Transfectie, Selection, en Kolonie-picking van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen TALEN-gericht, met een GFP-gen in de AAVS1 Safe Harbor

Samenvatting

TALEN-gemedieerde genre-editing op het veilige haven-locus AAVS1 maakt hoog-efficiënte toevoeging van transgenen mogelijk in menselijke iPSC's. Dit protocol beschrijft de procedures voor het voorbereiden van iPSC's voor TALEN en donorvector-levering, het transfecteren van iPSC's en het selecteren en isoleren van iPSC-klonen om gerichte integratie van een GFP-gen te bereiken voor het genereren van reporter-lijnen.

Samenvatting

Gerichte transgeenadditie kan aanhoudende genexpressie bieden terwijl het gen-silencing en insertionele mutagenese omzeilt dat wordt veroorzaakt door willekeurige integratie via een viraal vector. Dit protocol beschrijft een universeel en efficiënt platform voor gerichte transgeenadditie in humane iPSC's, gebaseerd op het gebruik van gevalideerde open-source TALENs en een gene-trap-achtige donor om transgenen naar een veilige havenlocus te leveren. Belangrijk is dat effectieve genredigering beperkt wordt door de leveringsefficiëntie van genredigeringsvectoren. Daarom richt dit protocol zich eerst op de voorbereiding van iPSC's voor transfectie om een hoge nucleaire leveringsefficiëntie te bereiken. Wanneer iPSC's worden gedissocieerd in enkele cellen met behulp van een milde celdissociatiereagens en getransfecteerd met behulp van een geoptimaliseerd programma, kan >50% van de cellen worden geïnduceerd om de grote genredigeringsvectoren op te nemen. Omdat de AAVS1-locus zich in het intron van een actief gen bevindt (PPP1R12C), werd een splicing acceptor (SA)-gekoppeld puromycine-resistent gen (PAC) gebruikt om gerichte iPSC's te selecteren, terwijl alleen willekeurige integratie en niet-getransfecteerde cellen werden uitgesloten. Deze strategie verhoogt de kans op het verkrijgen van gerichte klonen aanzienlijk en kan ook worden gebruikt in andere actieve gentargeteerexperimenten. Twee weken na puromycineselectie op de dosis die is aangepast voor de specifieke iPSC-lijn, zijn klonen klaar om te worden gepikt door handmatige dissectie van grote, geïsoleerde kolonies in kleinere stukken die worden overgebracht naar vers medium in een kleinere put voor verdere expansie en genetische en functionele screening. Dit protocol kan worden gevolgd om gemakkelijk meerdere GFP-reporter iPSC-lijnen te verkrijgen die nuttig zijn voor in vivo en in vitro beeldvorming en celisolatie.

Inleiding

Het vermogen om menselijke somatische cellen herprogrammeren in embryonale stamcel-achtige geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) werd ontdekt door Takahashi et al. In 2007 ^1. Menselijke huidfibroblasten getransduceerd met retrovirussen expressie vier transcriptiefactoren (de zoge- noemde Yamanaka factoren Oct3 / 4, Sox2, c-Myc en Klf4) bleken vrijwel gelijkwaardig aan menselijke embryonale stamcellen (hESCs) op basis van morfologie, proliferatie, genexpressie en epigenetische status te hebben; cruciaal, iPSCs ook kunnen differentiëren in cellen van alle drie kiembladen ^1. De proliferatieve potentie en differentiatie aantal iPSCs maakt hen zeer aantrekkelijk gereedschap; door herprogrammering cellen van patiënten die lijden aan specifieke ziekten, kan iPSCs worden gebruikt als in vitro ziekte modelsystemen en als potentiële therapeutica.

Voor het laatste doel, moet een aantal zaken voordat het volledige potentieel van iPSCs worden aangepaktin een klinische omgeving kan worden gerealiseerd; het tumorigene potentieel van in vitro gekweekte hESCs en iPSCs, het gebruik van xenogene derivaten tijdens herprogrammering en celonderhoud en de noodzaak getransplanteerde cellen te volgen in vivo zijn cruciaal obstakels voor de klinische toepassing van pluripotente stamcellen (Beoordeeld door Hentze et bij. ^2). Een ideale oplossing om de noodzaak voor het bijhouden van gedifferentieerde cellen na transplantatie zou een visueel detecteerbare merker die weerstaat zwijgen en schakering ongeacht de toepassing betrekken. Robuuste en duurzame expressie van geïntegreerde transgenen is eerst haalbaar wanneer exogeen DNA wordt ingebracht in safe-harbour loci; dat wil zeggen, genomisch sites die voldoende transcriptie van een geïntegreerde vector mogelijk terwijl tegelijkertijd verzachtende verstoringen van expressie in naburige genen ^3. Een zo'n site die is goed gekarakteriseerd sinds zijn ontdekking is het adeno-geassocieerde virus integratie site 1 (AAVS1), in het eerste intron van het proteïne fosfatase 1 regulerende subeenheid 12C (PPP1R12C) gen. Dit gen is aangetoond niet alleen toestaan ​​duurzame en robuuste expressie van transgenen geïntegreerd via uitgebreide tijd in kweek en in vitro differentiatie ^3, maar tevens tot omliggende genen van transcriptionele verstoring ^4; beide functies zijn waarschijnlijk te wijten aan de aanwezigheid van endogene chromatine isolatorelementen flankeren de AAVS1 plaats ^5.

Vooruitgang in genoom engineering tools in slechts de afgelopen tien jaar aanzienlijk vergemakkelijkt het gemak en de efficiëntie waarmee genetische manipulaties in elk celtype worden bereikt. Terwijl vroege succesvolle experimenten gebruikt buitengewoon lage endogene homologe recombinatie (HR) met een geïntroduceerd donor gen bereiken targeting in SER ^6,7, het gebruik van plaats-specifieke nucleasen, zoals zinkvinger nucleasen (ZFNs), dat significantly induceren van homologe recombinatie door het genereren van een dubbelstrengs DNA-break is sterk toegenomen de efficiëntie van dergelijke experimenten ^8,9. De herbestemming van zowel transcriptie activator-achtige effectoren (verhalen) van plantaardige pathogene Xanthomonas geslachten en de prokaryote geclusterd regelmatig afgewisseld korte palindroom herhalingen (CRISPR) / Cas9 systeem in efficiënte site-specific ontwerper nucleases heeft gentargeting gemaakt in pluripotente stamcellen een toegankelijke en uitvoerbaar methodologie ^10-13.

Een recent artikel beschreef een efficiënte methode voor de stabiele integratie van een groen fluorescerend reporter cassette in de AAVS1 safe-haven locus in menselijke iPSCs behulp VERHAAL nucleases (Talens) ^14. Deze gerichte iPSCs behielden hun fluorescentie zelfs nadat gericht differentiatie naar hartspiercellen en transplantatie in een muismodel van myocardinfarct (MI), het verstrekken van sterk bewijs voor het nut van dergelijkestabiel fluorescerende pluripotente stamcellen ^14. Gerichte kolonies te krijgen, werd een gen-trap methode waarbij een splicing-acceptor (SA), 2A zelf-splitsende peptide sequentie plaatst het puromycine N-acetyl-transferase (PAC) gen onder controle van de endogene PPP1R12C promoter; dus, alleen iPSCs dat het DNA schenker ten AAVS1 locus hebben opgenomen uiten PAC, waardoor ze selecteerbaar gebaseerd op puromycine- weerstand; (Figuur 1, ^15). Dit protocol beschrijft de procedures voor het genereren van AAVS1-GFP iPSCs gemeld in het recente document ^14, met inbegrip van het proces van het transfecteren iPSCs met Talens en een 9,8 kb donor naar een 4.2kb DNA-fragment in de AAVS1 safe-harbour locus integreren, selecteren iPSCs gebaseerd op puromycine-resistentie en plukken kolonies klonale expansie. De hierin beschreven technieken kunnen worden toegepast op vele genoom technische experimenten.

Protocol

1. Voorbereiding van basaalmembraanziekte Matrix en Coating van Plasticware

1. Leg de bevroren basaal membraan matrix voorraad van -20 ° C op ijs en het ontdooien overnacht bij 4 ° C.
2. Na ontdooien pipet 2 mg aliquots van basaalmembraan matrix in vooraf gekoelde eppendorfbuizen. Bewaar deze bij -20 ° C totdat het nodig is.
3. Voor te bereiden basaal membraan-matrix gecoate platen, ontdooien één portie op ijs tot het laatste stuk ijs in de eppendorfbuis verdwijnt (meestal binnen ~ 2 uur).
4. Na ontdooien voeg basaalmembraan matrix 12 ml koude (4 ° C) DMEM / F12 basaalmembraan matrix coating oplossing.
5. Voeg basaal membraan matrix oplossing voor de juiste cultuur vat. Voor een 6-well plaat, afzien van 1 ml per putje. Zwenk de plaat om te zorgen dat het basaal membraan matrix oplossing dekt volledig elk putje.
6. Parafilm verzegelen het basaal membraan-matrix gecoate plaat / schotel, en incubeer bij room temperatuur gedurende 1 uur voor gebruik. Als alternatief winkel basaal membraan-matrix gecoate platen / borden bij 4 ° C en binnen 2 weken van de coating.
   OPMERKING: Voeg extra DMEM / F12 om het basaal membraan-matrix gecoate plaat / schaal om uitdroging te voorkomen. Voor het gebruik van 4 ° C bewaard basaal membraan-matrix gecoate plaat / schotel, plaats hem in een biologisch veiligheidskabinet en laat deze op kamertemperatuur komen gedurende ten minste 30 min.
7. Zuig basaalmembraan matrix volledig vóór de toevoeging van medium en cellen.

2. Voorbereiding van de E8 medium

1. Bereid E8 kweekmedium door het ontdooien van E8 supplement overnacht bij 4 ° C.
2. Verwijder 10 ml E8 basaal medium uit de 500 ml bouillon en gooi ze weg.
3. Pipetteer de gehele 10 ml flacon van E8 supplement direct in 490 ml E8 basaal medium. Doe niet warm volledige E8 medium in een 37 ° C waterbad, zo herhaalde temperatuurschommelingen de bFGF kan worden afgebroken in het complete E8 medium.
4. Gebruik volledige E8 medium binnen 2 weken na toevoeging van het supplement.

3. Het ontdooien van iPSCs

1. Verwijder een flacon van bevroren iPSCs van vloeibare stikstof en plaats op droog ijs.
2. Snel ontdooien van de flacon in een 37 ° C waterbad; zwenk de flacon in het waterbad tot er slechts een klein fragment van ijs resten.
3. Spray de flacon met 70% ethanol en transfer naar een biologisch veiligheidskabinet.
4. Voeg 1 ml kamertemperatuur E8 medium druppelsgewijs direct aan het flesje.
5. Met behulp van een pipet 2 ml, breng de celsuspensie druppelsgewijs in 9 ml E8 medium in een 15 ml conische buis. Schud de buis regelmatig zodat de cellen en medium meng goed snel.
6. Centrifugeer de cellen bij 200 xg gedurende 5 minuten.
7. Zuig het supernatant en resuspendeer de celpellet in een geschikt volume E8 gesupplementeerd met 10 pM Y-27632.
8. Voeg de cellen om een ​​passend aantal kelder membrane-matrix beklede putjes, en plaats in een 37 ° C, 5% _CO2 incubator 's nachts. Het wordt aanbevolen om de plaat ten minste 0,2 x 10 ⁶ iPSC per putje van een 6-wells plaat te snel herstel na ontdooiing mogelijk te maken.

4. Onderhoud en Routine passage van de iPSCs

1. Vernieuwen E8 medium dagelijks.
2. Controleer de morfologie en confluentie van cellen met een omgekeerde microscoop. iPSCs van hoge kwaliteit te groeien in flat kolonies met duidelijke grenzen; individuele kolonies bezitten een "geplaveide-achtig 'uiterlijk.
3. Passage van de iPSCs cellen wanneer ze bereiken ~ 70% confluentie.
4. Bereid een EDTA passage door toevoeging van 0,9 g NaCl en 500 pi 0,5 M EDTA tot 500 ml DPBS. Meng goed op te lossen NaCl, en vacuüm filter te steriliseren. Warm een ​​hoeveelheid van de passage oplossing in een 37 ° C waterbad voor passage.
5. Om passage, aspiratie verbruikte kweekmedium en was cellen eenmaal met een gelijk volume warme pasSaging oplossing. Aspireren, en pipet genoeg EDTA passage oplossing voor de vacht van de cellen (1 ml per putje van een 6-wells plaat).
6. Plaats de cellen onder een omgekeerde microscoop en observeer de iPSC kolonies. Het verschijnen van gaten in kolonies en verhoogde randen moeten duidelijk worden binnen 2 tot 5 minuten.
7. Zuig het EDTA passage oplossing zorgvuldig.
8. Pipetteer 10 ml afzien 4 ml E8 medium (bij gebruik van een 6-wells plaat) onder hoge druk direct in elk putje worden gepasseerd.
9. Verzamel de iPSC bosjes, en opgesplitst in een passend aantal putten, afhankelijk van de split-ratio van 1: 8 tot 1:12. Niet over-pipet, als uitsplitsing van celklonten zal resulteren in slechte levensvatbaarheid.
10. Plaats de plaat in een couveuse, en rock de plaat heen-en-weer en side-to-side meerdere malen om de cellen te verspreiden.

5. Voorbereiding van de MEF en iPSCs voor Tansfection

1. 48 uur voorafgaand aan transfection, passage iPSCs bij ~ 1: 6 in vier of meer putjes van een basaalmembraan matrix beklede 6-well plaat, waardoor ze 70% confluent twee dagen vandaar zijn.
2. De volgende dag ontdooien DR4 MEFs in MEF medium dat bestaat uit DMEM (hoog glucose) aangevuld met 10% FBS en 1x MEM-NEAA.
3. Plaat DR4 MEFs in twee 10-cm schalen bij ~ 2 x 10 ⁴ cellen / ^cm2 en incubeer overnacht bij 37 ° C.
4. Op de dag van transfectie veranderen MEF medium E8 gesupplementeerd met 10 pM Y-27632 30 min alvorens transfectie op iPSCs.
5. Optioneel: Als flowcytometrische analyse van iPSCs na transfectie wordt gewenst, verwijderen van een basaal membraan-matrix gecoate plaat van 4 ° C en plaats bij kamertemperatuur.
6. Optioneel: 4 uur voorafgaand aan transfectie, vullen vóór transfectie iPSC kweek met Y-27632 bij de eindconcentratie van 10 uM.

6. Gentle-cel dissociatie reagens Treatment eennd Transfectie van iPSCs met een Electroporation System

1. Verwijder P3 primaire cel transfectie oplossing bij 4 ° C en laat op kamertemperatuur komen gedurende ~ 30 min. Voeg de gehele 100 ul aanvulling op de transfectie oplossing vóór gebruik.
2. Warme zachte-cel dissociatie reagens in een 37 ° C waterbad.
3. Verkrijgen AAVS1 Talens (PZT-AAVS1-L1 en PZT-AAVS1-R1) en AAVS1-CAG-EGFP donor van -20 ° C.
4. Verwijder iPSCs uit de incubator en een keer wassen met DPBS.
5. Voeg 1 ml zachte cel dissociatie reagens per putje en incubeer iPSCs bij 37 ° C gedurende 5 minuten, of totdat meer dan 50% van de cellen losgemaakt van het kweekvat.
6. Pipetteer de cellen en neer een paar keer met een P1000 pipet om alle resterende cellen van het kweekvat dissociëren en te breken iPSC klonten.
7. Voeg 2 ml van E8 medium aan elk putje en pipet op en neer meerdere malen met een pipet 10 ml naar Fürtheh disaggregeren celklonten in enkele cellen
   OPMERKING: De transfectie efficiëntie daalt aanzienlijk als celklonten zijn niet voldoende uitgesplitst.
8. Verzamel iPSCs in een 15 ml conische buis en centrifugeer bij 100 xg gedurende 3 min.
9. Zuig supernatant en resuspendeer cellen in een minimale hoeveelheid E8 medium.
10. Tel de cellen met een hemocytometer na toepassing van een vitale kleurstof zoals 0,4% trypan blauw. Zorg ervoor dat de cellen voldoende kunnen worden gescheiden, terwijl het tellen (1-3 cellen per "klomp").
11. Afzien van 3 x 10 ⁶ cellen in elk van de twee 15 ml conische buizen en spin down opnieuw bij 100 xg gedurende 3 min.
    OPMERKING: Lage snelheid centrifugeren vermindert de cel stress en maakt een eenvoudige re-opschorting van iPSCs vóór elektroporatie.
12. Stel de elektroporatie systeem om het celtype specifieke programma voor de menselijke embryonale stamcellen lijn H9 (Program CB-150).
13. Na centrifugeren zuig het supernatant van de CELl pellets. Om één pellet, voeg 10 ug van het HR-donor als controle monster. Aan de andere pellet voeg 10 ug van het HR-donor, samen met 5 ug van elk TALEN (PZT-AAVS1-L1 en PZT-AAVS1-R1) als experimenteel monster.
14. Resuspendeer elk celpellet in 100 ui P3 primaire cel transfectie oplossing en naar een cuvette.
15. Voer de transfectie en onmiddellijk 500 ul van kamertemperatuur E8 medium toe te voegen aan elke cuvette.
16. Breng de getransfecteerde iPSCs druppelsgewijs aan een 10-cm schotel met DR4 MEF bereid in stap 5.4.
17. Optioneel: Voeg enige druppels van elk experiment in een putje van een basaalmembraan matrix beklede 6-well plaat of flowcytometrie anaylsis transfectie efficiëntie gewenst.
18. Herhaal de stappen 6,15-6,17 voor beide monsters afmaken. De volgende dag, wassen cellen met DPBS tweemaal en schakelen kweekmedium NutriStem, die lijkt te iPSC cultuur steunen op feeders beter dan E8.
19. Transient EGFP expressie pieken bij 48 tot 72 uur na transfectie; beoordelen transfectie-efficiëntie zoals gewenst.

7. Puromycine keuze van gerichte iPSCs

1. Begin puromycineselectie 72 uur na transfectie wanneer de iPSCs oplopen tot 70% samenvloeiing.
2. Voor NCRM5 iPSCs, beginnen puromycineselectie bij 0,5 ug / ml puromycine (1/2 van de volledige dosis) verdund in NutriStem kweekmedium. De optimale puromycine concentratie kan variëren 0,25-1 ug / MLL enige iPSC lijnen.
3. Cultuur iPSCs in NutriStem + 0,5 ug / ml puromycine voor 3 dagen, het verversen van het medium dagelijks.
4. Na 3 dagen, verhoging van de concentratie van puromycine tot 1 ug / ml.
5. Culture iPSCs onder 1 ug / ml puromycine selectie voor een 7 tot 8 dagen of tot afzonderlijke kolonies verschijnen groot genoeg voor colony picking.

8. Colony Picking en uitbreiden van Gerichte iPSCs

1. Gebruik basaal membraanmatrix bekleden een 96-well plaat door het afgeven 50 ui basaalmembraan matrix bekledingsoplossing (2 mg basaalmembraan matrix verdund in 12 ml DMEM / F12) in elk putje. Bewaar de plaat staan ​​bij 4 ° C gedurende de nacht voor het gebruik.
2. Nadat men de basaalmembraan matrix beklede plaat kamertemperatuur komen, zuigen de basaalmembraan matrix en breng 100 ui E8 gesupplementeerd met 10 pM Y-27632 in elk putje.
3. Een omgekeerde microscoop in een biologisch veiligheidskabinet, en spray licht met 70% EtOH te steriliseren.
4. Trek een glazen Pasteur pipet over een bunsenbrander om een ​​ideale kolonie-picking tool die een kleine "haak" aan het uiteinde heeft te verkrijgen. Steriliseer met 70% EtOH, en plaats in de kap te drogen.
5. Verwijder het schaaltje met gerichte iPSC kolonies uit de incubator en plaats in de kap onder de microscoop.
6. Pick iPSCs door het traceren van een cirkel rond de kolonie grens met de kolonie picking tool.
7. Gebruik de "haak" van de kolonie-picking middel om voorzichtig schrapen en verwijder de iPSC kolonie van het oppervlak van de plaat. Voor grotere kolonies, tekenen een X met de kolonie-picking tool om kwart de kolonie zal celgroei na re-plating te vergemakkelijken.
8. Zodra celklonten zijn vrijstaand en vrij zwevende, gebruik dan een P200 pipet ingesteld op ~ 30 pi aan de iPSCs verzamelen. Plaat cellen direct in de 96-well plaat.
9. Optioneel: gebruik een p20 pipet op ~ 5 ul de iPSCs verzamelen in een eppendorfbuisje, voeg 50 ul zacht-cel dissociatie reagens verteerbaar gedurende 5 min bij 37 ° C. Na de spijsvertering, voeg 500 ul E8 medium in de eppendorfbuis naar de zachte-cel dissociatie reagens te verdunnen en spin down de cellen op 200 xg in een standaard tafelblad microcentrifuge gedurende 5 minuten. Zuig vervolgens meeste van het medium en laat ~ 30 pi te resuspenderen en breng de cellen in 96-well plaat.
   LET OP: Dezeaanpak zal de dissociatie van de cel klomp en snelle uitbreiding van geplukt kolonie te vergemakkelijken.
10. Ga kolonie picking totdat een voldoende aantal iPSC kolonies werden verzameld (ongeveer 20-30 kolonies per experiment wordt aanbevolen).
11. Na kolonie plukken, plaats de 96-wells plaat in een incubator 's nachts. Vernieuwen met complete E8 medium de volgende dag, en de cultuur tot ~ 70% confluent.
12. Passage cellen van de 96-well in een 24-well, dan in een 6-well, zoals beschreven in de stappen 4,5-4,10.
    OPMERKING: de hoeveelheden EDTA-oplossing en E8 medium verhoudingsgewijs worden verlaagd bij gebruik putjes kleiner dan een 6-wells plaat.
13. Beoordelen targeting succes door het knooppunt PCR en Southern blot analyse om gerichte cassette integratie en de afwezigheid van willekeurig geplaatste vectoren ¹⁶ bevestigen.

Resultaten

Een visualisatie van het protocol is gegeven in Figuur 2, met perioden waarin iPSCs worden gekweekt in verschillende middelgrote gemarkeerd door een groen voor E8 of blauw voor NutriStem. Het is belangrijk om alleen hoogwaardige iPSCs transfecteren; onderzoeken cultuur gerechten gedurende routine-onderhoud en controleer of iPSC culturen bevatten voornamelijk verschillende kolonies, voorzien van een geplaveide-achtige morfologie (figuur 3A); gedifferentieerde cellen niet bezetten meer da...

Discussie

De meest kritische stappen voor de succesvolle generatie AAVS1 safe-haven gerichte menselijke iPSCs zijn: (1) efficiënt leveren van TALEN en donorplasmiden in iPSCs door transfectie; (2) het optimaliseren van dissociatie van iPSCs in enkele cellen voor transfectie en uitplaatdichtheid na transfectie; (3) optimalisatie van de dosis en de geneesmiddel-selectie op basis van de groei van iPSC lijn; (4) voorzichtig ontleden en het plukken van gerichte koloniën en de overdracht aan de nieuwe plaat / goed. In vergelijking met ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-Free, 10 ml	Corning	354230	Bewaar bij -20 °C.
DMEM/F-12	Life Technologies	11320-033	Bewaar bij 4 °C.
Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates	Corning	3506
Essential 8 Medium	Life Technologies	A1517001	Bewaar basal medium bij 4 °C. Bewaar supplement bij -20 °C.
Y-27632 dihydrochloride	Tocris	1254	Bewaar op kamertemperatuur. Eenmaal opgelost in H2O, bewaar bij -20 °C.
Sodium Chloride	Sigma	S5886-500G
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Life Technologies	15575-020
DPBS, no calcium, no magnesium	Life Technologies	14190-250
100 mm TC-Treated Culture Dish	Corning	430167
DR4 MEF 2M IRR - Academic	GlobalStem	GSC-6204G	Bewaar in vloeibare stikstof.
DMEM, high glucose, pyruvate	Life Technologies	11995-040	Bewaar bij 4 °C.
Defined Fetal Bovine Serum, US Origin	HyClone	SH30070.03	Bewaar bij -20 °C. Ontdooi bij 4 °C een nacht en verdeel in porties. Bewaar porties bij -20 °C tot ze nodig zijn.
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Life Technologies	11140-050	Bewaar bij 4 °C.
4D-Nucleofector Core unit	Lonza	AAF-1001B	onderdeel van het elektroporeringssysteem
4D-Nucleofector X unit	Lonza	AAF-1001X	onderdeel van het elektroporeringssysteem
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT)	Lonza	V4XP-3024	Bij aankomst verwijder de Primary Cell Solution en supplement en bewaar bij 4 °C.
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Life Technologies	A1110501	Bewaar bij -20 °C. Ontdooi een nacht bij 4°C en verwarm een portie in een 37 °C waterbad voor gebruik.
NutriStem XF/FF Culture Medium	Stemgent	01-0005	Bewaar bij -20 °C. Ontdooi een nacht bij 4 °C
AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 en pZT-AAVS1-R1)	Addgene	52637 en 52638
[header]
AAVS1-CAG-EGFP Homologous Recombination donor	Addgene	22212
Puromycin Dihydrochloride	Life Technologies	A11138-03	Bewaar bij -20 °C. Bereid werkporties van 1 mg/ml in ddH2O.
Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets	Fisher Scientific	13-678-20A
Sorvall Legend XTR (gekoeld), 120 V 60 Hz	Thermo Scientific	75-004-521
TX-750 4 × 750 ml Swinging Bucket Rotor	Thermo Scientific	75003607
Trypan Blue Solution, 0.4%	Life Technologies	15250-061