Een protocol voor Lentiviral Transduction en Downstream Analyse van Intestinale Organoids

Samenvatting

In dit videoprotocol geven we een stapsgewijze uitleg van lentivirale transductie in organoïden van primair darm epitheel en van verwerking en downstream analyse van deze culturen door kwantitatieve RT-PCR, RNA-microarray en immunohistologie.

Samenvatting

Intestinale crypt-villus structuren, aangeduid als organoïden, kunnen driedimensionaal in duurzame cultuur worden gehouden wanneer ze worden aangevuld met de juiste groeifactoren. Aangezien organoïden zeer vergelijkbaar zijn met het oorspronkelijke weefsel in termen van homeostatische stamceldifferentiatie, celpolariteit en aanwezigheid van alle terminaal gedifferentieerde celtypen die bekend zijn in het volwassen intestinale epitheel, dienen ze als een essentiële bron in experimenteel onderzoek naar het epitheel. De mogelijkheid om transgenen of interfererende RNA uit te drukken met behulp van lentivirale of retrovirale vectoren in organoïden heeft de mogelijkheden voor functionele analyse van het intestinale epitheel en intestinale stamcellen vergroot, waarbij traditionele muis-transgenica worden overtroffen in snelheid en kosten. In het huidige videoprotocol laten we zien hoe transductie van kleine intestinale organoïden met lentivirale vectoren kan worden gebruikt, geïllustreerd door het gebruik van doxycylin-induceerbare transgenen of IPTG-induceerbare korte haarklover RNA voor overexpressie of gen-knockdown. Verder, gezien de organoïdcultuur minute celtellingen oplevert die zelfs kunnen worden verminderd door experimentele behandeling, leggen we uit hoe organoïden kunnen worden verwerkt voor downstream-analyse gericht op kwantitatieve RT-PCR, RNA-microarray en immunohistochemie. Technieken die transgenenexpressie en gen-knockdown in intestinale organoïden mogelijk maken, dragen bij aan het onderzoekspotentieel dat deze intestinale epitheelstructuren hebben, waardoor organoïdcultuur een nieuwe standaard wordt in celcultuur.

Inleiding

Het intestinale epitheel is een van de snelst proliferatieve weefsels in het lichaam, wat ervoor heeft gezorgd dat het veel interesse heeft getrokken in onderzoek naar kanker en stamcellen. In 2009 werd een techniek gepubliceerd om langdurige culturen van kleine darmcrypts in matrigel te genereren, waarbij een 3-dimensionale structuur wordt geconserveerd¹. Deze structuren, intestinale organoïden genoemd, kunnen worden gekweekt met behulp van standaardtechnieken, waarbij het omringende medium wordt aangevuld met een aantal gedefinieerde groeifactoren, inclusief de Bmp-signaleringsremmer noggin (Nog), de Wnt-signaleringsversterker rspondin 1 (Rspo1) en epidermale groeifactor (Egf), die allemaal zijn gevonden om intestinale proliferatie te versterken^2-4.

Organoïden overtreffen traditionele kankercellijnen in de aspecten dat ze niet-gemuteerd zijn, de stamcelhiërarchie hebben behouden, intacte cellulaire polarisatie vertonen en differentiatie vertonen in alle cellijnen die in het nascente kleine darm epitheel worden aangetroffen. Omdat ze kunnen worden getransduceerd om transgenen of RNA-interferentieconstructen te dragen⁵, worden ze gebruikt om specifieke genetische elementen te bestuderen, waarbij ze experimenten met transgene muizen overtreffen op het gebied van kosten en snelheid. Transgene expressie in organoïden kan worden uitgevoerd met behulp van muisine retrovirale of lentivirale vectoren^6,7. Vanwege de beperkingen van muisine retrovirussen, die alleen mitotische cellen kunnen transduceren⁸, wordt lentivirale transductie vaker gebruikt voor cellen die moeilijk te infecteren zijn, zoals organoïden.

Viral getransduceerde en stabiel expresserende transgene organoïden kunnen worden gebruikt voor een veelvoud van downstream-analyses, inclusief kwantitatieve RNA-analyses en immunohistochemie. Alles bij elkaar genomen, is de kweek van organoïden van primaire intestinale epitheelcellen uitgegroeid tot een routinetechniek die gemakkelijk te implementeren is zonder specifieke laboratoriumvereisten, en is het de nieuwe standaard geworden in celcultuur in onderzoek naar het intestinale epitheel.

Technieken van virale transductie en daaropvolgende downstream-analyse in organoïden zijn vervelend om uit te voeren en om organoidexperimenten te ondersteunen hebben we dit videoprotocol gegenereerd, dat methoden voor lentivirale transductie van gekweekte organoïden laat zien. We laten bovendien zien hoe correcte verwerking van organoïden de opbrengst kan verhogen en daarom de prestaties van downstream-analyse met behulp van RNA-technieken of immunohistochemie kan verbeteren. In het protocol werden uitsluitend organoïden die zijn afgeleid van kleine darmcrypts gebruikt, hoewel de beschreven technieken ook kunnen worden toegepast op colonische organoïden.

Protocol

1. Preparatie van Polyethylenimine (PEI) als Transfectie Reagens

1. Los ongeveer 150 mg PEI op in 100 ml H₂O.
2. Pas de oplossing aan naar pH 7,4 door HCl toe te voegen totdat de oplossing helder wordt en roer tot het volledig is opgelost. Dit kan tussen de 10 en 60 minuten duren en voeg water toe tot een eindconcentratie van 1 mg/ml.
3. Wanneer het helder is, filter de PEI-oplossing door een steriele 0,22 µm filter en bewaar in een -80 °C vrieskast in aliquoten van 5 ml.

2. Productie van Lentivirale Deeltjes

Dag 1:

1. Splits HEK293T cellen tot 60%-80% confluency in 162 cm² flacon of grote petrischaal in cellijncultuurmedium (DMEM gesupplementeerd met 10% FCS, 1% penicilline/streptomycine en 2 mM glutamine supplement).

Dag 2:

2. Bereid een DNA-transfectieoplossing voor die 45 µg totaal plasmide DNA bevat door lentivirale verpakkingsvectoren (7 µg van pVSVg; 5 µg van pRSV rev; 13 µg van pMDL) en 20 µg van lentiviraal plasmide dat het gen van belang of shRNA van belang codeert samen te voegen. Breng aan op een volume van 1 ml met behulp van DMEM.
3. Bereid een PEI-transfectieoplossing voor door 90 µl van 1 mg/ml PEI toe te voegen aan 930 µl DMEM en incubeer gedurende 5 min bij kamertemperatuur.
4. Voeg de DNA-transfectieoplossing toe aan de PEI-oplossing. Vortex of draai een aantal keer om en incubeer gedurende 5 min bij kamertemperatuur om een DNA-transfectieoplossing te verkrijgen.
5. Druppel 2 ml van de DNA-transfectieoplossing op de HEK293T cellen en incubeer gedurende 4 uur in een bevochtigde celcultuur incubator op 37 °C.
6. Na 4 uur ververs het kweekmedium om PEI te verwijderen. Het is niet nodig om cellen te wassen voordat nieuw medium wordt toegevoegd.
   OPMERKING: PEI is cytotoxisch en incubatietijden langer dan 4 uur kunnen schade aan de HEK293T cellen veroorzaken.

Dag 4:

7. Vervang het supernatant met nieuw kweekmedium. Bewaar het supernatant (dat virus bevat); dit zal worden gebruikt in stap 2.10.
8. Plaats het supernatant in een 15 ml flacon. Om dode cellen te verwijderen, centrifugeer gedurende 5 min bij 500 x g.
9. Duw het supernatant door een 0,45 µm filter met behulp van een grote 60 ml spuit. Bewaar overnacht bij 4 °C.

Dag 5:

10. Verzamel de tweede batch van supernatant; centrifugeer en filter zoals in stappen 2.8-2.9.
11. Verzamel de supernatanten uit stappen 2.9 en 2.10 in ultracentrifugebuizen en centrifugeer gedurende 90 min bij 50.000 x g in een ultracentrifuge.
12. Haal de capsules met de ultracentrifugebuizen heel voorzichtig eruit en plaats ze in een laminaire flow kast, onthoud de oriëntatie van de buis binnenin de centrifuge.
13. Open de capsule die de ultracentrifugebuis bevat en decant het medium voorzichtig op een manier dat het pellet aan de bovenkant van de buis ligt. Aangezien virale pellets moeilijk te visualiseren kunnen zijn, onthoud aan welke kant van de buis een pellet zich zal hebben gevormd. Neem een micropipet en verwijder het laatste beetje medium terwijl u ervoor zorgt dat u het ondoorzichtige bruine pellet dat zichtbaar is aan de zijkant van de bodem van de ultracentrifugebuis niet schudt.
14. Resuspendeer dit pellet in 500 µl van organoïdcultuurmedium gesupplementeerd met 10 mM nicotinamide, 10 µM Chir99021, 10 µM Y27632 en 8 µg/ml polybreen. Resuspendering in dit medium is belangrijk omdat hoog titer virus wordt gebruikt om organoïds direct te transducteren.
15. Optioneel: bevries het virus in dit medium gealiquoteerd in twee batches van 250 µl bij -80 °C.

3. Lentivirale Transductie van Organoïden

Dag 0:

1. Splits een volledige 0,95 cm² put van organoïds twee dagen voor transductie in een nieuwe put, met als doel ongeveer 50 kleine organoïds te verkrijgen. Splits organoïds volgens een eerder gepubliceerd protocol¹ (Figuur 3A, B).
2. Supplemereer organoïdcultuurmedium met 10 µM Chir99021 en 10 mM nicotinamide om cystische hyperproliferatieve crypts te verkrijgen (Figuur 3C).
   OPMERKING: Cystische crypts zullen het beste ontwikkelen wanneer vers gespleten organoïds in aanwezigheid van Chir99021 worden gekweekt.

Dag 2:

3. Verzamel organoïds door matrigel en medium op en neer te pipetten, waardoor het mengsel wordt verstoord met een p1000 micropipet. Plaats het mengsel in een 15 ml buis.
4. Verstoor verder met behulp van een Pasteur pipet waarvan de distale opening is verkleind door smelten. Centrifugeer organoïds tot pellet gedurende 5 min bij 100 x g.
   OPMERKING: Afhankelijk van de grootte van de centrifuge, gebruik een andere centrifugeersnelheid. Het is noodzakelijk om de exacte snelheid te vinden waarbij verstoorde organoïds worden gescheiden van het mengsel.
5. Verwijder het

Resultaten

Organoïde lentivirale transductie

De techniek van organoïd-transductie met behulp van lentivirale deeltjes is afhankelijk van de juiste behandeling van organoïden voor en tijdens de transductie. Organoïden (Figuur 3A) werden gekweekt en werden opgesplitst in enkele crypts (Figuur 3B). Zoals eerder gemeld, werden deze enkele crypts, wanneer gekweekt in aanwezigheid van de GSK3-remmer Chir99021, cystische crypts⁹ (Figuur 3C)....

Discussie

Het huidige videoprotocol beschrijft lentivirale transductie van organoïden van primair darmepitheel en downstream-analyse van deze organoïden met behulp van kwantitatieve RNA-technieken en immunohistochemie.

Lentivirale transductie wordt vaak uitgevoerd in aangehechte of zwevende cellen in kweekplaten. Omdat de driedimensionale structuur van organoïden ze moeilijk doordringbaar maakt voor virale deeltjes, worden verschillende methoden gebruikt om de efficiëntie te verhogen. Prebehandeling van...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Polyethyleen imine	Polysciences	23966-2
DMEM medium	Lonza	BE12-614F
Foetaal runder serum	Lonza	DE14-801F
Penicilline-streptomycine	Invitrogen	15140-122
Glutamine	Invitrogen	25030-024
Matrigel	BD	BD 356231
Advanced DMEM-F12	Gibco	12634-010
N2	Invitrogen	17502-048
B27	Invitrogen	17504-044
N-acetyl cysteïne	Sigma	A9165-1G
muis Egf	Invitrogen	PMG8045
Hepes 1 M	Invitrogen	15630-056
glutamax 100x	Invitrogen	35050-038
Chir 99021	Axon	1386
Y27632	Sigma	Y0503-5MG
polybreen	Sigma	107689
nicotinamide	Sigma	N0636
Trypsine	Lonza	BE02-007E
puromycine	Sigma	P 7255
Rneasy mini kit	Qiagen	74106
β-mercaptoethanol	Merck	8,057,400,250
Ovation Pico WTA systeem	NuGen	3300-12
paraformaldehyde	Sigma	252549-1L
glazen kelkje kegelvormig 12 mm x 75 mm 5 ml	VWR	LSUKM12
Eosine geelachtig	VWR	1,159,350,025