Genoombewerkingstools zoals het CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) systeem hebben de efficiëntie van gentargeting in humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) aanzienlijk verbeterd. Dit manuscript beschrijft een protocol voor het genereren van een lijnspecifiek hiPSC-reporter met behulp van CRISPR/Cas systeem-ondersteunde homologe recombinatie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Efficiënte generatie van iPSC Neural Lineage Specifieke Knockin Reporters Met de CRISPR / Cas9 en Cas9 Double Nickase System
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Gene targeting is een kritische benadering voor het karakteriseren van gen functies in het moderne biomedisch onderzoek. Echter, de efficiëntie van gen targeting in humane cellen laag is, waardoor de vorming van humane cellijnen voorkomen met een gewenste snelheid. De afgelopen twee jaar hebben een snelle progressie op het verbeteren van de efficiëntie van genetische manipulatie door genoom editing tools getuige zoals het CRISPR (regelmatig Gegroepeerd interspaced Short Palindromic Repeats) / Cas (-CRISPR geassocieerd) systeem. Dit manuscript beschrijft een protocol voor het genereren van lineage specifieke mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) reporters met CRISPR / Cas-systeem bijgestaan homologe recombinatie. Procedures voor het verkrijgen van de noodzakelijke componenten voor het maken van neurale lineage reporter lijnen met behulp van de CRISPR / Cas-systeem, gericht op de bouw van targeting vectoren en enkele gids RNA's, worden beschreven. Dit protocol kan worden uitgebreid tot platform vestiging en mutatie correctie hiPSCs.
Inleiding
CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) systeem, samen met andere genoombewerkingstools, heeft de manipulatie van het menselijk genoom in de afgelopen jaren gerevolutioneerd1-7. Belangrijke componenten in het CRISPR/Cas9-systeem zijn enkele gids-RNA (sgRNA) en Cas9. Cas9 is een RNA-gestuurde type II DNA-endonuclease. Het heeft twee nuclease-domeinen, HNH en RuvC, die verantwoordelijk zijn voor het maken van dubbelstrengs DNA-breuken (DSB's) op een specifiek genomisch gebied naast een protospacer aangrenzend motief (PAM)7-10. Een sgRNA heeft een gecombineerde functie van die van crRNA en tracrRNA, twee aanpassings-immuniteits-RNA-moleculen geïdentificeerd in bacteriën (zoals Streptococcus pyogenes) en archaea om DNA-invasie van exogene bronnen te bestrijden9-11. Wanneer op de juiste manier ontworpen en samen geïntroduceerd in zoogdiercellen, herkent de sgRNA de PAM-sequentie, vormt basenparen met de complementaire streng van doel-DNA, en leidt en transactiveert Cas9 om te snijden aan beide DNA-strengen direct stroomopwaarts van PAM7. Vervolgens zal homologe gerichte recombinatie (HDR, in aanwezigheid van een targeting-vector) of niet-homoloog eindverbinding (NHEJ) plaatsvinden om de DSB's te repareren. Transgenen zoals cDNA's, reporter-cassettes of antibioticumresistente fragmenten kunnen worden geïntegreerd, en transgene of knockin-lijnen gemaakt.
Hoewel het CRISPR/Cas9-systeem zeer efficiënt en relatief specifiek is, zijn er ongewenste off-target-activiteiten gemeld12-15. Om off-target-gebeurtenissen te minimaliseren, zijn ook Cas9 nickases (Cas9n) ontworpen9,10,14,16,17. Cas9n (Cas9 D10A of Cas9 H840A) is een Cas9-enzym met mutaties in een van de twee nuclease-domeinen, die alleen een snede op een streng van DNA veroorzaakt. Om snijden aan beide strengen te bereiken, zijn twee sgRNA's ontworpen om een paar nickases te leiden, die afzonderlijk snijden op nabijgelegen loci van de twee verschillende DNA-strengen. De “dubbele sneden” strategie vereist een strenger ontwerp dan het conventionele Cas9-platform, en biedt zowel hoge efficiëntie als hoge specificiteit voor genbewerkingsexperimenten.
Dit manuscript beschrijft een protocol voor het genereren van lijnage-specifieke menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel (hiPSC) reporter met behulp van CRISPR/Cas-systeem geassisteerde homologe recombinatie. Stappen voor het verkrijgen van de noodzakelijke componenten voor het maken van neurale lijnage reporter-lijnen met behulp van het CRISPR/Cas-systeem-gemedieerde genoombewerking worden beschreven, met een focus op constructie van targeting-vectoren en sgRNA's. Dit protocol is met succes herhaald in meerdere hiPSC-lijnen, inclusief die afgeleid van gezonde individuen en van patiënten met CNS-ziekten. Genen die in ons laboratorium worden gericht, omvatten OLIG2, HB9 (MNX1), NEUROG2, SOX1, ALDH1L1 en SOD1. De targeting-efficiëntie van CRISPR/Cas-systeem-gemedieerde homologe recombinatie in hiPSC's varieert van 20-40%, wat consistent is met eerdere rapporten1,18,19. Vergeleken met een typische efficiëntie van 1-2% in conventionele gen-targeting-experimenten, is de targeting-efficiëntie aanzienlijk verbeterd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Ontwerp en vectorconstructie voor targeting-vectoren
- Zodra de lijnspecifieke marker is bepaald, lokaliseer de genomische sequentie van het gen en ontwerp de homologiearmen dienovereenkomstig. De lengte van de 5’ homologiearm is ~1 kb en die van de 3’ homologiearm is ~1,5 kb (Figuur 1).
- Label de reportercassette sequentieel stroomafwaarts van de genomische sequentie vlak voor het stopcodon, door middel van subklonen, zodat de endogene expressie niet wordt gewijzigd of verstoord. Koppel de reporter, of dubbele reportercassettes, met zelfsplitsende 2A-peptidesequenties (F2A, E2A of T2A) 20,21, of een interne ribosoom-entry-plaats (IRES).
Opmerking: Reporters kunnen fluorescerende eiwitten zoals GFP, tdTomato, tagRFP, YFP, luciferase, of een antibioticaresistentiecassette omvatten, een combinatie van fluorescerend eiwit en antibioticaresistentiecassette. Een voorbeeld wordt getoond in Figuur 1 voor het construeren van een targeting-vector voor het humane ALDH1L1-gen, gelabeld door EGFP en neomycineresistentiecassette. - Voeg een positieve selectiecassette toe stroomafwaarts van de reporter. De positieve selectie is een gefloxte antibioticaresistentiecassette die zal worden uitgeknipt uit de getargeteerde iPSC's nadat de positieve klonen zijn geselecteerd en geïsoleerd.
- Voeg een negatieve selectiecassette toe buiten de 3’ homologiearm. Veelvoorkomende negatieve selectiecassettes zijn thymidinekinase, TK, en difterietoxine A (DTA) 22.
- Verkrijg een humane BAC-kloon die de sequentie van de lijnmarker bevat en verifieer de kloon door PCR-amplificatie. Bouw de targeting-vector op in pKD46-bevattende DH5α met behulp van recombinering om de targetingsite naar beneden te halen 23. Pas multisite gateway, Golden gate-strategieën23,24 toe wanneer nodig.
2. Ontwerp en vectorconstructie van sgRNA's voor CRISPR/Cas9-systeem.
- Bepaal de lijnspecifieke marker die zal worden getargeteerd om de reporter te maken. Kopieer de cDNA-sequentie van de NCBI-database. Ga naar de humane BLAT-zoekopdracht om de genomische DNA-uitlijning te verkrijgen.
- Klik op het tabblad “browser” om de samenstelling van het gen te bekijken. Onder het tabblad “View”, klik op “DNA” om de volledige genomische DNA-sequentie in FASTA-formaat te verkrijgen.
- Lokaliseer het stopcodon binnen de DNA-sequentie, waar de 2A-sequentie en de reportercassette zullen worden getagd.
- Zoek naar de protospacer-aangrenzende motieven (PAM, d.w.z. NGG) binnen de nabijheid (~100 bp flankerend gebied) van het stopcodon. Scan beide strengen om de juiste NGG-sequentie te lokaliseren. Overweeg de specificiteit van de stroomopwaartse sequenties om potentiële off-target-gebeurtenissen te voorkomen. Gebruik open source-tools zoals BLAST en CasOT (zie Stap 5 voor details).
- Kopieer de sequentie van 20 basen onmiddellijk stroomopwaarts van NGG en plak deze in het webontwerptool ZiFit om oligo's te ontwerpen met overhangen die compatibel zijn met de humane-gRNA-expressievector (met U6-promotor) MLM3636.
- Synthetiseer zowel voorwaartse als achterwaartse oligo's 7.
- Om dubbelstrengs sgRNA te maken, denatureer beide oligo's gedurende 15 min bij 70 °C, en laat geleidelijk afkoelen tot RT. Voor een 50 μl-reactie, voeg 22,5 μl van voorwaartse en achterwaartse oligo's (stockconcentratie is 0,1 mM) respectievelijk toe, en 5 μl van anneeringbuffer (100 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 1,5 M NaCl, pH 8,0).
- Meng en lig de oligo's verkregen uit stap 2.7 met BsmBI-gedigesteerde humane-gRNA-expressievector (met U6-promotor) MLM3636. Voor een 20 μl-reactie, voeg 1 μl van oligo's uit Stap 2.7, 100 ng van MLM3636, en 1 μl (400 U) van T4-ligase toe. Incubeer bij RT O/N.
- Transformeer DH5α-competente cellen met het ligatieproduct door middel van hitteschok bij 42°C gedurende 30 sec. Laat de bacteriën groeien op LB-agar Ampicilline (100 μg/ml) plaat bij 37°C O/N. Kies 3~5 kolonies voor plasmide-miniprep volgens het protocol van de fabrikant. Sequenceer het plasmide-DNA om te bevestigen met behulp van commerciële leveranciers. Maxiprep het juiste plasmide volgens het protocol van de fabrikant.
- Evalueer sgRNA door middel van T7 endonuclease 1 (T7E1) assay (zie Stap 4 voor details). Transfecteer hiPSC met het plasmide en sgRNA zal worden geëxpreleerd onder de ingebouwde U6-promotor in de MLM3636-backbone (Zie stap 6 voor details).
3. Ontwerp en constructie van Cas9n dubbele nickase sgRNA
- Verkrijg dubbele nickase Cas9n D10A vector pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n (D10A).
- Ontwerp een paar voorwaartse en achterwaartse oligo's voor elke targeting-locus. Kopieer de sequentie van 20 basen onmiddellijk stroomopwaarts van NGG zoals beschreven in Stap 2 en plak deze in webontwerptool ZiFit
- Om oligo's te verkrijgen met overhangen die compatibel zijn met pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n (D10A), verwijder de eerste en laatste base van zowel de voorwaartse als achterwaartse oligo's die worden weergegeven door de ZiFit-ontwerptool.
- Synthetiseer voorwaartse en achterwaartse oligo's7. Noem deze oligo's f(n)-F, f(n)-R voor PAM's aan één kant van de doelplaats, r(n)-
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Targetingvectoren met alle noodzakelijke componenten, inclusief homologiearmen, een reportercassette en positieve en negatieve selectiecassettes, worden geconstrueerd (Figuur 1). Op basis van de endogene genomische locus worden meerdere (2 tot 3) sgRNA's (bij gebruik van het Cas9-systeem) of sgRNA-paren (bij gebruik van de Cas9n dubbele nickase-strategie) ontworpen en geconstrueerd in de menselijke gRNA-expressievector MLM3636 of pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n (D10A) backbones (Figuur 2)
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Genentargeten is een essentieel hulpmiddel bij het karakteriseren van genfuncties. Echter, de relatief lage efficiëntie vereist arbeidsintensief en tijdrovend werk. Recentelijk heeft de ontwikkeling van genome editing tools zoals het CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) systeem de targeting-efficiëntie aanzienlijk verbeterd. Dit manuscript beschrijft een protocol voor het genereren van lijnspecifieke humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC) reporter met behulp van CRISPR/Cas sy...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de afdeling Neurochirurgie, Memorial Hermann Foundation Staman Ogilvie Fonds, het Bentsen Stroke Center aan het University of Texas Health Science Center in Houston, en Mission Connect TIRR Foundation.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| pStart-K | Addgene | 20346 | |
| pWS-TK6 | Addgene | 20350 | |
| pKD3 | Addgene | 45604 | |
| pKD46 | The Coli Genetic Stock Center, CGSC | 7634 | |
| PGK-neo-bpA sequence | Addgene | 13442 | |
| Human BAC clones of target genes | https://bacpac.chori.org | ||
| JDS246 (Cas9-003), Mammalian codon-optimized streptococcus pyogenes Cas9-3X Flag | Addgene | 43861 | |
| MLM3636, Human-gRNA-ExpressionVector with U6 promoter | Addgene | 43860 | |
| pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n(D10A) | Addgene | 42335 | |
| sgRNA design, ZiFit | http://zifit.partners.org/ZiFiT/ | ||
| Off target prediction tool CasOT | http://eendb.zfgenetics.org/casot/download.php | ||
| Perl | http://www.perl.org/get.html | ||
| NCBI | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ | ||
| BLAT | https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start | ||
| sgRNA Primer synthesis | Sigma | ||
| One shot Top10 Electrocomp E. Coli Competent cells | Life Technologies | C4040-50 | |
| AccuPrime Pfx SupperMix | Life Technologies | 12344-040 | |
| Restriction enzymes | NEB and Life Technologies | ||
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Researech | D4007 | |
| DNA quick extraction buffer | Epicentre | QE0905T | |
| Herculase II Fusion DNA Polymerases | Agilent Technologies | 600675 | |
| Digestion buffer 2 | New England Biolab | ||
| 6X DNA Loading Dye | Thermo Scientific | R0611 | |
| TeSR-E8 Kit for hESC/hiPSC Maintenance | Stem Cell Technologies | 05940 | |
| UltraPure Agarose | Life Technologies | 16500-100 | |
| 50xTAE | Life Technologies | B49 | |
| Essential 8 medium | Life Technologies | A1517001 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline without Calcium and Magnesium | Life Technologies | A12856-01 | |
| D-MEM/F12 with Glutamax | Life Technologies | 10565018 | |
| D-MEM with Glutamax | Life Technologies | 10566040 | |
| Fetal Bovine Serum-ES cell qualified | Life Technologies | 10439 | |
| Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828010 | |
| 2-mercaptoethanol 1000X | Life Technologies | 21985023 | |
| Non Essential Amino Acid | Life Technologies | 11140050 | |
| Stempro Accutase | Life Technologies | A1110501 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| 0.25% Trypsin- EDTA solution | Life Technologies | 25200-056 | |
| Geltrex | Life Technologies | 12760-013 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | Millipore | SCM075 | |
| SMC4 reagent | BD | 354357 | |
| Neomycin resistant MEF | Millipore | PMEF-NL | |
| Hygromycin resistant MEF | Millipore | PMEF-HL | |
| G418 (Geneticin) | LifeTechnologies | 11811 | |
| Hygromycin B | Life Technologies | 10687010 | |
| FIAU (Fialuridine, 1-2-Deoxy-2-fluoro-ß-D-arabinofuranosyl-5-iodouracil | Moravek Biochemicals and Radiochemicals | M251 | |
| Electroporator: Gene Pulser Xcell | Bio-Rad | ||
| 0.4 cm electroporation cuvette | Bio-Rad | 165-2088 | |
| DIG-High prime DNA labeling and detection starter kit II | Roche | 11585614910 | |
| Hybridization denature solution | VWR | 82021-478 | |
| PCR DIG probe synthesis kit | Roche | 11636090910 | |
| DIG wash set | Roche | 11585762001 | |
| Anti-Digoxigenin (DIG-AP) | Roche | 11093274910 | |
| CSPD chemiluminescence system | Roche | 11755633001 | |
| DIG wash and block buffer set | Roche | 11585762001 | |
| 50X TAE buffer | Life Technologies | 24710030 | |
| Blotting buffer (25 mM Tris pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.1% Tween20) | |||
| Hoefer Ultraviolet Crosslinker | Fisher Scientific | 03-500-308 | |
| Spermidine | Fisher | AC13274-0010 | |
| Tris HCl 2M (pH 7.5) | VWR | 200064-506 | |
| Denville Scientific blue bio film 8x10 | Fisher | nc9550782 | |
| DNA molecular weight marker II ( DIG-labeled ) | Roche | 11218590910 | |
| Amersham Blotting membrane Hybond-N+ | Roche | 95038-400 | |
| Pyrex glass drying tray | Fisher | 15-242A | |
| Kimberly-Clark C-fold paper towels | Fisher | 06-666-32B | |
| Whatman 3MM paper (26X41) | Fisher | 05-713-336 | |
| Hybridization bag |
Referenties
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature. 31, 227-229 (2013).
- Friedland, A. E., et al. Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system. Nat Methods. , (2013).
- DiCarlo, J. E., et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Res. 41, 4336-4343 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, 819-823 (2013).
- Anders, C., Niewoehner, O., Duerst, A., Jinek, M. Structural basis of PAM-dependent target DNA recognition by the Cas9 endonuclease. Nature. 513, 569-573 (2014).
- Deltcheva, E., et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature. 471, 602-607 (2011).
- Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, E2579-E2586 (2012).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
- Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife. 2, e00471(2013).
- Fu, Y., et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nature Biotechnology. 31, 822-826 (2013).
- Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31, 827-832 (2013).
- Mali, P., et al. CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Nature Biotechnology. 31, 833-838 (2013).
- Pattanayak, V., et al. High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity. Nature Biotechnology. 31, 839-843 (2013).
- Shen, B., et al. Efficient genome modification by CRISPR-Cas9 nickase with minimal off-target effects. Nature Methods. 11, 399-402 (2014).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154, 1380-1389 (2013).
- Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nature Protocols. 9, 1956-1968 (2014).
- Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154, 1370-1379 (2013).
- Szymczak, A. L., et al. Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single 'self-cleaving' 2A peptide-based retroviral vector. Nature Biotechnology. 22, 589-594 (2004).
- Carey, B. W., et al. Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 157-162 (2009).
- Yagi, T., et al. A novel negative selection for homologous recombinants using diphtheria toxin A fragment gene. Analytical Biochemistry. 214, 77-86 (1993).
- Wu, S., Ying, G., Wu, Q., Capecchi, M. R. A protocol for constructing gene targeting vectors: generating knockout mice for the cadherin family and beyond. Nature Protocols. 3, 1056-1076 (2008).
- Xue, H., et al. A targeted neuroglial reporter line generated by homologous recombination in human embryonic stem cells. Stem Cells. 27, 1836-1846 (2009).
- Liu, Y., Jiang, P., Deng, W. OLIG gene targeting in human pluripotent stem cells for motor neuron and oligodendrocyte differentiation. Nature Protocols. 6, 640-655 (2011).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
