Geautomatiseerde kwantificering van hematopoietische cellen - stromale cel interacties in histologische afbeeldingen van ontkalkte Bone

Samenvatting

Er wordt een strategie gepresenteerd om histologisch data in het beenmerg kwantitatief te analyseren. Confocale microscopie van fluorescent gelabelde cellen in weefselsecties resulteert in 2-dimensionale beelden, die automatisch worden geanalyseerd. Co-lokalisatieanalyses van verschillende celtypen worden vergeleken met gegevens van gesimuleerde beelden, waardoor kwantitatieve informatie over cellulaire interacties wordt verkregen.

Samenvatting

Confocale microscopie is de voorkeurswerkwijze voor de analyse van de lokalisatie van meerdere celtypen binnen complexe weefsels zoals het beenmerg. De analyse en kwantificering van cellulaire lokalisatie is moeilijk, omdat in veel gevallen het berust op handmatige telling, waardoor met het risico van het introduceren van een beoordelaar afhankelijke voorspanning en verminderen interwaarnemersbetrouwbaarheid. Bovendien is het vaak moeilijk te beoordelen of de co-lokalisatie tussen twee cellen resulteert uit willekeurige positie, vooral wanneer celtypen sterk verschillen in de frequentie van voorkomen. Hier wordt een werkwijze voor onpartijdige kwantificering van cellulaire co-localisatie in het beenmerg ingevoerd. Het protocol beschrijft de bereiding van de monsters gebruikt voor histologische coupes van de hele muizen lange botten, waaronder het beenmerg te verkrijgen, evenals de kleuringsprotocol en de overname van beelden met hoge resolutie. Een analyse workflow variërend van de erkenning van hematopoietische en niet-Hematopoietic celtypes in 2-dimensionale (2D) beenmerg beelden naar de kwantificering van de rechtstreekse contacten tussen die cellen wordt gepresenteerd. Dit omvat tevens een wijk analyse, om informatie over de cellulaire micromilieu rond een bepaald celtype verkrijgen. Om te beoordelen of co-lokalisatie van twee celtypen is de resultante van willekeurige cel positioneren of reflecteert preferentiële associaties tussen de cellen een simulatie instrument dat geschikt is voor het testen van deze hypothese bij hematopoïetische en stromale cellen, is gebruikt. Deze benadering is niet beperkt tot het beenmerg, en kan worden uitgebreid tot andere weefsels reproduceerbare, kwantitatieve analyse van histologische gegevens mogelijk.

Inleiding

Door recente snelle technologische ontwikkelingen microscopie, waaronder optische, heeft de analyse van cellen in de context van het gehele weefsel steeds toegankelijker voor immunologen worden. De karakterisering van afzonderlijke cellen in suspensie een waardevolle en onmisbare methode cellulaire en moleculaire functie begrijpen. De analyse van de cellen in hun (micro) -anatomical milieu essentieel voor het begrijpen van de interacties tussen verschillende celtypen die samenwerken in complexe processen zoals de ontwikkeling van immuunresponsen.

Hoewel het relatief gemakkelijk microscopisten kwalitatieve informatie uit beelden te verkrijgen, blijft het een uitdaging om deze gegevens te kwantificeren, mede door het feit dat analysemethoden op dit gebied blijft achter met wat mogelijk is in beeldacquisitie. Veel onderzoekers nog steeds rekenen op tijdrovende handmatige cel tellen in hun histologie beelden,om zo voor een vertekening tussen de verschillende beoordelaars en belemmeren replicatie door andere groepen. Vaak wordt een representatief beeld gekozen om een ​​verklaring over cellulaire positie of co-lokalisatie onderstrepen in een publicatie, waardoor het moeilijk voor de lezer om de statistische relevantie van een dergelijke gebeurtenis te beoordelen.

Samen met het feit dat de volledige informatie-inhoud van beeldgegevens zelden wordt uitgebuit, benadrukt dit de noodzaak van een meer onpartijdige, sneller en alomvattende aanpak van de histologische beelden te analyseren.

Het beenmerg een complex weefsel dat neemt belangrijke vitale functies als orgaan van hematopoiese bij volwassen vertebraten. Naast het feit dat de geboorteplaats van hematopoietische cellen ^1,2 en spelen een belangrijke rol in de B-lymfocyten ontwikkeling ^3, fungeert het ook als een site waar immuunreacties worden geïnitieerd ⁴ en ondersteunt volwassen, recirculatie B-cellen ^5. Daarnaast zijn rol in het handhaven van immunological geheugen is steeds meer gewaardeerd in de afgelopen tien jaar, zoals verschillende soorten cellen vormen immunologisch geheugen zijn gevonden aldaar te verblijven ^6-9.

De verhouding tussen het complex weefsel architectuur van het beenmerg en de functies nog steeds blijven ongrijpbaar. In tegenstelling tot de secundaire lymfoïde organen, die worden georganiseerd in macro-compartimenten zoals T- en B-cel zones, het beenmerg ontbreekt een duidelijke macro-verkokering. Tot dusver verschillende compartimenten in het beenmerg worden gedefinieerd door hun nabijheid tot de botcortex of vasculatuur. Het belang van de verschillende resident stromale cel populaties in het beenmerg voor een aantal processen zoals ondersteuning stamcellen, ontwikkeling van B-cellen of het onderhoud van immuungeheugen celpopulaties (zoals langlevende plasmacellen (PC), CD4 ⁺ en CD8 ⁺ geheugen T-cellen) blijkt duidelijk dat er een zekere mate van micro-compartimentering in het beenmerg.

Deze waarnemingen hebben geleid tot het concept afzonderlijke microanatomical nissen, die gespecialiseerd zijn in bepaalde functionaliteiten (stamcel onderhoud, B-cel ontwikkeling in diverse stadia en onderhoud van immunologisch geheugen) in het beenmerg. Hoewel er lijkt een zekere mate van heterogeniteit tussen de nissen die verschillende functies te dienen sommige van de door stromale cellen, zoals CXC-chemokine ligand 12 (CXCL12) of interleukine 7 (IL-7), factoren cruciale onderdelen voor verscheidene van deze niches ^10. De visualisatie en karakterisatie van stromale cellen in het beenmerg is moeilijk vanwege hun morfologische kenmerken met lange, dunne dendritische verlengingen vormen van een netwerk in het beenmerg en het ontbreken van geschikte markers om stromale subpopulaties discrimineren.

Het is nog niet duidelijk in hoeverre deze niches gemeenschappelijke kenmerken met betrekking tot hun cellulaire en moleculaire composition, en welke elementen maken een bepaalde niche uniek. Naast stromale cellen, hematopoëtische celtypen hebben aangetoond dat het een cruciale rol spelen door bepaalde signalen althans voor sommige niches. Is duidelijk dat de complexiteit van de niche preparaat vereist de analyse in situ, en het is steeds belangrijker geworden voor immunologen en hematologen inzoomen op beenmerg microarchitectuur, bijvoorbeeld door analyse van de ruimtelijke relaties tussen de cellulaire componenten.

Hier strategie cellulaire co-localisatie en buurt verhoudingen in het beenmerg op geautomatiseerde en onpartijdige wijze kwantificeren gepresenteerd. Een gedetailleerde workflow inclusief het genereren van chimere muizen harboring fluorescerende stromale cellen en niet fluorescerende hematopoietische cellen, bereiding van histologische coupes van niet ontkalkte beenderen, verwerving van confocale afbeeldingen die het gehele bot, en de geautomatiseerde beeldanalyse van cellulaire co-lokalisatie en de validatie / discriminatie van willekeurige positionering door een simulatie-tool is voorzien (Figuur 8).

Protocol

De dierproeven werden goedgekeurd door de juiste staats-comités voor dierenwelzijn (Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlijn) en werden uitgevoerd in overeenstemming met de geldende richtlijnen en voorschriften (dierproef licentie G0194 / 11).

1. Generatie van TL-Bone Marrow Chimerische Muizen

Opmerking: Het genereren van fluorescente beenmerg chimere muizen beenmerg stromale cellen zichtbaar wordt uitgevoerd zoals beschreven voor ^9.

1. Gaan behandelen Del-Cre x ROSA-tdRFP muizen (muizen die tandem rood fluorescerend eiwit (tdRFP) alomtegenwoordig ^11-13) om hen voor te bereiden op bestraling. U kunt ook een andere stam met alomtegenwoordige uitdrukking van fluorescerend eiwit. Dien 1 mg / ml neomycine en 1 mg / ml vitaminen (A, D3, E, C) via het drinkwater twee dagen voor de bestraling.
2. Bestralen muizen tweemaal met 3,8 Gray met een Cesium-137 gamma-bestraler within een interval van 3 uur. Hiervoor plaatst u muizen in een bestraling taart kooi geschikt voor de respectieve bestraler.
   OPMERKING: Voor de bestraling van muizen, doet ons instituut geen verdoving nodig. Volg de lokale institutionele beleid ten aanzien van anesthesie voor bestraling. Dieren behandelen met 5 mg / kg carprofen subcutaan (sc) per dag na bestraling bij tekenen van pijn.
3. De volgende dag, reconstitueren muizen door een intraveneuze injectie van 3 x 10 ⁶ beenmergcellen bereid uit lange beenderen van C57BL / 6 donor muizen in transferbuffer ^9. Houd de muizen op Neomycine en vitaminen voor maximaal 2 weken en het toezicht op hun welzijn en het gewicht in deze tijd. Wacht minstens 4 weken om voor reconstitutie van het immuunsysteem voordat de specifieke experimentele behandelingen (bijvoorbeeld immunisatie) ^9.
4. Offeren muizen en leg ze op een dissectie boord, steriliseren de benen met 70% ethanol. Euthanize muizen in overeenstemming met de lokale institutionele beleid. Ons Instituut voert cervicale dislocatie.
5. Gebruik een tang en schaar om de huid van de dijen te verwijderen. Verwijder spierweefsel het dijbeen bloot. Ontwrichten de femorale bot van de heup en knie met behulp van een tang en schaar. Wees voorzichtig niet te breken of snijden het bot.
6. Verwijder voorzichtig resterende grote stukken van spierweefsel en kraakbeen van het bot met een schaar. Verwijder resterende spierweefsel door te wrijven op het bot met laboratorium vloeipapier. Verzamel de schoongemaakte botten in een petrischaal met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
7. Fix geheel femorale bot in 4% paraformaldehyde (PFA, elektronenmicroscopie-kwaliteit) gedurende 4 - 6 uur.
8. Gooi PFA en incubeer botten in 10% sucrose in PBS O / N. De volgende dag, incubeer de botten in 20% sucrose O / N. De dag na, incubeer de botten in 30% sucrose O / N.

2. cryosectioning van Bones

OPMERKING: Na 16-24 uur in 30% sucrose, botten bevriezen en cryosectie ze volgens Kawamoto's tape methode ^14,15.

1. Bereid een grote beker (2000 ml volume) met droog ijs en aceton (ongeveer 2: 1 volume-verhouding, bijvoorbeeld, 400 ml droge ijs en 200 ml aceton) onder een afzuigkap. Plaats een kleine beker (150-250 ml volume) met hexaan binnen (30 - 50 ml ongeveer). Wacht tot het mengsel afkoelen (ongeveer 10 min, tot de vorst op het buiten de grote beker).
2. Vul ¾ van de gelabelde cryomold met Super Cryoembedding Medium (SCEM); de botten voorzichtig plaatsen in tot ze volledig ondergedompeld, zorg dat ze niet over de randen van de mal te raken. Met grote tang houdt de cryomold in de beker met de bodem van de matrijs slechts het oppervlak van de hexaan raken.
   1. Laat de buitenranden van de SCEM bevriezing (aangegeven dekking, dit duurt ongeveer 15 seconden). Vervolgens volledig te laten vallen de mal in de hexaan en laat het freEze voor 1-2 min. Haal de bevroren monster en verpakken in cellofaan en dan aluminiumfolie (om het monster tegen uitdrogen te beschermen en om de blootstelling aan licht te vermijden). Bewaren bij -80 ° C tot cryosectioning.
3. Voor cryosectioning van dijbeen botten gebruiken een standaard microtoom en microtoom messen voor harde weefsels.
4. Stel het monster en het blad temperatuur van het microtoom tot -24 ° C. Laat het monster in de microtoom zitten voor ongeveer 15 minuten voor het snijden.
   1. Fix het monster blok aan het metalen monster houder met SCEM of optimale snijtemperatuur (oktober) medium. Stel de oriëntatie van het blok indien nodig. Knip het monster totdat het bot volledig geopend en het merg zichtbaar. Stel de snijdikte tot 7 micrometer (gooi de eerste sectie).
   2. Bevestig een stukje Kawamoto tape met de kleverige kant op de bovenkant van het monster blok met behulp van een hert leder-overdekte houten spatel. Vervolgens snijd het monster en draai de tape, zodat de sectie iszich aan de bovenzijde. Breng de tape aan een dia glas met behulp van een tang. Bevestig de tape aan de dia glas met Scotch tape.
5. Laat secties drogen gedurende ten minste 30 min en opgeslagen bij -80 ° C tot gebruik. WINKEL ongekleurd en gemonteerde dia in plastic dozen dia afstandhouders tussen dia's uit om te voorkomen dat ze aan elkaar kleven. Gekleurd en gemonteerde dia's kunnen worden opgeslagen voor maximaal een week in kartonnen mappen glijbaan bij 4 ° C.

3. Image Collection

1. Ontdooien en vlek cryocoupes volgens gemeenschappelijke immunofluorescentie protocollen ^9. Neem een nucleaire kleuring, bijvoorbeeld, 4 ', 6-diamidino-2-fenylindool dihydrochloride (DAPI) voor weefselintegriteit visualiseren.
   OPMERKING: Stain bijvoorbeeld voor RFP naar stromale cellen (anti-RFP-biotine antilichaam en streptavidine-Alexa Fluor 555), vlek eosinofielen met rat anti-major basic protein (MBP) antilichamen en anti-rat-Alexa Fluor 647-antilichaam visualiseren B-cellenmet rat anti-B220-Alexa Fluor 594 antilichaam en pc's met anti-κ lichte keten-fluoresceïne-iso-thiocyanaat (FITC) en anti-λ1 lichte keten-FITC antilichamen (details van de kleuringsprocedure worden beschreven in ^9).
2. Monteer gekleurde coupes: zet één druppel Fluoromount op de afdeling en dan bedekken met een # 1 glas dekglas, terwijl de vorming van luchtbellen zorgvuldig vermeden. Vervolgens voeren laser scanning confocale microscopie met een toestel met laserlijnen geschikt voor de kleuring.
3. Om de beelden voor automatische co-lokalisatie analyse van beenmerg hematopoietische cellen met stromale cellen met behulp van de Wimasis tool, de volgende instellingen toe te passen op te nemen:
   1. Gebruik een 20X objectief en een gezichtsveld van 708,15 x 708,15 urn. Voor geautomatiseerde analyse houdt de grootte van alle beelden dat ten 2048 x 2048 pixels (px) om de resultaten vergelijkbaar te houden.
   2. Noteer één kanaal voor stromale structuren (bijvoorbeeld, 561 nm laser lijn), een kanaal voor de kernen (bijvoorbeeld DAPI, 405 nm) en extra kanalen voor de hematopoietische cellen van belang (bijvoorbeeld, 3 kanalen, 488/594/633 nm voor eosinofielen, B-cellen en PC's).
   3. Beelden opnemen met lijn van gemiddeld 4 ^16. In het ideale geval het gehele dijbeen sectie door het nemen van enkele aangrenzende beelden. U kunt ook niet-aangrenzende foto's uit verschillende regio's van het beenmerg (diafysaire evenals epiphyseal).
      LET OP: Wees voorzichtig niet te overlappingen tussen aangrenzende beelden (tot herhaalde analyse van cellen in de overlappende gebieden te vermijden) te produceren.
4. Sla de beelden in een microscopie beeldbestandsformaat. Controleren en eventueel contrast voor alle kanalen in de viewer / analysesoftware passen.
5. Export 3 .jpg bestanden per beeldbestand: een .jpg-bestand voor de DAPI kanaal (rood / groen / blauw (RGB) formaat, valse kleur gecodeerd in het geel), een .jpg-bestand voor het stroma kanaal (grijswaarden) en één .jpg bestand metde kanalen voor hematopoietische cellen (maximaal 3 kanalen, RGB-formaat, bijvoorbeeld FITC (pc's, valse kleur: groen) / Alexa Fluor 594 (B-cellen, valse kleur: blauw) / Alexa Fluor 647 (eosinofielen, valse kleur: rood)) .

4. Automated Image Analysis

1. Gebruik een afbeelding analyse tool om beeldsegmentatie, kwantificering van co-lokalisatie en buurt analyse (zie Discussie) uit te voeren.
2. Bij gebruik van de Wimasis gereedschappen, gaat u als volgt te werk:
   1. Upload de sets van 3 .jpg bestanden per beeld met dezelfde bestandsnaam, gevolgd door een underscore en een vermelding van het type van het beeld.
   2. Gebruik _1 voor de .jpg-bestand met hematopoietische cellen, _2 voor de .jpg-bestand voor de DAPI kanaal, _3 voor de .jpg-bestand voor het stroma kanaal. Bijvoorbeeld: Image1_1.jpg (hematopoietische cellen), Image1_2.jpg (DAPI kanaal), en Image1_3.jpg (stroma-kanaal). Upload de foto's via de klant rekening.
   3. Voor celcontact kwantificeringkies de cel contact instrument door te klikken op de respectievelijke veld. Voor mobiele omgeving kwantificeren, kiest de cel omgeving gereedschap en voer de voorkeur omgeving straal in micrometer (die wordt gemeten vanaf de randen van de cellen).
   4. Download de resultaten.
      Opmerking: De resultaten worden als .jpg bestanden waarin de hematopoietische cellen en stroma kanaal met de grenzen van de gedetecteerde objecten gemarkeerd, evenals enige CSV bestanden met de metingen voor elke afbeelding, naast een overzicht CSV bestand bevat de gegevens voor alle geüploade afbeeldingen.
3. Van contactmetingen bepalen de frequentie van hematopoietische cellen (rood, groen of blauw cellen) in contact met stromale cellen of de frequenties van rode, groene of blauwe cellen contact andere hematopoëtische celtypen (een voorbeeld is getoond in Representatieve resultaten Figuur 4). Om de frequentie te bepalen, verdeel het de contact tellingen per afbeelding doorde totale cel telt per beeld.
   1. Voor experimenten met individuele muizen, een samenvatting van de totale contact tellingen van alle beelden die voor de enkele muizen en verdeel ze door de som van de totale cel tellingen van alle afbeeldingen.
4. Uit de nabijheid metingen bepaalt de frequentie van rood, groen of blauw cellen in de geselecteerde afstand van stromale cellen en / of de frequenties van rode, groene of blauwe cellen in de gewenste nabijheid van de andere hematopoietische celtypes zoals beschreven in stap 4.3 ( zie ook Representatieve resultaten, figuur 4).

5. Simulatie van Random Bone Marrow Positioning

1. Voor het uitvoeren van de simulaties van willekeurige cel positionering op de geanalyseerde beenmerg histologische beelden, de voorbereiding van de volgende bestanden op voorhand: de enkelvoudige .csv-bestanden die door de cel contact tool, de originele .jpg bestanden voor de DAPI kanaal en de originele .jpg bestanden voor de stromale kanaal.
2. Om voerenbatch simulaties op een reeks beelden (bijvoorbeeld alle afbeeldingen van de ene dij sectie), het verzamelen van alle originele .jpg bestanden (_1, _2 en _3) en de corresponderende enkele CSV-bestanden in een map.
   OPMERKING: De simulatietool voor willekeurige beenmergcel positionering is op aanvraag beschikbaar.
3. Start de simulatie-tool, vink het vakje "Auto-load beeldgegevens".
   OPMERKING: Het programma zal de cellen en gemiddelde celgrootte van het CSV-bestand automatisch gelezen. Deze waarden worden weergegeven in de vakjes "Cell number" en "Vakgrootte AVG" (figuur 5A).
4. Voer de gemeenschappelijke tag voor de CSV-bestanden, dat wil zeggen, de gemeenschappelijke factor in hun naam. Voer het nummer van de afbeelding sets die moeten worden gebruikt voor batch-modus simulatie.
5. Laad het .jpg-bestand gegenereerd uit de stroma-kanaal (met bestandsnaam die eindigt _3).
6. Voer de instellingen voor het genereren van het masker van de DAPI kanaal:
   1. Vink het vakje "? Breng het masker "Stel de drempel voor het de DAPI omzetten in een binair masker tot 10 (range 0-255).
   2. Vink het vakje "8-bit?" Vink het vakje "Homothetie?" En stel de rang van dilatatie tot 5 px. Vink het vakje "w / erosie?".
   3. Geef de waarde voor de nabijheid radius (buurt radius) gebruikt bij de analyse van de gesimuleerde afbeeldingen. Voor een beeld van 708,15 x 708,15 urn met een grootte van 2048 x 2048 px (pixel scaling xy: 0,346 micrometer), 29 px overeen met 10 micrometer.
7. Vakje "Gebruik Otsu?" Naar Otsu's algoritme ¹⁷ te gebruiken voor automatische detectie van stromale structuren.
   Opmerking: Dit is hetzelfde algoritme dat wordt gebruikt door het contact en omgeving tool. Met behulp van dezelfde afbeelding segmentatie-algoritme in de geautomatiseerde analyse van het opgenomen beeld en de gesimuleerde afbeelding is van cruciaal belang om de gegevens vergelijkbaar te houden.
8. Voer de instellingen voor hematopoietische cellen, die are gesimuleerd als ronde vormen.
   OPMERKING: De mobiele nummers voor rood, groen en blauw cellen zijn, worden rechtstreeks van het CSV-bestand (zie ook stap 5.6).
   1. Gebruik het simulatieprogramma de gemiddelde diameter berekenen px rode, groene en blauwe cellen. Bepaal het gemiddelde oppervlak van een cel als het totale oppervlak van elk celtype in de afbeelding px gedeeld door het totale aantal cellen per beeld. Gebruik de gemiddelde gebied om de straal van een schijf met de formule berekenen. Dubbele straal tot de gemiddelde diameter bepalen.
9. Meet de celgrootteverdeling van de geanalyseerde celtypen met elke software voor beeldanalyse dat object segmentatie functies omvat. Bepaal σ voor hematopoëtische celtypen ⁽¹⁸ en figuur 5B).
   Opmerking: omdat de celgrootte verdelingen van de opgenomen cellen niet worden bepaald door de geautomatiseerde beeldanalyse gebruikt een Gaussische verdeling als een benadering van de werkelijke verdelingen. De breedte van de thij verdelingskromme wordt door σ en kan heel verschillend voor verschillende celtypen. (Voor meer informatie, zie figuur 5B).
   1. Uit deze metingen, bepalen de "cel grootte cutoff": de diameter in px dat de kleinste object nog steeds erkend als een complete cel door het beeld analyse-instrument beschrijft.
10. Voer parameters in de respectievelijke vakken op de grafische gebruikersinterface (figuur 5A).
    1. Voer de celgrootte afgesneden, dat wil zeggen, de minimale celgrootte toegelaten in de simulatie, een diameter px.
    2. Voer σ in px voor de simulatie van de celgrootteverdeling voor rood, groen en blauw cellen (uit stap 5.9).
    3. Vink het vakje "Verwijderen" in de subsectie "Cellen in Mask". Met deze instelling zal het programma een nieuwe positie gekozen voor een cel als het overlapt met ten minste één pixel met een verboden gebied van het masker. Vink het vakje "Vermijd cel overlap? ̶1; in de subsectie "Cell uitsluiting".
    4. Voer de toegestane minimale afstand tussen de middelpunten van twee cellen in px.
       OPMERKING: De minimale afstand moet worden bepaald op basis van de opgenomen beelden. Verkeerd gemeten minimale afstanden zal leiden tot vertekende / kunstmatige resultaten voor de vergelijking van opgenomen en gesimuleerde afbeeldingen.
    5. Stel de maximale oppervlakte van overlap tot 100% indien de overlap wordt bepaald door de minimale afstand van centrum tot centrum.
    6. Stel de simulatietool tot 1.000 herhalingen.
    7. Vink het vakje "Automatisch opslaan cellen?" Om de coördinaten van de gesimuleerde objecten sparen voor alle herhalingen van elk beeld van de partij als .rect bestanden (tekst-formaat). Vink het vakje "Automatisch opslaan beelden?" Naar een .tiff bestand op te slaan voor elk beeld gesimuleerd. Voer een gemeenschappelijke tag voor de opgeslagen bestanden.
       OPMERKING: De "? Automatisch opslaan cellen" optie vermindert simulatie looptijd en de totale hoeveelheid gegevens, in vergelijking met het opslaan van de werkelijke gesimuleerde images. De .rect bestanden de coördinaten van de gesimuleerde cellen rechthoeken en kunnen dus worden omgezet in gesimuleerde beelden indien nodig.
11. Start de simulatie door te klikken op "Run simulatie".
    OPMERKING: De simulatie-tool genereert een CSV-bestand automatisch voor de 1.000 simulaties van elk beeld, inclusief de gemiddelde contact tellingen en omgeving telt voor rood, groen en blauw cellen met rood, groen, blauw, en stromale cellen voor elke set van herhaalde simulaties . Bovendien, voor al deze waarden gemiddelden van 1000 simulaties met standaarddeviatie (STD) en standaardfout van het gemiddelde (SEM) zijn voorzien.
12. Bepaal de gemiddelde contact frequenties en omgeving frequenties van een set van 1000 gesimuleerde afbeeldingen. Voor deze, verdeel de gemiddelde contactgegevens en omgeving tellingen door de opgenomen celgetal per beeld. Vergelijk de frequenties de resultaten van het geautomatiseerde co-lokalisatie analyse van het opgenomen beeld.
13. Pas geschikte statistical methoden, afhankelijk van de analyse ¹⁹ (voor figuur 7, hebben we gebruik gemaakt van een tweezijdig Wilcoxon signed rank test).

Resultaten

Snijden cryosecties van ontkalkte bot met Kawamoto tape methode maakt het hele bot te snijden als een intact deel, het beenmerg van de endosteale regio nog aan de gemineraliseerde bot, zowel in de diafyse als in de epifyse gebieden met hun hoge dichtheid van trabeculair bot (Figuur 1). Nucleaire kleuring van secties blijkt dat hoewel kleine barsten in het preparaat niet volledig kan worden vermeden, de structuur van de sinusoïden en slagaders en de reticulaire netwerk van het parenchym blijft intact.

Discussie

Ondanks de vooruitgang in de moderne optische beeldvorming methoden, is de analyse van histologische gegevens nog vaak gehinderd door het ontbreken van een goede kwantificering instrumenten en methoden, of door bevooroordeelde analyses die zich richten op een klein gebied van belang. De synergetische aanpak hier gepresenteerde combineert beeldanalyse die het hele beenmerg regio, geautomatiseerde segmentatie en het herkennen van objecten van verschillende hematopoietische en stromale celtypen, co-lokalisatie analyse, en ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Neomycin	Sigma	N6386 SIGMA	Neomycin trisulfate salt hydrate, EU hazard code: GHS08
Ursovit AD3EC	Serumwerke Bernburg		1 ml bevat: 50.000 I.E. retinyl palmitate, 5.000 I.E. cholecalciferol, 30 mg tocopherylacetaat, 100 mg ascorbinezuur, 1 mg sorbinezuur, 200 mg polyoxyl 35 castorolie, 0,5 mg propylgallaat
Transfer buffer (100 ml PBS, 1 ml 1 M HEPES, 50 U/ml penicillin/streptomycin)	Sigma	P4333, H3375
4-Hydroxy-3-nitrofenylacetyl hapten geconjugeerd met kippengammaglobuline
Kippengammaglobuline (CGG) 100 mg	Rockland	D602-0100
20% Paraformaldehydeoplossing (EM-kwaliteit)	Science Services	15713	EU gevarencodes: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08
D(+)-sucrose	Carl Roth	4621.1
Droogigs
Aceton	Sigma-Aldrich	179124 SIGMA-ALDRICH	EU gevarencodes: GHS02, GHS07
Hexaan	Sigma-Aldrich	208752 SIGMA-ALDRICH	EU gevarencodes: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09
Tissue-Tek cryomolds (standaard)	Sakura	4557	25 x 20 x 5 mm
Tissue-Tek O.C.T.	Sakura	4583
Kawamoto's SCEM inbeddingsmedium	Section-Lab, JP
Kawamoto's cryosection bereidingskit	Section-Lab, JP
Kawamoto's cryofilm type 2C(9)	Section-Lab, JP
Microtoomblad MX35 premier plus, laag profiel	Thermo Scientific	3052835	L X B: 80 x 8 mm (31,5 x 3,13"), dikte: 0,25 mm (0,01")
Polyklonaal konijn anti-RFP antilichaam, gebiotinyleerd	Rockland	600-406-379
Alexa Fluor 555 streptavidin	Life Technologies	S-32355
Rat anti-MBP	J. en N. Lee		beschikbaar bij: J. en N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ, U.S.A., clone MT-14.7
Geit anti-rat-Alexa Fluor 647	Life Technologies	A-21247
Rat anti-B220 - Alexa Fluor 594			geproduceerd en gekoppeld in-house (DRFZ), clone RA3.6B2, Alexa Fluor 594 van Life Technologies
Muis anti-l1 lichte ketting -FITC			geproduceerd en gekoppeld in-house (DRFZ), clone LS136
Rat anti-k lichte ketting - FITC			geproduceerd en gekoppeld in-house (DRFZ), clone 187.1
DAPI (4',6-diamidino-2-fenylindoldihydrochloride)	Sigma	D9542 SIGMA
Fluorescente montage medium	DAKO	S3023
Dekglasjes (24 x 24 x 0,13-0,16 mm)	Carl Roth	H875.2
Superfrost glasplaatjes (75 x 25 mm)	VWR	48311-703
Laser scanning confocale microscoop			uitgerust met laserlijnen van 405, 488, 561, 594, 633 nm en een 20X/0,8 NA luchtobjectieflens. We gebruikten een Zeiss LSM710 en Zen 2010 versie 6.0 software.
Automatische beeldanalysetools voor beenmerg	Wimasis, München		De celcontacttool en celbuurttool worden door Wimasis op aanvraag beschikbaar gesteld.
VC2012 runtime	Microsoft		gratis download