RNA isolatie van de Cel specifieke subpopulaties met behulp van laser-capture Microdissection Gecombineerd met Rapid immunolabeling

Samenvatting

Genexpressie analyse van een subset van cellen in een specifiek weefsel vormt een grote uitdaging. In dit artikel wordt beschreven hoe u een hoge kwaliteit totaal RNA van een specifieke cel populatie te isoleren door het combineren van een snelle immunolabeling methode met lasermicrodissectie.

Samenvatting

Lasermicrodissectie (LCM) kan de isolatie van specifieke cellen uit dunne coupes met een hoge ruimtelijke resolutie. Effectieve LCM vereist een nauwkeurige identificatie van cellen subpopulaties uit een heterogene weefsel. Identificatie van cellen van belang voor LCM is gewoonlijk gebaseerd op morfologische criteria of fluorescerend eiwit reporters. De combinatie van LCM en snelle immunokleuring biedt een alternatieve en efficiënte manier om specifieke celtypen te visualiseren en te isoleren van de omringende weefsels. Hoogwaardige RNA kan vervolgens worden geëxtraheerd uit een zuivere celpopulatie en verder verwerkt voor stroomafwaartse toepassingen, waaronder RNA-sequencing, microarray of qRT-PCR. Deze benadering is eerder uitgevoerd en kort beschreven in enkele publicaties. Het doel van dit artikel is om te illustreren hoe snel immunolabeling van een cel populatie uit te voeren terwijl het houden van RNA integriteit, en hoe deze specifieke cellen met behulp van LCM isoleren. Hierin, we illustrerend deze multi-step procedure immunokleuring en vastleggen van dopaminerge cellen in hersenweefsel van één dag oude muizen. We belichten de belangrijkste kritische stappen die speciale aandacht verdienen. Dit protocol kan worden aangepast aan een verscheidenheid van weefsels en cellen van belang. Onderzoekers uit verschillende disciplines zullen waarschijnlijk profiteren van de demonstratie van deze aanpak.

Inleiding

De hersenen bestaan ​​uit een grote verscheidenheid van verschillende typen neuronen vormen complexe netwerken. Deze neuronen zijn georganiseerd in verschillende groepen en subgroepen aan hun morfologie, connectiviteit en genexpressie patroon ^1. De ontwikkeling van microarrays, next-generation sequencing, en qRT-PCR de mogelijkheid geboden om de genexpressie profielen van neuronale populatie te vergelijken in verschillende biologische contexten ^1,2. Deze gevoelige analyses vereisen de precieze identificatie en isolatie van celtypen van belang terwijl RNA integriteit ^2-4. Fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) techniek wordt veel gebruikt om specifieke celtypen basis van celoppervlak markers en / of morfologie isoleren. FACS is een cel dissociatie stap voor het sorteren, hetgeen resulteert in een volledig verlies van ruimtelijke resolutie ^5. Vele neuronale subpopulaties van elkaar onderscheiden volgens hun anatomische verdeling the hersenen. Lasermicrodissectie toegepast op dunne hersensecties biedt een geschikte optie voor specifieke isolatie van cellen met een hoge ruimtelijke resolutie ^6-8. Een belangrijke beperking van LCM is de noodzaak cellen van belang op basis van morfologische criteria of fluorescent proteïne reporters genetisch in diermodellen identificeren. De ontwikkeling van nieuwe technieken om snel immunokleuring methoden RNA integriteit behouden, in combinatie met LCM voeren, laat nu de isolatie van cel subpopulaties te gaan met gen-profiling experimenten.

Deze aanpak is al eerder uitgevoerd en kort beschreven in enkele publicaties ^1,9-13. Hier tonen we een gedetailleerde procedure hoogwaardige RNA te verkrijgen van een specifieke subset van cellen in een complex weefselstructuur door het combineren snel immunokleuring met LCM. We laten zien hoe u de belangrijkste kritische stappen uit te voeren om maximale RNA herstel te verkrijgen en te voorkomen dat RNA degradatie als het kan sigdend effect genexpressie profilering.

Voor de demonstratie van dit protocol, werden dopaminerge neuronen van de ene dag oud muis middenhersenen gericht. Dopaminerge neuronen kunnen immunologisch met een antilichaam gericht tegen tyrosine hydroxylase (TH), de snelheidsbeperkende enzym dopamine synthese. Volgende TH immunostaining, individuele of groepen van dopaminerge neuronen kan vervolgens geïsoleerd worden met behulp van LCM. Gemicrodisseceerde cellen worden verzameld in de lysis buffer en RNA geëxtraheerd met behulp van een RNA isolatie kit. Kwaliteit en kwantiteit van geëxtraheerde RNA worden gemeten met behulp van een bioanalyzer ^5. Verdere analyse van genexpressie gebruikmaking RNA sequencing, microarray of qRT-PCR kan vervolgens worden uitgevoerd ^2,4,6. Als voorbeeld wordt een tweestaps qRT-PCR aangetoond op laser gevangen geïsoleerd dopaminerge domeinen. Relatieve kwantificatie van de expressie van twee dopaminerge neuronen marker genen illustreert de selectiviteit van dit protocol.

Protocol

OPMERKING: De experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de Canadese Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren en werden goedgekeurd door het Comité Université Laval Dierenbescherming.

1. Monstervoorbereiding

OPMERKING: In dit voorbeeld hebben we gebruikt muizenhersenen bij postnatale dag 1.

1. Gebruik hypothermie anesthesie in gemalen ijs gedurende 3-4 minuten voor pups vervolgens ontleden hersenen zo snel mogelijk in ijskoude L15 medium. Voer deze stap binnen 2 min.
2. Transfer ontleed hersenen in het inbedden van schimmel (vgl. Lijst van materieel) en vul met bevroren weefselverwerkingsproces media en zorg ervoor dat het monster te oriënteren in de gewenste positie. Freeze monsters onmiddellijk in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C. Voer deze stap binnen 30 sec.
   OPMERKING: Modellen kunnen enkele maanden zonder afbreuk te doen aan de RNA-kwaliteit worden opgeslagen.

2. Sectie

1. Traktatie membraan coated glasplaatjes (vgl. lijst van materiaal) met oppervlakte RNAse decontaminatie-oplossing voor elk spoor van RNAses elimineren. Was de dia's in DEPC water en laat ze drogen. Als alternatief, bakken dia's 's nachts bij 200 ° C.
2. Transfer ingevroren monsters in een cryostaat vooraf gereinigd met een oppervlak RNAse decontaminatie oplossing. Stel cryostaatkamer temperatuur op -20 ° C en plak monsters bij 10 urn dik. Verzamel materiaal secties op het membraan gecoate glaasjes en laat ze drogen 10 min voordat kleuring. Alternatief opslag glijdt bij -80 ° C tot kleuring.

3. Bereiding van kleuringsvloeistoffen

1. Bereid alle oplossingen net voor de start van het experiment en gebruik RNAse inhibitor alle kleuringsvloeistoffen (behalve wasoplossingen) om RNA afbraak te voorkomen.
2. Bereid de bufferoplossing. Gebruik dezelfde buffer in alle oplossingen (bestaande uit RNAse-vrij fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) aangevuld met 1% BSA,0.2% triton en 2% RNAse inhibitor). Voor elk objectglaasje, bereiden 400 gl bufferoplossing (200 ul voor de primaire en 200 ul van de secundaire antilichamen).
3. Bereid het fixatief gebruiken 70% ethanol bij -20 ° C bewaard. Houd weefsel fixatieprocedure minimale tot een drastische vermindering van de RNA-extractie opbrengst vermijden.
   OPMERKING: U gebruikt 95% ethanol oplossing aangevuld met 5% azijnzuur bij -20 ° C bewaard.
4. Bereid de primaire antilichaam oplossing door verdunning van het primaire antilichaam in de bufferoplossing. Voor dopaminerge neuronen etikettering, gebruik een antilichaam gericht op de tyrosine hydroxylase (TH, snelheidsbeperkende enzym voor dopamine productie). Gebruik een hoge concentratie antilichaam te compenseren voor de snelle incubatietijd. Gebruik TH antilichaam bij een verdunning van 1:25.
   OPMERKING: Bij normale immunofluorescentie protocol, dit antilichaam geeft een sterk signaal bij nacht geïncubeerd bij een verdunning van 1: 1000. In dit protocol wordt het gebruikt 40X meer concentrated vanwege de korte incubatietijd. Door de hoge concentratie antilichaam gebruikt voor deze methode is, een standaard immunokleuringen parallel om eventuele verhoging van de niet-specifieke labeling controleren.
5. Bereid het secundaire antilichaam oplossing door verdunning van de secondaire antilichaam in de bufferoplossing. Gebruik een gebiotinyleerd secundair antilichaam bij een concentratie van 1: 100.
   Opmerking: In dit voorbeeld gebruikten we een gebiotinyleerd anti-konijn antilichaam.
6. Bereid de avidine-biotine complex (ABC) oplossing voor de detectie van gebiotinyleerde secundaire antilichamen. Voeg ABC door toevoeging van de verbinding A en verbinding B bij een concentratie van 1: 100 verdund in DEPC PBS gesupplementeerd met 2% RNAse inhibitor. Bereid de avidine-biotine complex 30 min alvorens het aan de dia.

4. kleuring

1. Ontdooien een of twee dia op het moment van -80 ° C door de knop ze snel in de lucht (of gebruik een föhn). Surround secties met een hydrofobebarrière pen en laten drogen voor een paar sec.
   1. Zet de objectglaasjes in de koude fixeermiddel oplossing niet meer dan 5 min bij -20 ° C. Schud eenmaal in de lucht overmaat fixeeroplossing dia verwijder snel dip in DEPC PBS 6-8 keer te wassen.
   2. Flick de dia's om overtollig DEPC PBS te verwijderen. Zorg ervoor dat de dia's ontdooien stap niet meer dan 5 min.
2. Plaats de glaasjes op een schone bak (voorbehandeld met een oppervlak RNAse decontaminatie oplossing elk spoor van RNAses elimineren) en plaats 200 pl van het primaire antilichaam oplossing op elke slede (konijn anti-TH) gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Dip glijdt snel in DEPC PBS 3 keer voor het wassen en flick de dia's een keer om de overmaat aan DEPC PBS te verwijderen.
3. Put 200 pl van het secundaire antilichaam oplossing elke dia gedurende 6 minuten bij kamertemperatuur. Dip glijdt snel 3 keer in DEPC PBS te wassen en flick de dia om de overmaat DEPC PBS verwijderd.
4. Zet 200 ul van de ABC solutie op elke dia gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur. Dip glijdt snel in DEPC PBS 3 keer voor het wassen en flick de dia's om het overtollige DEPC PBS te verwijderen.
5. Bereid de DAB (3,3 'diaminobenzidine) oplossing tijdens de 4 min van incubatie in de ABC-oplossing. Gebruik de reagentia die in de kit (DAB peroxidasesubstraat Kit). Meng 1 druppel op voorwaarde buffer, 1 druppel van DAB-oplossing en 1 druppel 30% H ₂ O ₂ in 2,5 ml DEPC water. Meng de oplossing door het omkeren.
6. Neem 196 ul van de DAB-oplossing en voeg 4 pi (2%) van RNAse inhibitor oplossing net voor uitstrijken op objectglaasjes. Plaats de glaasjes op een schone bak (voorbehandeld met een oppervlak RNAse decontaminatie oplossing) en zet de 200 ui DAB oplossing op objectglaasjes.
   OPMERKING: DAB oplossing moet within1 of 2 min reageren.
7. Dip glijdt snel in DEPC PBS 3 keer voor het wassen en zet dia's voor enkele seconden in absolute ethanol. De dia's drogen door vegen ze in de lucht (of gebruik een föhn).
   OPMERKING: Dia's kunnen bij -80 ° C voor toekomstig gebruik worden opgeslagen of verwerkt voor LCM.

5. lasermicrodissectie

1. Ontdooien glijbanen snel door de knop ze in de lucht (of gebruik een föhn). Zorg ervoor dat de dia's ontdooien stap niet meer dan 5 min.
2. Overgaan tot LCM. Plaats de dia onder de microscoop met het monster kant naar het verzamelen dopje. Kies de beste vergroting voor het monster. Pas de focus naar de cellen van belang te zien.
   1. Definieer de snij-gebied en het monteren kan beginnen met de laser. Verzamel ontlede cellen of stukje weefsel in de verzamelbuis dop gevuld met 50 ul lysisbuffer (uit RNA extractie kit). Zorg ervoor dat de stap van het LCM niet meer dan 30 min.
3. Uittreksel totaal RNA van geïsoleerde cellen met behulp van een RNA-extractie kit (cf. Lijst van materialen). Volg protocol van de fabrikant.
   1. Incubeer verzamelde cellen gedurende 30 min bij 42 ° Clyseren van de cellen. Voorwaarde het RNA zuiveringskolom door toevoeging van 250 pl buffer conditionering. Load 50 pl ethanol gelyseerde cellen. Laad de 100 ui gelyseerde cellen op een gepreconditioneerd zuiveringskolom.
   2. Centrifugeer de kolom bij 16.000 xg gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Tweemaal Was de kolom met wasbuffers. Elueren in de minimale aanbevolen hoeveelheid (11 pl) van RNAse-vrij water (niet DEPC behandeld als het kan interfereren met de bioanalyser). Houd 2 pl te testen kwaliteit.
      Opmerking: Alle oplossingen en reagentia worden in de kit.

6. cDNA Synthese en kwantitatieve RT-PCR

1. Omgekeerde transcriptie RNA monsters van laser gevangen dopaminerge cellen in complementaire DNA met behulp van reverse transcriptase en oligo (dT). Volg protocol van de fabrikant (vgl. Lijst van materiaal).
2. Met 1 pl cDNA voor qRT-PCR amplificatie met gen-specifieke primers. Opgezet PCR reaegen in 20 ul volume met één component hot start reactiemengsel voor kwantitatieve PCR zoals aanbevolen door de fabrikant. Het uitvoeren van elke reactie in drievoud.
   1. Voor de hier beschreven experimenten, gebruikt u de volgende primerparen: GAPDH--F (5'-CCA CCC AGA AGA CTG TGG AT-3 ') / GAPDH-R (5'-GGA TGC AGG GAT GAT GTT CT-3'); Rpl13a-F (5'-ACA GCC ACT CTG GAG GAG AA-3 ') / Rpl13a-R (5'-CTG CCT GTT TCC GTA ACC TC-3'); Th-F (5'-CAG TGG ATG AGG TGT CTC 3 ') / Th-R (5'-GAA AAT CAC GGG CAG ACA G-3'); AADC-F (5'-CAT GAG AGC TTC TGC CCT TC-3 ') / AADC-R (5'-GGA TGT GGT CCC CAG TGT AG -3').
3. Voer kwantitatieve RT-PCR-amplificatie met de volgende snelle cyclusparameters: 95 ° C gedurende 5 minuten gevolgd door 45 cycli van 10 seconden 95 ° C, 10 sec bij 60 ° C en 10 sec bij 72 ° C. Voeren smeltcurveanalyse met behulp van de standaard instelling van het instrument te BEPALIne homogeen productvorming.
4. Analyseer de gegevens met behulp van de ingebouwde software.
   1. Normaliseren van de expressiewaarden van DA merkergenen Th en AADC met de expressie van de twee referentie-GAPDH en Rpl13a relatieve expressieniveaus verkregen zoals eerder ¹⁴ beschreven.

Resultaten

Deze snelle immunolabeling procedure maakt visualisatie van cellen van belang terwijl RNA integriteit. Figuur 1 illustreert de stappen van het weefsel voorbereiding voor RNA-extractie. Na cryosectioning worden dopaminerge neuronen gelabeld met een antilichaam gericht tegen de tyrosine hydroxylase (gemerkte neuronen weergegeven in bruin). Afhankelijk van de experimentele betrokken kunnen enkele cellen of groter gebied van belang worden geïsoleerd middels LCM (figuur 1D - E).

Discussie

De meest kritische punt van deze methode bestaat uit het labelen van cellen plaats en voorkomt RNA degradatie. Zoals RNAses zijn actief in waterige oplossingen, de vermindering incubatietijd verbetert RNA behoud ^11,15. Alle gebruikte oplossingen moeten met DEPC tot RNAses inactiveren. Alle materialen en oppervlakken moeten worden behandeld met een oppervlakte RNAse decontaminatie oplossing RNAses verontreiniging te voorkomen. Tenslotte, in deze omstandigheden, de toevoeging van RNAse inhibitor in alle oplossi...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Membrane coated slides	Leica Biosystems	11505158	MembraneSlides PEN-Membrane 2,0 µm; 50 pcs
Surface RNAse decontamination solution	Life technologies	AM9780	RNaseZap
Fixatief			70% Ethanol bewaard bij -20 °C
Anti-TH	Pel-Freez	P40101	1:25
RNAse vrije buffer			DEPC PBS + 1% BSA+0.02% triton
RNAse remmer	Promega	N2615	Rnasine Plus Rnase Inhibitor 40 kU/ml (voorraad)
Anti-konijn gebiotinyleerd	Vector Laboratories	BA-1000
Vectastain Elite ABC kit Standaard	Vector Laboratories	PK-6100	8µl/ml
DAB Peroxidase Substraat Kit	Vector Laboratories	SK-4100
RNA isolatie kit	Life technologies	KIT0204	Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit
H2O2 30%	Sigma	HC4060
Absoluut ethanol
Laser microdissectie systeem	Leica microsystems		Model AS-LMD
DEPC	Alfa Aesar	B22753-14
Bioanalyzer	Agilent		Agilent 2100 Bioanalyzer
Inbeddingsvorm	Leica Biosystems	14702218311	6x8mm
Hydrofobe barrière pen	Vector Laboratories	H-4000
Inbeddingsmedium voor bevroren weefsel	Tissue-Tek	4583
Bioanalyzer chip	Aligent Technologies	5067-1513	RNA 6000 Pico LabChip gebruikt met Agilent 2100 Bioanalyzer
Hot start reactiemix voor kwantitatieve PCR	Roche	6402712001	Fast Start Essential DNA Green Master
Reverse transcriptase	Life technologies	11752-050	SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix voor qRT-PCR