Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Contrast Imaging in muis embryo's met behulp van hoge-frequentie Ultrasound

14.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52520

⸱

4 maart 2015

 ,  ,  , 
1Department of Medical Biophysics, University of Toronto, 2Sunnybrook Research Institute, 3Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, Toronto

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om echografie microbellen contrastmiddelen in levende, geïsoleerde late zwangerschap stadium muizen embryo's te injecteren. Deze methode maakt de studie van perfusie parameters en vasculaire moleculaire merkers binnen het embryo met contrastmiddel hoogfrequente ultrasone beeldvorming.

Samenvatting

Ultrasoundcontrast-verbeterde beeldvorming kan essentiële kwantitatieve informatie overleveren met betrekking tot weefselvasculairiteit en perfusie en, in gerichte toepassingen, de detectie en meting van vasculaire biomarkers op moleculair niveau vergemakkelijken. Binnen de muisembryo kan deze niet-invasieve techniek worden gebruikt om fundamentele mechanismen te onthullen die ten grondslag liggen aan de vasculaire ontwikkeling in het vroege muiscirculatiesysteem en in genetische modellen van hart- en vaatziekten. De muisembryo presenteert zich ook als een uitstekend model voor het bestuderen van de adhesie van microbubbels aan angiogenese-doelwitten (inclusief vasculair endotheelgroeifactorreceptor 2 (VEGFR2) of αvβ3) en voor het beoordelen van de kwantitatieve aard van moleculaire echografie. Daarom ontwikkelden we een methode om echografiecontrastmiddelen in het vaatstelsel van levende, geïsoleerde embryo's te introduceren. Dit biedt vrijheid in termen van injectiecontrole en positionering, reproduceerbaarheid van het beeldvlak zonder obstructie en beweging, en vereenvoudigde beeldanalyse en kwantificering. Murine embryo's in een late zwangerschapsfase (embryonale dag (E)16.6 en E17.5) werden geïsoleerd uit de baarmoeder, voorzichtig uit de dooierzak gehaald en microbubbelcontrastmiddelen werden geïnjecteerd in aders die toegankelijk zijn op het chorionoppervlak van de placentale schijf. Vervolgens werd niet-lineair contrastechografie gebruikt om een aantal basisperfusieparameters (piekversterking, was-in-snelheid en tijd tot piek) te verzamelen en het gerichte microbubbelbinding in een endoglin-muismodel te kwantificeren. We tonen de succesvolle circulatie van microbubbels binnen levende embryo's en de bruikbaarheid van deze aanpak bij het karakteriseren van embryonaal vaatstelsel en microbubbelgedrag.

Inleiding

Contrastversterkte echografie maakt gebruik van microbellen contrastmiddelen te visualiseren en te karakteriseren de vasculaire milieu. Deze agenten in staat stellen niet-invasieve evaluatie van de microcirculatie, vasculariteit en cardiovasculaire functie. Bovendien kan modificatie van het oppervlak bel leiden gerichte microbellen binden aan endotheel biomarkers, zoals aangetoond in preklinische toepassingen van angiogenese, atherosclerose en ontsteking 1,2 waardoor moleculaire ultrasone beeldvorming van vasculaire voorvallen mogelijk. Contrastechografie ultrageluid kan derhalve worden gebruikt om de complexe en diverse omgevingen die invloed gezonde en zieke bloedvaten toestanden 3-5 identificeren.

In de afgelopen aantal jaren is de belangstelling voor het nut van microbellen beeldvorming uitgebreid tot de veelzijdige muis embryo model. Als een model van de ontwikkeling van zoogdieren, introductie van microbellen in de embryonale vaatstelsel verbetert fysiologischestudie van de ontwikkeling bloedsomloop (bijvoorbeeld bloedstroom, hartminuutvolume) en in geval van transgene en gerichte mutant muismodellen van hartziekte 6,7, kan informatie krijgen over hoe genetische factoren veranderen cardiovasculaire functie. In feite, kwantitatieve en kwalitatieve analyses van 2D embryonale hersenen vasculatuur al bereikt 8. Bovendien, de muis embryo presenteert als een uitstekend model voor het onderzoeken van de binding van gerichte microbellen vasculaire markers in vivo. Bartelle et al. 9, bijvoorbeeld, hebben avidine microbellen geïntroduceerd in embryo cardiale ventrikels om gerichte binding beoordelen Biotag-BirA transgene embryo's en onderzoeken vasculaire anatomie. Het genereren van heterozygote en homozygote muismodellen kunnen ook worden gebruikt als een surrogaat voor tumormodel studies gericht op de kwantitatieve aard van moleculaire ultrageluid bepalen - een belangrijke benchmark vertaling van deze techniek om de kliniek.

Microbelletjes worden het vaakst ingevoerd om de embryonale circulatie via intra-cardiale injecties in enkele embryo's blootgesteld via een laparotomie 8-10. In utero injecties worden echter geconfronteerd met een aantal uitdagingen. Deze omvatten injectie begeleiding, de noodzaak om de beweging in de moeder en geëxterioriseerde embryo tegen te gaan, het onderhoud van hemodynamische levensvatbaarheid bij de moeder en exteriorized embryo's, het aanpakken van de lange-termijn effecten van anesthesie en complicaties als gevolg van bloedingen 11. Daarom is het doel van het onderzoek was een techniek voor het injecteren van microbelletjes in geïsoleerde levende laat-stadium embryo 12 ontwikkelen. Deze optie biedt meer vrijheid in termen van injectie controle en positionering, reproduceerbaarheid van het beeldvlak zonder obstructie, en vereenvoudigde beeldanalyse en kwantificering.

In de huidige studie, schetsen we een nieuwe procedure voor de injectie van microbellen in levende muizen embryo's for de toepassing van het bestuderen van microbellen kinetisch gedrag en van het bestuderen van gerichte microbellen binden aan endogene endotheeloppervlak markers. Niet-lineaire contrast specifieke echografie wordt gebruikt voor het meten van een aantal basis perfusieparameters inclusief piekverhogingsfactor (PE), wassen-in en de tijd tot piek (TTP) in geïsoleerde E17.5 embryo's. We tonen ook de geldigheid van de embryo voor de beoordeling van de kwantitatieve aard van moleculaire ultrageluid in een embryonale endoglin functieverlies transgeen muismodel, waarbij endoglin een klinisch relevant doel vanwege de hoge expressie in vasculaire endotheelcellen op plaatsen van actieve angiogenese 13 . De hechting van-endogline gerichte (MB E), rat isotype IgG 2 controlepunten (MB C) en ongerichte (MB U) microbellen wordt geëvalueerd in heterozygote endoglin (Eng +/-) en homozygote endoglin (Eng + / +) uiten van embryo's. Analyse van de gerichte binding blijkt dat moleculaire echografie te maken tussen genotypen en endoglin betrekking receptor dichtheden meetbare moleculaire ultrageluid niveaus.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: De experimentele procedures uitgevoerd in dit onderzoek werden goedgekeurd door de Animal Care Committee bij Sunnybrook Research Institute (Toronto, Ontario, Canada). Procedures voor de humane behandeling van dieren moeten worden opgevolgd. Aangenomen wordt dat de onderzoeker wordt getraind in de basiswerking van een ultrasoon beeldvormingssysteem. Dit protocol werkt het beste met twee personen.

1. Dierlijke Modellen

  1. Mate CD-1 mannelijke en vrouwelijke Mus musculus wildtype embryo's voor perfusie studies verkrijgen.
  2. Voor moleculaire beeldvorming studies, genereren Eng +/- muizen door homologe recombinatie met embryonale stamcellen van 129 / Ola oorsprong zoals beschreven door Bourdeau et al. 14.
    1. Terugkruisend B6- Eng +/- muizen, vriendelijk verkregen van Dr. Michelle Letarte, de CD-1 achtergrond. Gebruik Eng +/- CD-1 teruggekruist embryo, evenals hun Eng + / + nestgenoten controls. Mate de muizen om geënsceneerde embryo's te produceren.

2. Experimentele Voorbereiding

  1. Initiëren paring van muizen en check stekkers dagelijks. Embryonale dag 0,5 wordt gedefinieerd als 's middags van de dag een vaginale plug wordt waargenomen.
  2. Bereid embryomedium door toevoeging van 50 ml foetaal runderserum, 5 ml 1 M HEPES en 5 ml penicilline-streptomycine (10.000 eenheden penicilline, 10.000 pg streptomycine) tot 500 ml Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) met hoge glucose (4500 mg / L). Wikkel de fles in folie en bewaar gekoeld bij 4 ° C.
  3. Centrifugeer duidelijk echogel in 50 ml conische buizen bij 140 xg gedurende 20 min. Trekken gel omhoog in 30 ml spuiten. Vul extra (gemarkeerd) 30 ml spuiten met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en zet apart. Een nest van embryo's zal in het algemeen tussen 2-3 spuiten van ultrasound gel en 4 spuiten van PBS.
  4. Trek ongeveer 30 glazen naalden en voorzichtig te bevestigen aan een strook van plasticinein een 100 x 20 mm celkweekschaaltje. Dit verzekert dat de naalden gescheiden en veilig tijdens hantering. Met behulp van een glas puller, gebruikt u de volgende instellingen op 1 x 90 mm glas haarvaten met gloeidraad: Heater 77, Sub magneet 55, Main magneet 70.
  5. Bereid 11:50 dissectie platen (genoeg om elk embryo zorgen binnen een nestje zal zijn eigen schotel te ontvangen), met behulp van een 1: 8 volumeverhouding van verharder naar de basis. Giet 40 ml base in een 50 ml conische buis. Voeg 5-6 ml verharder en roer met een houten stok.
    1. Giet het mengsel in 60 x 15 mm cultuur gerechten, vullen elkaar aan ongeveer de helft. Laat stand O / N op te zetten.
  6. Bevestig vrouwelijke luers tot 400 mm lange stukken van polyvinylchloride (PVC) buis (binnendiameter: 0,79 mm). De slangen moeten bereiken vanaf de spuit pomp naar de echografie podium comfortabel.

3. Experimentele Set-up

  1. Schik de imaging platform onder de chirurgische microscoop met een 3D-motor en de lineaire array 21 MHz transducer.
    1. Orient het platform, zodat de rail te monteren is aan de linkerkant, met het podium direct gepositioneerd onder de microscoop.
    2. Bevestig de 3D-motor aan het kogelgewricht van de uitbreiding van de arm van het platform. Schroef de quick release functie van de transducer klem in de snelsluiting monteren op de motor, naar voren gericht, en de positie van de transducer hoofd in de klem, de bevestiging van de vergrendeling.
    3. Bevestig de transducer connector in de actieve poort op het voorpaneel van de kar. Zet de machine aan.
  2. Inleiding van de 21 MHz ultrasone transducer, de instelling 'cardiologie' selecteren voor moleculaire beeldvorming studies, en de 'algemene' voor perfusie studies. Shift all time-gain-compensatie schuifregelaars om de exacte middelste stand. Voor 'Contrast Mode', stelt u de volgende parameters: Frequentie: 18 MHz, zendvermogen: 4%, (0,39 MPa), Contrast Gain: 30 dB, Focussen: 6 & 10 mm, Contrast Mode: Niet-lineaire, Burst tijd: 100% 0.1sec, Balkbreedte: Breed.
  3. Aliquot 40 ml embryomedium elk in vier 50 ml conische buizen. Plaats op ijs.
  4. Verhit 1 L water in een 2 liter bekerglas op een hete plaat. Handhaaf bij 45 ° C. Voeg een spuit ultrasone gel en PBS om de beker te verwarmen. Houd deze temperatuur door het monitoren met een thermometer allen tijde.
  5. Opzij tien ingesteld twaalf 1 ml injectiespuiten en 10-12 21 G naalden voor het injecteren van microbelletjes.

4. chirurgische ingreep

OPMERKING: Laat een helper de voorbereiding van de belletjes (fase 5), terwijl de chirurg begint de chirurgische ingreep. De hier beschreven protocol is aangepast van Whiteley et al. 15

  1. Verzamel E16.5 of E17.5 embryo's van de zwangere vrouwelijke muis volgende cervicale dislocatie.
    OPMERKING: De effecten van narcose op embryo's zijn nog niet in detail bestudeerd 16. Aanvullende methoden, met inbegrip van onthoofding, kan het aangewezen op zijnties voor het offer van de zwangere muizen.
    1. Opengesneden de buik om de baarmoeder en embryo zichtbaar. Voorzichtig en snel verwijderen de baarmoeder door te snijden bij de uiteinden van de baarmoederhoorns (de eierstokken en baarmoeder vaten doorsnijden) en doorsnijden op de vagina en de blaas.
    2. Met splinter tang, breng de baarmoeder met een buis van 40 ml ijskoude embryomedium zo snel mogelijk zonder beschadiging van de embryo's. Gooi de muis karkas.
  2. Verhuizen naar microscoop en podium. Storten de baarmoeder in een 100 x 20 mm celkweekschaaltje. Breng de baarmoeder in een nieuwe schotel gevuld met 50 ml verse embryo media.
  3. Met behulp van gesteriliseerde (70% ethanol tros) fijne tang voorzichtig scheuren en weg te trekken van de buitenste membranen van de baarmoeder te beginnen aan de ene kant. Expose de placenta decidua, pariëtale dooierzak en Reichert's membraan te scheiden en te verwijderen uit de onderliggende viscerale dooierzak.
  4. Ontleden de embryo's een voor een, het bijhouden van de viscerale yOLK zakken intact en het hanteren van de placenta zo voorzichtig mogelijk 17. Zorg ervoor dat het scheuren van de dooierzak te vermijden als de embryo's pop uit onmiddellijk.
    1. Gebruik de geperforeerde lepel naar de embryo's te verplaatsen naar een ander gerecht gehouden op ijs met verse embryo media. Houd de embryo gekoeld totdat het nodig is. Wijzig de media in het embryo gerecht elke 1-1,5 uur. Met deze voorwaarden embryo levensvatbaar tot 4 uur na dissectie.

5. Microbellen Voorbereiding

OPMERKING: Voer moleculaire beeldvorming met ultrageluid met behulp van zowel gerichte en ongerichte microbellen. I) antilichaam gericht microbellen, ii) controle isotype antilichaam gericht microbellen en iii) ongerichte microbellen: Een enkel experiment kan zo veel als 3 afzonderlijke flacons van microbellen vereisen. Het contrastmiddel wordt geleverd als een droge-vries poeder en moet opgelost worden met een zoutoplossing voor injectie. Er zijn ~ 2 x 10 9 microbellen in elke ongerichte microbubble flacon en ~ 8.8 x 10 8 microbellen in het doel klaar flesjes. De microbellen zijn stabiel tot 3 uur na reconstitutie.

  1. Reconstructie van Target Ready Flesjes
    OPMERKING: Voorbeelden van target klaar voorbereidingen: endoglin gerichte microbellen (MB E, met gebiotinyleerd rat MJ 7/18 antilichaam tegen muis endoglin; in huis hybridoma- faciliteit); vasculaire endotheliale groeifactor receptor 2 (VEGFR2) gerichte microbellen (MB V, biotine anti-muis CD309); rat isotype IgG 2 controle antilichaam gericht microbellen (MB C, biotine rat isotype IgG 2 controlepunten targeting muis IgG2a).
    1. Verdun het antilichaam oplossing (20 ug) in 1 ml (eindvolume) zoutoplossing. Houden op het ijs.
    2. Vul spuit met 1 ml zoutoplossing, het verwijderen van alle luchtbellen. Het aanbrengen van een 21 G naald, injecteer de oplossing langzaam in de microbellen flacon.
    3. Trek langzaam de zuiger, het verwijderen van 1 ml lucht, en de naald terug te trekken. Voorzichtigageren. Laat staan ​​5 minuten op ijs.
      OPMERKING: Ultrasound microbellen kunnen worden vernietigd onder hoge druk omgevingen.
    4. Na de verstreken tijd, vult een nieuwe spuit met het antilichaam verdunning en aan de juiste flesje. Schud voorzichtig. Laat het mengsel (thans 2 ml) gedurende 10 minuten staan. Houden op het ijs. Uitgaande volledige oppervlak conjugatie, het gemiddelde aantal gebonden ligand voor de microbellen ongeveer 18 7,600 liganden / pm2.
  2. Reconstructie van Ongerichte Flesjes
    1. Vul spuit met 1 ml zoutoplossing, het verwijderen van alle luchtbellen. Het aanbrengen van een 21 G naald, injecteer de oplossing langzaam in de microbellen flacon.
    2. Trek langzaam de zuiger, het verwijderen van 1 ml lucht, en de naald terug te trekken. Schud voorzichtig. Laat staan ​​5 min. Voeg een extra 1 ml zoutoplossing, zoals boven beschreven. Schud voorzichtig en laat 10 minuten op ijs.
  3. Coulter Tellen
    1. Schud voorzichtig de gewenste microbellen flacon en teken ~50 ul van de oplossing in een 1 ml spuit via een 21 G naald. Injecteer de microbellen in een lege 2 ml microcentrifugebuis.
    2. Pipetteer een 10 ul monster van microbellen voorraad oplossing in 10 ml oplosmiddel.
    3. Na voorzichtig mengen, beoordeelt de concentratie en de grootte verdelingen van de microbellen bevolking met behulp van Coulter tellen (zie lijst van materialen). Telling minste drie 50 gl metingen (per flacon monster) met een 30 urn opening.
  4. Het voorbereiden Microbelletjes voor injectie
    OPMERKING: De assistent voert deze stap wanneer 'Injectie van Microbelletjes tot embryo's' (stap 6) wordt begonnen. Elk embryo eenmaal geïnjecteerd met het type microbellen gekozen voor elke injectie willekeurig door de assistent, zodat alle typen microbellen gelijkmatig verdeeld over de procedure maar gezien in willekeurige volgorde worden geselecteerd. Controleer de chirurg blind het type bubble geïnjecteerd.
    1. Bepaal the volume voorraad bellenoplossing vereist om een uiteindelijke concentratie van 1 x 10 8 MB ​​/ ml te produceren in een volume van 400 pl (berekent het volume met de stock concentraties gemeten in 5.3.3). Aliquot de overeenkomstige volume van zout in een lege microcentrifugebuisje.
    2. Schud voorzichtig de geselecteerde microbellen flesje tot opneming van een overmaat volume (~ 50 pi groter dan hierboven berekend) van de oplossing in een 1 ml injectiespuit via een 21 G naald. Injecteer de microbellen in een lege microcentrifugebuisje.
    3. Pipetteer de noodzakelijke volume van microbellen stockoplossing en toe te voegen aan de hoeveelheid van een zoutoplossing. Meng door voorzichtig roeren met de punt van de pipet.
    4. Teken de verdunde microbellen oplossing in een schone spuit met behulp van de 21 G naald. Verwijderen van de naald, te elimineren eventuele luchtbellen uit de spuit en bevestig de luer en slangen. Duw langzaam de oplossing voor het einde van de slang en zorg ervoor dat er geen luchtbellen te genereren.
    5. Plaats de syringe een spuit infusiepomp op de microbellen afgeven met een snelheid van 20 pl / min voor een totaal volume van 20 pl. Bevestig een getrokken glazen naald aan het uiteinde van de slang. Verplaats de pomp dichtbij de injectie fase.

6. Injectie van Microbelletjes tot embryo's

  1. Willekeurig te selecteren en te verwijderen (met geperforeerde lepel) één embryo uit de gekoelde media gerecht. Plaatsen in dissectie gerecht gelegen op de echo podium onder de stereoscoop en verwijder de dooierzak en vruchtwater membranen met de fijne tang, snijden / scheuren van de kant die het minst doorbloed verschijnt (de antimesometrial kant). Dit wordt het gemakkelijkst bereikt door het doorboren van een gebied dat grenst aan het hoofd regio.
    1. Snij genoeg om de embryo vanuit verwijderen, maar niet meer. Stabiliseren van de dissectie gerechten met kleine stukjes plasticine.
  2. Voorzichtig manoeuvreren de sac van rond het embryo. Plaats de embryo op zijn kant, met de placenta ennavelstreng schepen aan de voorkant. Met behulp van het insect pinnen, vastpinnen de dooierzak (4 pins aanbevolen) en de randen van de placenta als nodig is om aan te brengen op zijn plaats. Vermijd grote bloedvaten.
  3. Was de embryo met voorverwarmde 45 ° C PBS totdat het embryo herleeft. Identificeer de navelstreng en de bijbehorende vasculaire netwerk. Plaats de schotel, zodat de injectie comfortabel kan worden gedaan.
    OPMERKING: Eenmaal opgewarmd, zal het bloed in het embryo beginnen te stromen, zichtbaar te pompen in de arteria umbilicalis. Wanneer stroom eerst begint, zal de aderen een helder rood zijn, met het bloed in beide schepen snel te zien zijn identiek. De takken die voortvloeien uit de navelstreng ader overlay meestal die van de arteria umbilicalis op de placenta oppervlak.
  4. Zodra het embryo is nieuw leven ingeblazen, bedek het (maar niet de placenta) met voorverwarmd VS gel, en zorg ervoor dat fijntjes eventuele luchtbellen (met behulp van de fijne tang) verwijderen uit rond het embryo. Vul de schaal met voorverwarmde PBS.
    OPMERKING: Houd een oogje op het niveau van solutide in de PBS en gel spuiten toevoegen backup spuiten aan de verwarming bekerglas als nodig.
  5. Monteer de glazen naald op een grote bal van plasticine aan de rand van de dissectie schaal en steek de naald uiteinde in de PBS. Het kiezen van een ader op het chorion oppervlak van de placenta schijf, zo ver van de belangrijkste tak als redelijk, trim het puntje op maat met een schaar. Injectie is het makkelijkst als het puntje is gesneden in een lichte hoek. Verwijder scherpe randen van het glas met de rand van de veer schaar.
  6. De spuitpomp langzaam injecteer de microbellen oplossing 20 pl / min in de glazen naald totdat alle lucht uit de naaldpunt en microbellen te zien vrij stromen in de PBS. Stop de pomp en reset voor een injectie volume van 20 pl. Sta niet toe dat de lucht aan vasculaire systeem van de embryo's tijdens de injectie te geven.
  7. Plaats de glazen naald voorzichtig in een van de aderen in de placenta en zorgen dat het immobiel. Swing weg de m³oscope hoofd en de positie van de transducer boven het embryo. Initiëren beeldvorming.

7. Echografie Molecular Imaging

OPMERKING: De contrast lineaire beeldomstandigheden vooraf vastgestelde positie van de transducer, zodat de embryo gelijkmatig is gelegen tussen de foci bij 6 en 10 mm. Eenmaal geplaatst, start de bolus injectie van de microbellen. Wanneer de injectie is voltooid, start de timer.

  1. Perfusie beeldvorming
    1. Zorg ervoor dat het maximum aantal frames voor niet-lineaire contrast modus is geselecteerd door op de 'studie management' knop en op het tabblad 'Voorkeuren' aan de bovenkant van de studie browser. Kruis het juiste vakje in het venster 'Voorkeuren'.
    2. Pas de beeldvorming instellingen door het initiëren van niet-lineaire beeldvorming. Drukt u op de 'contrast mode' knop op het bedieningspaneel. Verfijnen van de 2D-winst door het aanpassen van de 'winst & #8217; bellen naar 30 dB, het verminderen van de macht om 4% met behulp van de 'macht' te kiezen, de frequentie te verlagen tot 1 Hz met behulp van de 'frequentie' te kiezen en stel de bundelbreedte (linksonder) om breed gebruik van de rollerball / muis.
      OPMERKING: Alle bedieningselementen bevinden zich op het bedieningspaneel van de ultrasound systeem.
    3. Leg de hele wassen-in en dissipatie van de microbellen bolus door het opnemen van een 20 min cine lus aan een frame rate van 1 Hz. Druk op scan / vries om de data-acquisitie te starten.
    4. Zodra de volledige reeks van opnamen is gemaakt, drukt u op de 'cine store' knop op het bedieningspaneel om de volgorde van de beelden op te slaan in het systeem buffer. Het systeem creëert een datumstempel cine lus van de niet-lineaire contrast model verkregen gegevens.
  2. Gerichte Microbelbeeldvorming
    1. Onder 'Voorkeuren', stelt de uitbarsting tijd tot 0,1 sec. Stel de juiste beeldvorming parameters met behulp van de controles described hierboven (7.1.2.).
    2. Initiëren lineaire contrast beeldvorming door op de 'contrast mode' knop op het bedieningspaneel. Controleer de embryo goed ligt onder de transducer en de stroom van microbellen contrastmiddel via embryo zichtbaar in het beeld lineaire contrastmodus.
    3. Om gerichte microbellen binding tijdens de embryonale moleculaire beeldvorming studies te beoordelen, zodat de microbellen circuleren ongestoord gedurende 3 min en 40 sec na de voltooiing van de injectie. Deze tijd is de handhaving van de circulerende microbellen mogelijk. Druk op 'scan / freeze' om beeldvorming te stoppen in deze tijd.
    4. Na 3 min en 40 sec, cv beeldvorming te bevestigen dat het embryo is nog zichtbaar, afdoende is afgedekt met PBS, en dat microbellen blijven circuleren. Druk op 'scan / freeze' om beeldvorming te starten.
    5. Verwerven van de verstoring / replenishment sequentie op 3 minuten en 50 seconden na de injectie door het opnemen van een 'pre-destructie 'akoestische respons sequentie op 29 Hz. Druk op 'scan / freeze' om de data-acquisitie te starten. Op 4 min na injectie 18,19, starten een 0,1 sec hoogfrequente akoestische uitbarsting. Drukt u op de 'burst' knop om een ​​uitbarsting te implementeren.
    6. Doorgaan naar beelden op te nemen voor de rest van de reeks (totdat de buffer lijn vol is) en sla de cine lus door op 'cine store'.
    7. Verzamel een extra cine lus van circulerende microbellen. Dit daaropvolgende 'post-destructie' beeldvormingssequentie wordt aangenomen dat alleen circulerende bubble signalen dat de bundel hebben bijgevuld bevatten. Druk op 'scan / freeze' om beeldvorming en 'cine store' te starten om de beelden te verzamelen.
    8. Label de cine loops na de beeldvorming van elk embryo. Druk op 'studie management', markeert u het bestand met de rollerball en de 'select' knop, druk op 'imago etiket' en de naam op de juiste wijze.

8. Behandeling van embryo's na injectie

  1. Bericht beeldvorming, verplaats de transducer, losmaken van de embryo en euthanaseren (via onthoofding, cervicale dislocatie, kooldioxide stikken, of anesthesie gevolgd door een snelle bevriezing of fixatie) zoals gewenst.
  2. Voor elke volgende embryo injectie een dissectie schotel, naald, spuit en slangen segment verse moet worden gebruikt, met de voorbereiding van de volgende partij van microbellen injectievloeistof nemen plaats tijdens dissectie en opwekking.
  3. Spaar weefselmonsters (bv, staart, hersenen) voor aanvullende analyses (bv, genotypering bepaald door PCR-analyse van geïsoleerde staart DNA, lacz kleuring of semi-kwantitatieve maatregelen van biomarker expressie met behulp van western blots 21).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De injectie van ultrageluid contrastmiddelen in ex utero muizenembryo's is afhankelijk van de succesvolle isolatie van levende, late zwangerschap stadium embryo van de baarmoeder en het onderhoud van levensvatbaarheid in de loop van de injectie en bijbehorende echografie. Zodra het embryo is buiten gebracht en gepositioneerd, zoals getoond in figuur 1, zorgvuldig injectie van contrastmiddel in de embryonale vasculatuur mogelijk. Een typisch B-modus ultrasoon beeld van een E17.5 muis embryo ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Ultrageluidcontrastmiddelen werden geïnjecteerd in een laat stadium van de dracht muis embryo's en niet-lineaire contrast beelden werden verworven om perfusie parameters te meten en gerichte microbellen bindend. Succesvolle beeldvorming microbellen in embryonale vasculatuur was afhankelijk van een aantal factoren, waarvan de eerste levensvatbaar embryo. Alle apparatuur en toestellen werden voorbereid om de benodigde tijd voor isolatie van embryo van de baarmoeder naar het begin van injectie te minimaliseren. Aangezi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

F.S. Foster erkent zijn rol als consultant voor VisualSonics Inc.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door het Terry Fox-programma van het National Cancer Institute of Canada.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Reagents
Antilichamen (biotinyleerd, eBioscience) — Antilichaamkeuze is afhankelijk van het experiment
  • rat isotype IgG2 control
eBioscience13-4321-85Deze antilichaam/microbubbel combinatie is vaak vereist als experimentele controle 
  • biotin anti-mouse CD309
eBioscience13-5821-85
Biotinyleerde rat MJ 7/18 antilichaam voor muis endoglinIn house hybridomaBuiten antilichamen kunnen ook geschikt zijn: we  hebben eBioscience (13-1051-85 ) in het verleden gebruikt
Gedestilleerd water
Embryo media
  • 500 ml Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium met hoge glucose
SigmaD5796
  • 50 ml Fetal Bovine Serum
ATCC30-2020lot # 7592456
  • Hepes
Gibco156305 ml, 1 M
  • Penicillin-Streptomycin
Gibco15140-1225 ml, 10.000 eenheden Pen., 10.000 μg Strep
Ethanol, 70%
IJs
ParaformaldehydeSigma762404%
Phosphate Buffered Saline [1x] SigmaD85371x, zonder calciumchloride & magnesiumchloride
Zwangere muis, CD-1Charles River Laboratories Inc. 
0,9% natriumchloride (zoutoplossing)Hospira0409-7984-11
Ultrasone contrastmiddel, doelwit klaar en niet-doelgerichtMicroMarker; VisualSonics Inc.
Ultrasone gel (Aquasonic 100, kleurloos)CSP Medical133-1009
Apparatuur
Celcultuur platen (4) :  100 x 20 mmFisher Scientific08-772-22
Celcultuur platen (12) : 60 x 15 mmSigmaD8054
CentrifugeSorvall Legend RT centrifuge 
Conische buizen, 50 ml BD FalconVWR21008-938
VerdunningsmiddelBeckman CoulterIsoton II Diluent, 8448011
Dissectie schaar (Wagner)Fine Science ToolsWagner 14068-12
Pincetten (2), Dumont SS (0,10 x 0,06 mm)Fine Science Tools11200-33
Pincet, splinterVWR25601-134
Glasbeker, 2 L (Griffin Beaker)VWR89000-216
Glas capillairen, 1 x 90 mm GD-1 met filamentNarishigeGD-1
Glas naald pullerNarishigePN-30
HandschoenenAnsell4002
Grote anatomie sondeFine Science Tools10088-15
Hot plateVWR89090-994
IJsemmerCole ParmerRK 06274-01
Beeldvorming PlatformVisualSonics Inc.Integrated Rail System
Lichtbron, glasvezelFisher Scientific12-562-36Ideaal is een verstelbare armen
Luers (12), polypropyleen gebarste vrouwelijke ¼-28 UNF draadCole Parmer45500-30
Micro-ultrasone systeem, hoogfrequentVisualSonics Inc.Vevo2100
Naalden, 21 gauge  (1”)VWR305165
Deeltjesgrootte analyzerBeckman CoulterMultisizer 3 Coulter Counter
Geperforeerde lepel (Moria)Fine Science ToolsMC 17 10373-17
Pins (6), zwart geanodiseerd minutien 0,15 mmFine Science Tools26002-15
Pipetten [2-20 μl, 20-200 μl, 100-1.000 μl]EppendorfResearch Plus  aanpasbaar 3120000038;       3120000054;       3120000062
Pipettip [2-200 μl, 50-1.000 μl]EppendorfepT.I.P.S.                   22491334;            022491351
Schaar
Sylgard 184 Silicone Elastomer KitDow Corning
Buis, Tygon laboratorium 1/32”

Referenties

  1. Voigt, J. U. Ultrasound molecular imaging. Methods. 48 (2), 92-97 (2009).
  2. Klibanov, A. Preparation of targeted microbubbles: Ultrasound contrast agents for molecular imaging. Medical Biological Engineering Computing. 47 (8), 875-882 (2009).
  3. Cosgrove, D., Lassau, N. Imaging of perfusion using ultrasound. European Journal Of Nuclear Medicine And Molecular Imaging. 37 (S1), 65(2010).
  4. Williams, R., et al. Dynamic microbubble contrast-enhanced US to measure tumor response to targeted therapy: A proposed clinical protocol with results from renal cell carcinoma patients receiving antiangiogenic therapy. Radiology. 260 (2), 581(2011).
  5. Burns, P. N., Wilson, S. R. Focal liver masses: Enhancement patterns on contrast-enhanced Images - Concordance of US scans with CT scans and MR images. Radiology. 242 (1), 162(2006).
  6. Phoon, C. K. L., Aristizabal, O., Turnbull, D. H. 40 MHz doppler characterization of umbilical and dorsal aortic Blood flow in the early mouse embryo. Ultrasound. In Medicine And Biology. 26 (8), 1275-1283 (2000).
  7. Phoon, C. K. L., Aristizabal, O., Turnbull, D. H. Spatial velocity profile in mouse embryonic aorta and doppler-derived volumetric flow: A preliminary model. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283, H908-H916 (2002).
  8. Aristizábal, O., Williamson, R., Turnbull, D. H. 12A-4 in vivo 3D contrast-enhanced imaging of the embryonic mouse vasculature. Paper presented at Ultrasonics Symposium. , IEEE. New York, NY. (2007).
  9. Bartelle, B. B., et al. Novel genetic approach for in vivo vascular imaging in mice. Circ.Res. 110 (7), 938-947 (2012).
  10. Endoh, M., et al. Fetal gene transfer by intrauterine injection with microbubble-enhanced ultrasound. Molecular Therapy. 5 (5), 501-508 (2002).
  11. Yamada, M., Hatta, T., Otani, H. Mouse exo utero development system: Protocol and troubleshooting. Congenital Anomalies. 48 (4), 183-187 (2008).
  12. Denbeigh, J. M., Nixon, B. A., Hudson, J. M., Purin, M. C., Foster, F. S. VEGFR2-targeted molecular imaging in the mouse embryo: An alternative to the tumor model. Ultrasound in medicine and biology. 40 (2), 389-399 (2014).
  13. Paauwe, M., Dijke, ten, P,, Hawinkels, L. J. A. C. Endoglin for tumor imaging and targeted cancer therapy. Expert Opinion On Therapeutic Targets. 17 (4), 421-435 (2013).
  14. Bourdeau, A., Faughnan, M. E., Letarte, M. Endoglin-deficient mice, a unique model to study hereditary hemorrhagic telangiectasia. Trends Cardiovasc. Med. 10 (7), 279-285 (2000).
  15. Whiteley, K. J., Adamson, S. L., Pfarrer, C. D. Vascular corrosion casting of the uteroplacental and fetoplacental vasculature in mice. Placenta And Trophoblast: Methods And Protocols. 121 (121), Humana Press. Totowa, NJ. 371-392 (2006).
  16. Kulandavelu, S., et al. Embryonic and neonatal phenotyping of genetically engineered mice. ILAR Journal. 47 (2), 103-10 (2006).
  17. Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. Journal of Visualized Experiments. 85, (2014).
  18. Willmann, J. K., et al. Targeted contrast-enhanced ultrasound imaging of tumor angiogenesis with contrast microbubbles conjugated to integrin-binding knottin peptides. The Journal of Nuclear Medicine. 51 (3), 433-440 (2010).
  19. Deshpande, N., Ren, Y., Foygel, K., Rosenberg, J., Willmann, J. K. Tumor angiogenic marker expression levels during tumor growth: Longitudinal assessment with molecularly targeted microbubbles and US imaging. Radiology. 258 (3), 804-811 (2011).
  20. Lyshchik, A., et al. Molecular imaging of vascular endothelial growth factor receptor 2 expression using targeted contrast-enhanced high-frequency ultrasonography. Journal Of Ultrasound In Medicine. 26 (11), 1575-1586 (2007).
  21. Jerkic, M., et al. Endoglin regulates nitric oxide-dependent vasodilatation. The FASEB Journal. 18 (3), 609-611 (2004).
  22. Denbeigh, J. M., Nixon, B. A., Lee, J. J. Y., et al. Contrast-Enhanced Molecular Ultrasound Differentiates Endoglin Genotypes in Mouse Embryos. , Angiogenesis. Press. (2014).
  23. Adamson, S. L., Lu, Y., Whiteley, K. J., et al. Interactions between trophoblast cells and the maternal and fetal circulation in the mouse placenta. Dev Biol. 250, 358-35 (2002).
  24. Needles, A., et al. Nonlinear contrast imaging with an array-based micro-ultrasound system. Ultrasound. Medicine Biology. 36 (12), 2097(2010).
  25. Watson, E. D., Cross, J. C. Development of structures and transport functions in the mouse placenta. Physiology. 20 (3), 180-193 (2005).
  26. Shalaby, F., Rossant, J., Yamaguchi, T. P., et al. Failure of blood-island formation and vasculogenesis in Flk-1-deficient mice. Nature. 376, 62-66 (1995).
  27. Kwee, L., Baldwin, H. S., Shen, H. M., et al. Defective development of the embryonic and extraembryonic circulatory systems in vascular cell adhesion molecule (VCAM-1) deficient mice. Development. 121, (1995).
  28. Mercurio, A. M. Lessons from the α2 integrin knockout mouse. The American journal of pathology. , 161-163 (2002).
  29. Hodivala-Dilke, K. αvβ3 integrin and angiogenesis: a moody integrin in a changing environment. Curr Opin Cell Biol. 20, 514-519 (2008).
  30. Pysz, M. A., Gambhir, S. S., Willmann, J. K. Molecular imaging: current status and emerging strategies. Clinical radiology. 65, 500-516 (2010).
  31. Cybulsky, M. I., Iiyama, K., Li, H., et al. A major role for VCAM-1, but not ICAM-1, in early atherosclerosis. J Clin Invest. 107, 1255-1262 (2001).
  32. Xu, H., Gonzalo, J. A., St Pierre,, Y,, et al. Leukocytosis and resistance to septic shock in intercellular adhesion molecule 1-deficient mice. J Exp Med. 180, 95-109 (1994).
  33. Gerwin, N., Gonzalo, J. A., Lloyd, C., et al. Prolonged eosinophil accumulation in allergic lung interstitium of ICAM-2-deficient mice results in extended hyperresponsiveness. Immunity. 10, 9-19 (1999).
  34. Johnson, R. C., Mayadas, T. N., Frenette, P. S., et al. Blood cell dynamics in P-selectin-deficient mice. Blood. 86, 1106-1114 (1995).
  35. Corrigan, N., Brazil, D., McAuliffe, F. High-frequency ultrasound assessment of the murine heart from embryo through to juvenile. Reproductive Sciences. 17 (2), 147-14 (2010).
  36. Turnbull, D. H., Bloomfield, T. S., Baldwin, H. S., Foster, F. S., Joyner, A. L. Ultrasound backscatter microscope analysis of early mouse embryonic brain development. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 2239-2243 (1995).
  37. Greco, A., Mancini, M. L., Gargiulo, S., et al. Ultrasound Biomicroscopy in Small Animal Research: Applications in Molecular and Preclinical Imaging. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, (2012).
  38. Pysz, M. A., Guracar, I., Foygel, K., Tian, L., Willmann, J. K. Quantitative assessment of tumor angiogenesis using real-time motion-compensated contrast-enhanced ultrasound imaging. Angiogenesis. 15, 433-442 (2012).
  39. Larina, I. V., et al. Live imaging of blood flow in mammalian embryos using doppler swept-source optical coherence tomography. J.Biomed.Opt. 13 (6), 060506-06 (2008).
  40. Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Live imaging of mouse embryos. 4 (4), Cold Spring Harbor. 104-10 (2011).
  41. Teichert, A., et al. Endothelial nitric oxide synthase gene expression during murine embryogenesis. Commencement of expression in the embryo occurs with the establishment of a unidirectional circulatory system. Circulation Research. 103 (1), 24-33 (2008).
  42. Walls, J. R., Coultas, L., Rossant, J., Henkelman, R. M. Three-dimensional analysis of vascular development in the mouse embryo. PLoS One. 3 (8), (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Ultrasound contrastimagingvasculariteit van muizenembryo smicrobelinjectieperfusieparametersgerichte microbelbindingendogline muismodelplacentair vasculair netwerkniet lineaire contrast echografietechniek voor embryo handling
Contrast Imaging in muis embryo's met behulp van hoge-frequentie Ultrasound
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.