuderen, is het wenselijk om hun functies vanaf het allereerste begin van de embryonale ontwikkeling te manipuleren. Conventionele methoden van geninterferentie worden bereikt door injectie van antisense oligonucleotiden (oligo's) of mRNA in bevruchte eieren, waardoor respectievelijk onderdrukking of overexpressie van specifieke eiwitten mogelijk is. Deze methoden vereisen echter normaal gesproken meer dan enkele uren voordat de expressie van eiwitten wordt beïnvloed, en daarom is de interferentie van genfuncties niet effectief tijdens de vroege embryonale stadia. Hier introduceren we een experimenteel systeem waarin de expressieniveaus van maternale eiwitten kunnen worden gewijzigd vóór de bevruchting. Xenopus laevis eicellen verkregen uit eierstokken worden gedefolieculeerd door incubatie met enzymen. Antisense oligo's of mRNA's worden geïnjecteerd in degefolieculeerde eicellen in het germinale vesikel (GV) stadium. Deze eicellen worden in vitro gerijpt tot eieren in het metafase II (MII) stadium, gevolgd door intracytoplasmatische sperma-injectie (ICSI). Op deze manier kan tot 10% van de ICSI-embryo's de zwemmende kikkervisjesfase bereiken, waardoor functionele tests van specifieke genknockdown of overexpressie mogelijk zijn. Deze benadering kan een nuttige manier zijn om de rollen van maternale factoren in de vroege embryonale ontwikkeling te bestuderen.

Inleiding

Xenopus laevis is een veel gebruikte, krachtige modelorganisme ontwikkeling 1 te bestuderen. Dit komt omdat Xenopus eieren zijn ongewoon groot (ongeveer 1,2-1,4 mm, in vergelijking met zoogdiertegenhangers zijn ongeveer 0,1 mm) en overvloedig. Eieren bevatten moeder gesynthetiseerd en opgeslagen componenten, die genoeg om de embryonale ontwikkeling te rijden tot medio blastula overgang zijn (MBT, die zich in het stadium 8-8,5 met 4000-8000 cellen). MBT wordt vergezeld zygote genoomactivatie maakt vervolgens het embryonale genproducten die verdere ontwikkeling leiden.

Talrijke studies gericht op het moederlijke factoren belangrijk voor de ontwikkeling identificeren. Veel studies vertrouwen op de injectie van antisense oligonucleotiden (oligo's), waaronder morfolino oligonucleotiden in bevruchte embryo, waarbij afbraak van maternale eiwitten worden waargenomen in de gastrulastadium 2-4. Als alternatief worden mRNA geïnjecteerd om bevruchte embryos om gen functies verstoren of om lot van overexpressie eiwitten op te sporen. De injectie in de één-cel embryo's gewoonlijk geen invloed op expressie van maternale eiwitten in de zeer vroege embryonale stadium vóór MBT.

Heasman en Wylie opgericht de host overdracht methode om dit probleem 5 overwinnen. In de werkwijze worden handmatig defolliculated oocyten geïnjecteerd met antisense oligo en overgebracht naar ontvangende vrouwtjes 6. Eiwitten zijn gedownreguleerd vóór de bevruchting, zodat rollen van downregulated eiwitten in de vroege embryonale ontwikkeling kan worden onderzocht. Deze maternale verarmingswerkwijze geleid tot de identificatie van verschillende unieke ontwikkelende rol van maternale proteïnen, zoals besproken in 7.

In dit rapport hebben we detail onze recent ontwikkelde methode, waarbij de moeder uitputting of overexpressie van mRNA vóór de bevruchting wordt bereikt zonder handmatige defolliculation en gastheer overdracht8. Handmatig defolliculation vergt veel tijd en gastheer overdracht moet vaak bekwame technieken en de specifieke licentie voor dier operatie, waardoor het veelvuldig gebruik van maternale uitputting methode belemmeren. Defolliculation en gastheer overdracht gesubstitueerd door enzymatische defolliculation 9,10 en intracytoplasmatische sperma-injectie (ICSI) 11-13, respectievelijk. ICSI eieren werd oorspronkelijk gebruikt om transgene kikkers 12 produceren. Sperma en embryo kernen werden ook getransplanteerd in in vitro gerijpt amfibie eicellen 11,14,15. Hier tonen we stap voor stap methode sperma in vitro gerijpte oöcyten die werden geïnjecteerd vooraf geïnjecteerd met antisense oligo's of mRNA.

Protocol

OPMERKING: Alle experimenten met kikkers werd volgende eisen van de Britse ministerie van Binnenlandse Zaken uitgevoerd.

1. Bereiding van Xenopus laevis Eicellen

  1. Ongeveer een week voor de eicel collectie, injecteren vrouwelijke kikkers met 150 U van drachtige merrie Serum Gonadotropine (PMSG) voor pre-priming met behulp van 1 ml steriele spuit met een 27 G naald. Injectie wordt subcutaan gedaan naar dorsale lymfe weg.
    LET OP: Het is optimaal om kikkers die geen eieren had gelegd voor een lange tijd (ten minste meer dan een half jaar) of die nooit hebben eieren gelegd alvorens te gebruiken.
  2. Kant-en-gegrond kikkers in een watertank ingesteld op 18 ° C in het licht gecontroleerde kamer (07:00-19:00: op, 19:00-07:00: uit).
  3. Op de dag van de eicel collectie, voor te bereiden 1 liter 1x gewijzigd Barth's Solution (MBS) uit 10x MBS voorraad door verdunning met dubbel gedestilleerd water (DDH 2 O), en voeg penicilline en streptomycine met de uiteindelijke concentratie van 10 ug / mlelke (MBS + PS). 10x MBS voorraad bestaat uit 880 mM NaCl, 10 mM KCl, 24 mM NaHCO3, 8,2 mM MgSO4 .7H 2 O, 3,3 mM Ca (NO 3) 2 .4H 2 O, 4,1 mM CaCl2 .6H 2 O, 100 mM HEPES, pH 7,5.
  4. Verdoven een vooraf geprepareerd kikker door subcutane injectie van 120 mg (in 400 pl) van tricaïne methaansulfonaat (MS222). Houd de geïnjecteerde kikker in een kleine tank met water.
  5. Na 10 min, controleer dan de verdoofde kikker door hem over sinds succes verdoofde kikkers niet reageren op dit. Als anesthesie is onvolledig, ijsblokjes toevoegen in de tank en wacht nog eens 10 min.
  6. Pick-up van de kikker uit de kleine tank en plaats in dorsale decubitus op een vochtig doekje.
  7. Met behulp van een tang en een kleine chirurgische schaar, neem de huid en een kleine incisie (2 cm) in het onderste gedeelte van de buik, lateraal van de middellijn. Maak nog een incisie aan de andere kant.
  8. Na het snijden van de huid, til de spierlaag with pincet en maken de incisie in de spierlaag.
  9. Let op de eierstok na de spierlaag wordt gesneden en trek de eierstok uit de incisies met behulp van een tang.
  10. Overdracht geëxtraheerd eierstok in een 50 ml buis met MBS oplossing.
    OPMERKING: Probeer zoveel eierstok te verzamelen als mogelijk uit beide insnijdingen.
  11. Slacht de vrouwelijke kikker door verbloeding, gevolgd door bevriezing voor verdere geschikte verwijdering.
  12. Spoel de uitgepakte eierstok een paar keer met MBS + PS totdat het bloed wordt weggespoeld. Breng dan de eierstok een 9 cm petrischaal met MBS + PS
    OPMERKING: Controleer de kwaliteit van eicellen onder een dissectiemicroscoop op dit punt. Als eicellen zijn blijkbaar slechte kwaliteit, zoals eicellen met ongelijke pigmentatie in het dier de helft (figuur 1A), hoeft niet verder te verwerken en een nieuwe eierstok plaats te verkrijgen. Idealiter zou eicellen even gepigmenteerde dier hersenhelften hebben en ongeveer even groot.
  13. Plagen de eierstok in kleine stukjes(1-2 cm2) en verzamel 5 ml van oöcyten in een nieuwe buis van 50 ml.
  14. Spoel 5 ml van de gescheurde eierstok enkele malen met MBS + PS en MBS toevoegen + PS 15 ml.
  15. Voeg 7 eenheden van het enzym voor defolliculation aan de eierstok suspensie (zie Materials List).
    OPMERKING: Reconstitueer gevriesdroogd enzym met 10 ml van DDH 2 O (28 eenheden / ml). Plaats het flesje gedurende 30 minuten op ijs met af en toe voorzichtig om te zwenken. Aliquot 250 ul en bewaar bij -80 ° C tot gebruik.
  16. Incubeer de eierstok stuk met het enzym gedurende 1 uur onder zacht schudden op het schudapparaat (snelheid 15 REV / min, overeenkomend met ongeveer 0.014 xg).
    OPMERKING: Bij nagenoeg volledige verwijdering van follikel cellen 2 uur tot 2 uur 15 min incubatie met het enzym normaliter niet vereist. Langere incubatietijd is nodig voor eicel kernoverdracht experiment 16.
  17. Na 1 uur incubatie, pick-up een klein aantal behandelde eicellen (10-20 eicellen) en overbrengen in een 6 cm petrischaal met MBS + PS Controleer de extent van defolliculation onder een stereomicroscoop. Als oöcyten worden gescheiden van elkaar en ten minste gedeeltelijk defolliculated (Figuur 1B), onmiddellijk over tot het volgende halte reactie (stap 18). Als oöcyten nog sterk omringd door follikel cellen incubeer een extra 15 min maximaal.
  18. Tal van MBS + PS toevoegen aan de reactie te stoppen en gooi het supernatant. Herhaal het wassen voor 10 keer.
    OPMERKING: Voeg MBS + PS door uitgieten aan de wand van een buis van 50 ml, maar niet rechtstreeks aan oöcyten. Na suspensie in MBS + PS, kleine onrijpe eicellen neiging te zweven boven in wasbuffer en gooi dergelijke kleine drijvende oöcyten.
  19. Na het wassen, over te dragen aan een 9 cm petrischaal met MBS + PS
    Opmerking Vanaf deze stap verder, houden oöcyten bij 16-18 ° C zoveel mogelijk. Dit kan gedaan worden door het houden van de oöcyten met schotel op een temperatuurgeregelde fase.
  20. Selecteer fase VI eicellen volgens Dumont's classificatievoor de volgende toepassingen en transfer naar een nieuwe 9 cm petrischaal met MBS + PS Eicel overdracht kan worden gedaan met behulp van een glazen pipet met een geschikt formaat tip (groter dan de eicel grootte).
    OPMERKING: Goede kwaliteit eicellen moet een gelijkmatig gepigmenteerde dier halfrond met duidelijke contrast tussen het dier halfrond en de plantaardige halfrond hebben, en worden ongeveer even groot (figuur 1C). Fase VI eicellen vertegenwoordigen volgroeid eicellen die kunnen reageren op progesteron (eicel diameter is ongeveer 1,2-1,4 mm).

2. Injectie van antisense-oligonucleotiden of mRNA in Eicellen

LET OP: Alle stappen in deze sectie moeten worden gedaan op 16-18 ° C op een microscoop podium uitgerust met temperatuurgestuurde circulerende water of op een plastic doos gevuld met ijs.

  1. Overdracht 200-300 geselecteerde eicellen in een nieuwe 9 cm petrischaal gevuld met MBS + PS, waarbij micro-injectie wordt uitgevoerd.
    LET OP: In each staat, worden 200-300 eicellen normaal gebruikt. In totaal zijn ongeveer 1.000 eicellen gebruikt in een experiment.
  2. Voor het bereiden van de injectie van antisense oligo's of mRNA, werpen de metalen zuiger van een microinjector.
  3. Vul een glas capillair met minerale olie met behulp van spuit en plaats de glazen capillair gevuld met olie aan de metalen zuiger van microinjector.
    OPMERKING: Een glazen capillair wordt getrokken door micropipet trekker. Deze naalden worden in een doos bewaard zonder beschadiging tips.
  4. Snij de punt van de naald met kleine chirurgische schaar onder een microscoop door te streven kleine diameter tip voor injectie mogelijk.
    OPMERKING: De naald kan worden aangescherpt door het gebruik van een micro smederij of micropipet beveler. Om de naald onder een schuine hoek van 25 ° verbetert de capaciteit van het penetreren van de eicel wand.
  5. Plaats een kleine strook Parafilm op het podium van een dissectie microscoop en breng een 3 ui druppel van de antisense oligo of mRNA oplossing.
  6. Verplaats de tip van de injectienaald in de kleine druppel oplossing en vul de naald met de oplossing te injecteren.
    Opmerking: Als de punt van de injectienaald te klein is, moet luchtbellen aan het uiteinde van de metalen plunjer. Maak dan een grotere tip over de injectienaald totdat dit niet gebeurt.
  7. Markeer de injectienaald ongeveer 0,5 mm van de punt. Dit merkteken wordt gebruikt als indicator van injectiediepte.
  8. Steek de punt van de naald in een oöcyt langs de equatoriale grens door te streven naar het middelpunt van de eicel (onder de kiemblaasje) onder zacht houdt de tegenoverliggende zijde van de eicel bij het injectiepunt met een tang voor het voorkomen van ongewenste beweging eicel tijdens de injectie .
    OPMERKING: Vind het gebied dat vrij is van follikel cellen (Figuur 1B) en steek de naald van die plek, omdat zelfs een fijne naald kan niet vaak dringen een laag van follikel cellen.
  9. Eject 4.6 ng / 4.6 nl of 9.2 ng / 9.2 nl van anti'sense oligo's, of een geschikt volume van mRNA (250 pg tot 13,8 ng) met behulp van de voetschakelaar. Details van antisense oligo bereiding worden beschreven in 7.
  10. Breng de geïnjecteerde oöcyten in een schaal 6 cm Petri vol MBS + PS aangevuld met 0,1% BSA (Oocyte incubatiemedium, steriliseren van de oplossing met een 0,45 um poriën filter).
  11. Incubeer de oöcyten 16 ° C of 18 ° C gedurende 1-2 dagen.
    OPMERKING: Geïnjecteerde oöcyten kunnen worden onderworpen aan in vitro rijping enkele uren na injectie, waarbij injectie van 4,6 ng antisense oligo voorkeur. Een algemene regel is dat hoe korter de incubatietijd, hoe beter de verdere embryonale ontwikkeling.

3. In vitro maturatie (IVM) van Eicellen

  1. Op de avond van de eicel rijping experiment, haal progesteron voorraad-oplossing (30 mM in ethanol) van -80 ° C vriezer en los neerslagen bij kamertemperatuur temtuur met af en toe een vortex.
    OPMERKING: De progesteron voorraad wordt normaal bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten tot 1 uur.
  2. Voeg 5 ul van de progesteron voorraad in 50 ml MBS + PS (Rijping medium, de uiteindelijke concentratie progesteron 3 uM) en schud de shaker gedurende 30 min progesteron verdeel eveneens in de oplossing.
  3. Bereid-agarose gecoate 6 cm schalen voor in vitro rijping.
    1. Voeg 1 g agarose met 50 ml 1 x MBS zonder magnesium en calcium.
    2. Los agarose door verwarmen in een magnetron.
    3. Giet een klein volume van de agarose oplossing van 6 cm schalen onderaan gerechten dekken.
    4. Wacht minstens 30 minuten tot stollen.
    OPMERKING: Agarose coating voorkomt kleven van eicellen om gerechten. Eenmaal in vitro gerijpte oöcyten stevig aan gerechten, is het zeer waarschijnlijk dat eicellen worden geactiveerd door de stimuli die zij ontvangt gedurende de onthechting van dishes.
  4. Giet 5-8 ml Rijping medium agarose-beklede schalen en breng 200-300 eicellen in elk 6 cm schalen.
    OPMERKING: Probeer om eicellen te dragen met een minimale hoeveelheid van eicel incubatiemedium.
  5. Incubeer gedurende 16 uur bij 16 ° C.
    OPMERKING: Start bijvoorbeeld de behandeling in 05:00 en eindigen om 09:00 op de volgende dag.

4. intracytoplasmatische sperma-injectie (ICSI)

  1. Ingevroren sperma stampreparaat
    OPMERKING: De volgende sperma voorbereiding moet worden gedaan voordat de eicel rijping experiment, en ingevroren sperma voorraden worden bewaard bij -80 ° C voor ICSI.
    1. Verzamel de testes van een mannelijke kikker door de stappen 1.4 tot 1.11, behalve voor het trekken van vet en de testikels uit de incisies met behulp van een tang en het verwijderen van testikels uit het vet.
    2. Was testes 1x Marc's Modified Ringers (MMR, 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES, pH 7,4).
    3. Verwijder vet eend bloedvaten door het rollen van de gewassen testikels op een schone tissue en vervolgens door de resterende bloedvaten met behulp van een tang verwijderen.
    4. Plaats elke testis in een 3,5 cm petrischaal met 1 ml 1 x MMR.
    5. Snijd in de lengte met fijne schaar, en scheur in kleine stukjes met een pincet tot er geen grote stukken blijven.
    6. Pipet op en neer met 1 ml plastic tip waarvan het einde wordt afgesneden en apparatuur 1 ml gemalen testis oplossing in een glazen homogenisator.
    7. Meng ze met 2-3 slagen en giet de oplossing op een 50 pm porie filter bevestigd aan de top van een 15 ml centrifugebuis. Laat de oplossing om te gaan door het filter.
    8. Herhaal stap 4.1.7 door resuspenderen de restsnede testis in 1 ml 1x MMR. Tot slot was de homogenisator een paar keer met 1x BMR en doorgeven door het filter.
    9. Herhaal de stappen 4.1.5 tot 4.1.8 voor de andere testis en het zwembad twee testikels in een centrifugebuis van 15 ml.
    10. Draai de cellen bij 800 xg bij 46; C gedurende 20 min.
    11. Verwijder het supernatant en resuspendeer de gepelleteerde cellen in 2 ml 1x MMR. Vervolgens over in een nieuwe buis.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat er geen zichtbare bloedcellen aanwezig zijn.
    12. Bereid een stap gradiënt in een 14 ml ultra-heldere centrifugebuis. Onderste laag: 4 ml 30% iodixanol. Tweede onderlaag: 1 ml 20% iodixanol. Derde onderste laag: 5 ml van 12% iodixanol. Toplaag: testis cellen in 2 ml 1x MMR. Overlay de hellingen zeer voorzichtig met een 1 ml pipet (overlay langzaam de bodem fase niet te storen).
      OPMERKING: Slechts een laag van 30% iodixanol zou ook moeten werken voor het isoleren alleen sperma.
    13. Spin in de SW40 rotor met ultracentrifuge bij 10.000 xg bij 4 ° C gedurende 15 min (vertraging zonder onderbreking).
    14. Verwijder voorzichtig de buis van de ultracentrifuge. Bevestig een interface tussen elke laag van de gradiënt en de pellet op de bodem.
    15. Verzamel de zaadcel fractie uit de pellet.
    16. Resuspendeer het sperma pellaat in 1x MMR voor uitwassen iodixanol. Spin bij 800 xg bij 4 ° C gedurende 20 min.
      OPMERKING: Als er veel sperma nog in de schorsing blijven na de spin, re-spin het supernatant bij 3220 xg bij 4 ° C gedurende 20 min en bundelen de afgedraaid sperma.
    17. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet sperma in 1 ml van 1x Nuclear Bereiding Buffer (NPB; 250 mM sucrose, 0,5 mM spermidine trihydrochloride, 0,2 mM Spermine-tetrahydrochloride, 1 mM EDTA, 15 mM HEPES, pH 7,7) 13. Vervolgens transfer naar een Eppendorf buis.
    18. Voeg 50 ul van 10 mg / ml Digitonine oplossing 1x NPB (Resuspendeer Digitonine poeder in DMSO bij 50 mg / ml en bij -80 ° C vriezer. Verdun voor gebruik van 50 mg / mL tot 10 mg / ml met 1x NPB. Ongebruikte 10 mg / ml Digitonine kan worden ingevroren en bewaard bij -20 ° C en opnieuw gebruikt) 1 ml van het sperma oplossing.
    19. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    20. Check een permeabilisatie tarief met DAPI kleuring (0,3 ug / ml DAPI als final concentratie). Indien minder dan 95% van de cellen worden gepermeabiliseerd, incubeer een beetje langer.
      OPMERKING: Soms als te veel zaadcellen geïncubeerd tegelijkertijd (vooral wanneer sperma vanuit meerdere testes), is het moeilijk om doorlaatbaar, in welk geval het noodzakelijk zijn een extra kleine hoeveelheid Digitonine voegen; bijvoorbeeld wanneer 20% van sperma niet permeabel een extra 20 pl Digitonine wordt toegevoegd.
    21. Stop permeabilisatie door 10% BSA tot 3% eindconcentratie.
    22. Draai de cellen bij 4 ° C.
      OPMERKING: Probeer zo weinig centrifugeersnelheid mogelijk door te beginnen met 100 g gedurende 5 min. Indien onvoldoende, de snelheid en / of tijd.
    23. Was de cellen met 0,3% BSA in 1x NPB en centrifugeer bij dezelfde snelheid als punt 4.1.22. Ondertussen bereidt de Sperma opslagbuffer (SSB; 2 ml 2x NPB, 120 ui 10% BSA, 1,2 ml geautoclaveerd Glycerol, 680 ui H2O).
    24. Voeg 500 ul van SSB om het spermapellet. Pipet een paar keer op en neer om opnieuw in suspensie met een cut tip om de cellen niet te beschadigen.
    25. Laat overnacht equilibreren bij 4 ° C.
    26. Pipetteer de cellen op en neer meerdere malen met een cut tip.
    27. Verdun een paar microliter 10 keer 1x MMR of 1x PBS aan de cellen met behulp hemocytometer tellen.
    28. Bevriezen monsters bij 30.000 sperma / ul (of hoger) direct bij -80 ° C en bewaar bij -80 ° C in één aliquots.
  2. ICSI in vitro gerijpte eicellen
    OPMERKING: Alle processen waarbij eicellen moet worden gedaan op 16-18 ° C.
    1. Bereid een glazen pipet voor het overbrengen van volgroeide eicellen.
      OPMERKING: De glazen pipet moet breed genoeg om eicellen te vangen zonder te knijpen zijn.
    2. Zestien uur na het verplaatsen van eicellen om de progesteron-bevattend medium, overdracht volgroeide eicellen in een 6 cm-agarose gecoate schotel gevuld met MBS + PS voor het wassen.
      OPMERKING: Belangrijk, matured oöcyten moeten zeer voorzichtig behandeld. Ruwe behandeling van eicellen kan spontane activering voordat sperma-injectie veroorzaken.
    3. Telling volgroeide eicellen door bevestiging het verschijnen van witte vlekken, die de germinal vesicle verdeling (figuur 2) impliceert. Als de rijping lager is dan 80%, is het onwaarschijnlijk dat het voldoende aantal overlevende embryo's voor verdere analyse te verkrijgen.
      OPMERKING: resterende follikelcellen afgepeld na maturatie (figuur 2).
    4. Transfer eicellen uit MBS wassen in nieuw-agarose gecoate 6 cm schaal gevuld met injectiemedium (voorbereiden 500 ml: 30 g Ficoll (6%), 20 ml van 10x MMR en 500 pl 1000x PS voorraad).
    5. Incubeer ten minste 30 minuten voordat ICSI.
    6. Het opzetten van de microinjector zoals beschreven in de stappen 2,2-2,4.
      OPMERKING: De tip grootte van de injectienaald wordt zo klein mogelijk gehouden door de in stap 2.6 beschreven. De diametervan de naald van 20-40 urn. Aan de naaldtip afschuining zoals beschreven in stap 2.4 misschien efficiënte injectie toe te staan.
    7. Haal het sperma hoeveelheid en verdun het sperma suspensie in Sperma VerdunningsBuffer (SDB; 250 mM sucrose, 75 mM KCI, 0,5 mM Spermidine, 0,2 mM Spermine, 200 M HEPES pH 7,5).
      OPMERKING: Verdunning kan worden gevarieerd afhankelijk van een naald maat enzovoort. Verdunnen 120 keer van de 30.000 sperma / ul voorraad als een eerste keer te proberen en verder aan te passen indien nodig.
    8. Plaats een kleine strook van Parafilm op het podium van een dissectie microscoop. Meng sperma-injectie-oplossing door pipetteren en breng een paar ul druppel van het sperma oplossing.
    9. Zuig het verdunde spermasuspensie in de naald, injecteren 4.6 nl tot 10 opeenvolgende druppels die 0,3 pg / ml DAPI op een microscoopglaasje en snel tel het aantal zaadcellen geleverd per injectie een fluorescentiemicroscoop.
      OPMERKING: Richt 1-2 zaadcellen per injectie. Indien nodig verdunnen sperma injectieoplossing moreen controleer het aantal zaadcellen per injectie nogmaals tot het bereiken van een gewenste concentratie.
    10. Werp de proefinjectie oplossing en vul een nieuw sperma-injectie-oplossing met een goede concentratie.
    11. Injecteren 4.6 nl sperma oplossing tot 100 volgroeide eicellen.
      OPMERKING: Het is belangrijk om continu injecteren van de oplossing. Bepaal eerst de tijd vereist voor het uitwerpen 4.6 nl (gewoonlijk 1-2 sec). Herhaal de volgende procedure; injecteren in een eicel, wacht een paar seconden, verwijder dan een naald en mock-injectie in injectievloeistof, wacht een paar seconden, injecteren in een eicel. Deze voortdurende injectie voorkomt ook het blokkeren van de naald. Als alternatief kan de werkwijze met een pomp worden gebruikt 13.
    12. Na ongeveer 100 injecties, werpen de resterende sperma oplossing en het opnieuw vullen van de sperma-oplossing (gebruik dezelfde sperma oplossing, maar pipet op en neer voordat doseren).
      OPMERKING: Als de naald sperma oplossing ook niet zuigen, snijd het topje van de noodzaakle. Als dit niet het verbeteren van de situatie voor te bereiden een nieuwe naald.
    13. Herhaal de injectie totdat alle oöcyten geïnjecteerd.
      OPMERKING: Als de eicel kwaliteit is goed en de injectie succesvol is, wordt samentrekking van geïnjecteerde oöcyten gezien binnen 20 minuten na de injectie tijd.
    14. Beweeg de geïnjecteerde gerechten tot 16 ° C of 18   ° C incubator.
    15. 4-5 uur na de injectie, controleer dan de splitsing tarief van ICSI embryo's.
      OPMERKING: Splitsing voren van die embryo's zijn misschien niet zo duidelijk als die van normale bevruchte embryo's zijn. Sommige embryo's tonen ook abnormale breuklijnen, die veroorzaakt kunnen worden door meerdere sperma-injectie.
    16. Transfer gesplitst embryo's waaronder abnormaal gekliefd embryo incubatie medium (Bereid 500 ml: 20 g Ficoll (4%), 5 ml van 10x BMR en 500 ul van 1000x PS voorraad).
    17. Incubeer embryo hetzij in 16   ° C of 18 ° C incubator 's nachts.
    18. De volgende ochtend, overdracht embryos tot 0.1x BMR en tel overgebleven embryo's.
    19. Gemiddeld kan ongeveer 10% van sperma geïnjecteerde oöcyten ontwikkelen om het zwembad kikkervisje stadium (figuur 3A).

Resultaten

Embryonale ontwikkeling van ICSI embryo middels in vitro gerijpte oöcyten werd onderzocht (Figuur 3A). Rijping percentages GV oöcyten het MII stadium variabel en hangt grotendeels af van de kwaliteit van de oöcyten. In goede experimenten, bijna 100% van GV oöcyten reageren op progesteron en vertonen tekenen van eicelrijping, begint eindelijk eieren op de MII stadium. Alle volgroeide eicellen werden onderworpen aan ICSI en ongeveer 25% van de geïnjecteerde eieren gesplitst (figuur 3A, n = 13 voor besturing gecodeerde oligo-geïnjecteerde oöcyten en n = 7 voor niet-oligo geïnjecteerde oöcyten). Ongeveer 60% of 80% van gesplitst embryo's geproduceerd controle-oligo geïnjecteerde oöcyten of niet-geïnjecteerde eicel respectievelijk bereikte de blastula / gastrulastadium. Onder de blastula / gastrula embryo, ongeveer de helft van embryo-oligo geïnjecteerde monsters waren van goede kwaliteit (bijna geen tekenen van abnormale splitsing en apoptose), terwijl 82% van de blastula / gastrula embryo's van goede kwaliteit in non-geïnjecteerde monsters (Figuur 3A). Tenslotte, 41% en 11% van gesplitst embryo-oligo geïnjecteerde monsters bereikt de spierreactie en zwemmen kikkervisje fasen, respectievelijk, terwijl 60% en 29% van de embryo gesplitst in niet-geïnjecteerde monsters deed (Figuur 3A). Deze ICSI embryo's het mengsel van normale en abnormale embryo's (Figuur 3B). Sommigen van hen ondergaan metamorfose en ontwikkelen om kikkers 8 rijpen. Deze resultaten suggereren dat injectie van antisense oligonucleotiden in GV oöcyten, gevolgd door IVM en ICSI, maakt een efficiënte vroege embryonale ontwikkeling. Hoewel de injectie van antisense oligo zelf afneemt embryonale ontwikkeling, we toch voldoende embryo vele experimentele doeleinden te verkrijgen zoals het controleren van ontwikkelings- prijzen, RT-PCR, western blot enzovoort.

figure-results-1
Vijg ure 1: Typische voorbeelden van Xenopus laevis oöcyten van goede kwaliteit of slechte kwaliteit voor de in vitro maturatie experimenten. (A) Een voorbeeld van slechte kwaliteit eicellen. Zo worden oöcyten weergegeven fragmentarisch pigmentatie niet gebruikt voor daaropvolgende experimenten. Elke Xenopus laevis oöcyten ongeveer 1,2-1,4 mm. (B) een gedeeltelijk defolliculated eicel. De rechterhelft van de eicel onder follikel cellen, die kunnen worden onderscheiden door de aanwezigheid van bloedvaten. Een pijl toont een gebied dat vrij is van follikel cellen en waarin de injectienaald wordt geïnjecteerd. (C) Een voorbeeld van een goede kwaliteit eicellen, die zijn even groot en toon gelijkmatig gepigmenteerde dier hemisferen met duidelijke contrast tussen het dier halfrond en de plantaardige halfrond.

2496 / 52496fig2highres.jpg "/>
Figuur 2:. Xenopus laevis oöcyten voor en na rijping na maturatie, stralend witte vlekken bovenaan dier hemisferen en follikel cellen worden afgepeld. Elke Xenopus laevis oöcyten ongeveer 1 mm in diameter.

figure-results-2
Figuur 3: Ontwikkeling van ICSI embryo's, geproduceerd uit in vitro gerijpte eicellen. (A) De ontwikkeling van ICSI embryo's voor elk stadium wordt samengevat. Oocyten werden geïnjecteerd met controle scrambled antisense oligonucleotiden (controle oligo injectie) of zonder injectie (niet injectie), gevolgd door IVM en ICSI. Het overeenkomstige aantal embryo in elke fase boven de balken. Gemiddelde ± SEM wordt getoond. N = 4-13 onafhankelijke experimenten / verschillende females. (B) Voorbeelden van overleven ICSI embryo's. Deze tailbud embryo's werden in één experiment, waarbij ongeveer 200 eicellen werden gebruikt als uitgangsmateriaal.

Discussie

Wij hier in detail een nieuwe methode om de moeder factoren afbrekende of exogene factoren overexpressie vóór de bevruchting. Dit systeem vereist twee micro-injecties, maar slaat de operatie kikkers, die in de ontvangende overdrachtsmethode 7,17. Het is optimaal om de kikker operatie stap op het gebied van de verzorging van dieren te verwijderen. Bovendien hebben we geen rekening houden met de kwaliteit van de gastheer vrouwelijke kikkers voor de overdracht experimenten, wat betekent dat we kunnen ontdoen van een biologische factor die het succes van experimenten beïnvloedt. Daarom wordt in dit systeem de kwaliteit van de oöcyten verkregen PMSG geprimede kikkers een belangrijke biologische factor die essentieel voor een succesvolle experimenten. De kwaliteit van eicellen kan worden beoordeeld na afname van de eierstokken of na defolliculation. Indien een afwijking wordt waargenomen bij deze fasen is het optimaal om een ​​eierstok halen in een nieuwe kikker. Een ander punt als je de eicel kwaliteit kan controleren is na eicelrijping. Indien minder dan 80% van progesteron-e behandeld eicellen vertonen tekenen van rijping, mag u niet in staat zijn om het voldoende aantal embryo's te verkrijgen voor verdere analyses. Het gebruik van enzymatische defolliculation plaats van handmatige defolliculation is ook een ander voordeel van deze regeling aan de arbeid nodig defolliculation verminderen. Het is echter nog steeds mogelijk dat handmatige defolliculation een betere ontwikkeling dan de enzymatische behandeling geven.

Zoals getoond in figuur 3, bijna 10% van in vitro gerijpte oöcyten kan het zwembad kikkervisje stadium te bereiken. Deze gegevens worden verzameld uit 13 onafhankelijke experimenten waaronder gerapporteerd in 8 en nieuwe injectie experimenten. Host overdracht methode moet 75-150 eicellen in elke behandeling voor het verkrijgen van zinvolle gegevens sinds 30-60% van de overgedragen eicellen de neurula stadium 17 kan bereiken. Onze methode begint normaal met 200-300 eicellen in elke experimentele groep sinds ongeveer 40-60% van gesplitst embryo's kan bereiken despierreactie podium. Deze gegevens suggereren dat beide methoden ondersteunen een redelijke ontwikkelingssnelheid. We hebben tot nu toe verkregen 10 levend vorsen van controle-mRNA geïnjecteerd en controle antisense-oligo geïnjecteerde eicellen met behulp van deze techniek, wat aangeeft dat deze aanpak steunt ontwikkeling door metamorfose.

De eicel manipulatie-ICSI methode biedt een mogelijkheid om de rol maternale factoren te testen gedurende zeer vroege embryonale ontwikkeling, kort na de bevruchting. Bovendien kan overexpressie van chromatine modificerende factoren voor de bevruchting mogelijk maken maternale chromatine verbouwen voor de bevruchting te begrijpen maternale chromatine staten nodig is voor ontwikkeling. Deze strategie kan ook goed werken met de huidige gen-editing systemen zoals transcriptie activator-achtige effector nuclease (TALEN) 18,19 en CRISPR / CAS9 20,21, omdat deze kan worden uitgedrukt zelfs vóór de bevruchting. Daarom is onze nieuwe aanpak heeft een potential worden voor veel toepassingen in de toekomst.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We zijn de leden van het Gurdon-laboratorium dankbaar voor de nuttige discussie. K.M. is onderzoeksfellow aan Wolfson College en wordt ondersteund door de Herchel Smith Postdoctoral Fellowship en de Great Britain Sasakawa Foundation. Het Gurdon-laboratorium wordt ondersteund door subsidies van de Wellcome Trust (RG69899) en MRC aan J.B.G.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG) MSD Animal HealthVm 01708/4309PMSG-Intervet 5000iu poeder en oplosmiddel voor oplossing voor injectie
Ethyl 3-aminobenzoate methaansulfonaat zout (MS222)SigmaA5040Voor anesthesie
Liberase TM Research GradeRoche05 401 127 001Voor oöcytdefolliculatie. Bewaren bij -20 °C.
Drummond NanojectDrummond Scientific Company3-000-205/206Voor micro-injectie
glas capillair Alpha laboratories7” Drummond #3-000-203-G/XLVoor micro-injectie
Micropipet Puller SUTTER InstrumentModel D-97Voor micro-injectie
UltraPure AgaroseInvitrogen16500-500Voor in vitro rijping en ICSI
14 ml ultra-heldere centrifugebuis Beckman Coulter United Kingdom Ltd344060Voor spermapurificatie
OptiPrep Dichtheidsgradiënt Medium (Iodixanol)SigmaD1556Voor spermapurificatie
DigitoninSigmaD141Reagens voor celpermeabilisatie
ShakerHybaid HB-SHK-1Voor oöcytdefolliculatie
Dissectiemicroscoop (Stereo zoom microscoop)ZEISSSemi SV6Voor oöcytopname en micro-injectie
50 μm poriefilterCellTrics04-0042-2317Voor spermapurificatie
UltracentrifugeBeckman CoulterOptima L-100XPVoor spermapurificatie
50 ml centrifugebuisCellstar Greiner Bio-One227261 of 210261Oöcytopname en defolliculatiereactie
15 ml centrifugebuisFALCON352097Voor spermapurificatie
90 mm Petri-schaal Thermo Scientific101VR20/C
Easy-Grip Celcultuur Schaal, 60 x 15 mmFALCON353004
Easy-Grip Celcultuur Schaal, 35 x 15 mmFALCON351008

Referenties

  1. Miyamoto, K., Gurdon, J. B. Insights into the amphibian egg to understand the mammalian oocyte. Biology and Pathology of the Oocyte: Role in Fertility, Medicine, and Nuclear Reprogramming. Trounson, A., Gosden, R., Eichenlaub-Ritter, U. , Second, Cambridge University Press. 1-11 (2013).
  2. Heasman, J., Kofron, M., Wylie, C. Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach. Developmental biology. 222 (1), 124-134 (2000).
  3. Oelgeschlager, M., Kuroda, H., Reversade, B., De Robertis, E. M. Chordin is required for the Spemann organizer transplantation phenomenon in Xenopus embryos. Developmental cell. 4 (2), 219-230 (2003).
  4. Szenker, E., Lacoste, N., Almouzni, G. A developmental requirement for HIRA-dependent H3.3 deposition revealed at gastrulation in Xenopus. Cell reports. 1 (6), 730-740 (2012).
  5. Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C. Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules. Methods in cell biology. 36, 213-230 (1991).
  6. Heasman, J., et al. Overexpression of cadherins and underexpression of beta-catenin inhibit dorsal mesoderm induction in early Xenopus embryos. Cell. 79 (5), 791-803 (1994).
  7. Hulstrand, A. M., Schneider, P. N., Houston, D. W. The use of antisense oligonucleotides in Xenopus oocytes. Methods. 51 (1), 75-81 (2010).
  8. Miyamoto, K., et al. Nuclear Wave1 is required for reprogramming transcription in oocytes and for normal development. Science. 341 (6149), 1002-1005 (2013).
  9. Halley-Stott, R. P., et al. Mammalian nuclear transplantation to Germinal Vesicle stage Xenopus oocytes - a method for quantitative transcriptional reprogramming. Methods. 51 (1), 56-65 (2010).
  10. Astrand, C., Belikov, S., Wrange, O. Histone acetylation characterizes chromatin presetting by NF1 and Oct1 and enhances glucocorticoid receptor binding to the MMTV promoter. Experimental cell research. 315 (15), 2604-2615 (2009).
  11. Amaya, E., Kroll, K. L. A method for generating transgenic frog embryos. Methods in molecular biology. 97, 393-414 (1999).
  12. Kroll, K. L., Amaya, E. Transgenic Xenopus embryos from sperm nuclear transplantations reveal FGF signaling requirements during gastrulation. Development. 122 (10), 3173-3183 (1996).
  13. Smith, S. J., Fairclough, L., Latinkic, B. V., Sparrow, D. B., Mohun, T. J. Xenopus laevis transgenesis by sperm nuclear injection. Nature protocols. 1 (5), 2195-2203 (2006).
  14. Drury, K. C., Schorderet-Slatkine, S. Effects of cycloheximide on the 'autocatalytic' nature of the maturation promoting factor (MPF) in oocytes of Xenopus laevis. Cell. 4 (3), 269-274 (1975).
  15. Smith, L. D., Ecker, R. E. Role of the oocyte nucleus in physiological maturation in Rana pipiens. Developmental biology. 19 (3), 281-309 (1969).
  16. Miyamoto, K., Pasque, V., Jullien, J., Gurdon, J. B. Nuclear actin polymerization is required for transcriptional reprogramming of Oct4 by oocytes. Genes & development. 25 (9), 946-958 (2011).
  17. Schneider, P. N., Hulstrand, A. M., Houston, D. W. Fertilization of Xenopus oocytes using the host transfer method. J. Vis. Exp. (45), (2010).
  18. Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis). Biology open. 1 (12), 1273-1276 (2012).
  19. Sakane, Y., et al. Targeted mutagenesis of multiple and paralogous genes in Xenopus laevis using two pairs of transcription activator-like effector nucleases. Development, growth & differentiation. 56 (1), 108-114 (2014).
  20. Nakayama, T., et al. Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).
  21. Guo, X., et al. Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis. Development. 141 (3), 707-714 (2014).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Antisense oligo injectiekiemblaasjesstadiummetafase II stadiumstromale vasculaire fractieflowcytometrieconfocale microscopieWestern blot
Manipulatie en
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.