Methodenartikel

Inductie van Muriene darmontsteking door adoptieve overdracht van effector CD4 + CD45RB Hoog T cellen in immunodeficiënte muizen

DOI:

10.3791/52533

⸱

21 april 2015

 ,  , 
1Center for Gastrointestinal Biology and Disease, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Microbiology and Immunology, University of North Carolina at Chapel Hill, 3Department of Genetics, University of North Carolina at Chapel Hill, 4Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina at Chapel Hill

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol om colonontsteking bij muizen te induceren door adoptieve overdracht van syngeneïsche CD4+CD45RBhigh T-cellen naar ontvangers zonder T- en B-cellen. Klinische en histopathologische kenmerken bootsen inflammatoire darmziekten bij mensen na. Deze methode maakt de studie van de initiatie van colonontsteking en de progressie van de ziekte mogelijk.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er zijn veel verschillende dierlijke modellen voor het bestuderen van de pathogenese van menselijke inflammatoire darmziekten (IBD), elk met zijn eigen voor- en nadelen. We beschrijven hier een experimentele colitis model dat wordt geïnitieerd door adoptieve overdracht van syngenetische milt CD4 + CD45RB- hoge T-cellen in de T- en B-cel deficiënte muizen ontvanger. De CD4 + CD45RB high T-celpopulatie die grotendeels uit naïeve effectorcellen kan induceren chronische darmontsteking, sterk lijken belangrijke aspecten van menselijke IBD. Deze methode kan worden gemanipuleerd om aspecten van de ziekte ontstaan ​​en de progressie bestuderen. Daarnaast kan het worden gebruikt om de functie van aangeboren, adaptief en regelgevende immuuncel populaties en de rol van milieurisico's, dwz de microbiota in intestinale inflammatie bestuderen. In dit artikel tonen we de methode voor het induceren van colitis met een stap-voor-stap protocol. Dit includes een video demonstratie van de belangrijkste technische aspecten die nodig zijn om succesvol te ontwikkelen dit muizenmodel van experimentele colitis voor onderzoeksdoeleinden.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De inflammatoire darmziekten (IBD) Crohn’s ziekte en colitis ulcerosa ontstaan door een niet volledig gedefinieerde en complexe interactie tussen gastheer immuunreacties, genetische vatbaarheid, omgevingsfactoren en de enterische luminale inhoud1. Recente genoombrede associatiestudies rapporteren associaties tussen immuuncel regulerende genen en IBD-gevoeligheid2,3. Zowel intrinsieke genen van aangeboren als adaptieve immuuncellen zijn vertegenwoordigd in deze studies, wat wijst op een centrale rol voor deze celpopulaties in IBD-pathogenese.

Er bestaan momenteel meer dan 50 diermodellen van menselijke IBD. Hoewel geen ....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: Zorg ervoor dat alle dieren protocollen worden goedgekeurd door en in overeenstemming met de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) regelgeving en Gids van de National Research Council voor de zorg en het gebruik van proefdieren. Donormuizen kan mannelijk of vrouwelijk zijn, maar de ontvanger muizen moet mannelijk zijn. Als vrouwelijke ontvangers worden gebruikt, moet de donor muizen vrouwelijke 5 zijn. Onderhouden kolonies met behulp van reguliere, niet-steriele beddengoed en niet-aangezuurd water, omdat deze de darmflora beïnvloeden, en dus de colitis fenotype van de muizen 5,6.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ongeveer 10 x 10 6 CD4 + CD45RB- hoge T-cellen van 10 milt van volwassen C57BL / 6 donormuizen zijn betrouwbaar geïsoleerd. Dit aantal zal variëren afhankelijk van de leeftijd en het type van de donor muis en de vaardigheid van de onderzoeker. Wanneer 4 x 10 5 C57BL / 6 CD4 + CD45RB- hoge T-cellen worden overgebracht naar C57BL / 6 RAG1 - / - ontvanger muizen, klinische ziekteverschijnselen ontstaan ​​rond week 5 post-repletie of eerde.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een stap-voor-stap protocol inducerende darm ontsteking bij muizen door adoptieve overdracht van CD4 + CD45RB + T-cellen in immuun deficiënte muizen. We gebruikten C57BL / 6 donor milt en syngene RAG1 - / - ontvangende muizen, hoewel andere stammen (zoals BALB / c, 129S6 / SvEv, non-obese diabetische (NOD)) en genetische modellen van immunodeficiëntie (bijvoorbeeld SCID, RAG2 - / -) kan ook worden gebruikt 4,14-16.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de Amerikaanse Gastroenterological Association (AGA) Onderzoek Scholars Award en de Crohn en Colitis Foundation of America (CCFA) Career Development Award (tot SZS), NIH NIDDK F30 DK089692 (ECS), en de Universiteit van North Carolina Centrum voor Gastro-intestinale Biologie en de ziekte van Grant P30 DK34987 (histologie Core). De UNC flowcytometrie Core Facility wordt gedeeltelijk ondersteund door een NCI Center Core ondersteuning Grant (P30CA016086) aan de UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center. Wij danken Luke B. Borst uit North Carolina State University College of Veterinary Medicine voor zijn hulp met histopathologische analyse ....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Naam van Reagens/ApparatuurBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen/Beschrijving
10x PBSGibco14200075
12 mm x 75 mm rondbodembuisFalcon352052
15 ml kegelvormigCorning430790
26 G x 3/8 NaaldBD Biosciences305110
50 ml kegelvormigCorning430828
70 μm Cel ZeefFisherbrand22363548
BD IMagnetBD Biosciences552311
β-mercaptoethanolThermo Scientific35602
CD4-FITC IgG2beBioscience11-0041
CD45RB-PE IgG2aBD Pharminogen553101
Volledig MediaRPMI-1640, 1% Pen/Strep, 10% FBS, 0,0004% β-ME
FACS buis + zeefBD Falcon352235
Glazen MicroscoopglazenFisherbrand12550A3
Verwarmd ingeactiveerd FBSGemini100-106
Labeling Buffer1x PBS, 0,5% BSA, 2 mM EDTA
Lysis Buffer0,08% NH4Cl, 0,1% KHCO3, 1 mM EDTA
MoFlo XDPBeckman Coulter
Muis CD4 T-lymfocyt Verrijkingsset - DMBD Biosciences558131
Muis IgG2a-PEBD Pharminogen553457
Muis IgG2b-FITCeBioscience11-4732
Pasteur PipetFisherbrand13-678-20D
Penicilline-Streptomycine Oplossing, 100XCorning Cellgro30-002-CI
[header]
PetrischaalFisherbrand875713
Pure Ethanol 200 ProofDecon Labs2705-HC
RPMI-1640Gibco11-875-093
SpuitBD Biosciences309597
Trypan blauwCorning Cellgro25-900-CI
Was MediaRPMI-1640, 1% Pen/Strep, 0,0004% β-ME

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Xavier, R. J., Podolsky, D. K. Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature. 448 (7152), 427-434 (2007).
  2. Cho, J. H., Brant, S. R. Recent insights into the genetics of inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 140 (6), 1704-1712 (2011).
    3. <....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Adoptieve T celtransferisolatie van miltcellenfluorescerende antilichaambelvellingfluorescentie geactiveerde cel sorteringintraperitoneale celinjectieexperimenteel colitismodelinflammatoire darmziekte

Gerelateerde artikelen