Een methode voor het selecteren-Structure schakelen Aptameren Toegepast op een Colorimetric gouden nanodeeltjes Assay

Summary

Er wordt een protocol geboden om structure-switching aptameren voor kleine molecuuldoelen te selecteren op basis van een instelbare strengheid magneetparel selectiemethode. Aptameren geselecteerd met structure-switching eigenschappen zijn gunstig voor assays die een conformationele verandering vereisen om de aanwezigheid van een doel aan te geven, zoals de beschreven gouden nanodeeltjes assay.

Abstract

Kleine moleculen rijke doelstellingen voor biosensing toepassingen vanwege hun fysiologische gevolgen als biomarkers van verschillende aspecten van de menselijke gezondheid en prestaties. Nucleïnezuur aptamers zijn steeds vaker toegepast als erkenning elementen op biosensor platforms, maar het selecteren aptamers richting klein molecuul doelen vereist speciale overwegingen bij het ontwerp. Het beschrijft modificatie en kritische stappen van een werkwijze ontworpen structuur schakelen aptameren kleine moleculen doelen te selecteren. Binding sequenties uit een DNA-bibliotheek gehybridiseerd met complementaire DNA capture probes op magnetische korrels worden gescheiden van nonbinders via een doelwit geïnduceerde verandering in conformatie. Deze werkwijze is voordelig omdat sequenties binden de dragermatrix (korrels) niet verder worden versterkt, en het niet immobilisatie van het doelmolecuul vereisen. Echter, de smelttemperatuur van de vangprobe en de bibliotheek bewaard bij of iets boven kamertemperatuur, zodat sequenties thoed dehybridize basis van thermodynamica zal ook in de bovenstaande oplossing. Dit effectief beperkt de partitionering efficiency (het vermogen om aparte doelgroep bindingssequenties van nonbinders), en dus veel selectieronden vereist zal zijn om de achtergrond sequenties te verwijderen. De gemelde methode verschilt van de vorige-structuur schakelen aptamer selecties te wijten aan de uitvoering van negatieve selectie stappen, vereenvoudigd verrijking monitoring, en de uitbreiding van de lengte van de invangingsprobe volgende selectie verrijking om verbeterde strengheid bieden. De geselecteerde structuur switching aptameren zijn voordelig een gouden nanodeeltjes assay platform dat de aanwezigheid van een doelmolecuul van de conformationele verandering van de aptameer rapporten. De gouden nanodeeltjes assay werd toegepast omdat het een eenvoudige, snelle colorimetrische uitlezing die bijdragen in klinische of ingezet omgeving. Ontwerp en optimalisatie overwegingen worden gepresenteerd voor de test als proof-of-principle werk in buffer om een ​​basis voor verdere uitbreiding van het werk in de richting van kleine molecule biosensoren in fysiologische vloeistoffen te voorzien.

Introduction

Kleine moleculen zijn lang erkend als spelen een belangrijke rol bij diverse biologische processen zoals fysiologische toxiciteit of voeding, cell signaling en als farmaceutische behandelingen voor ziekten ^1. Verscheidene kleine moleculen zijn ook voorgesteld als biomarkers indicatie van fysiologische toestanden zoals stress ^2,3, vermoeidheid ⁴ en ⁵ ziekte. Bijvoorbeeld, verhoogde cortisol niveaus correleren met stress die kan leiden tot een verminderde fysiologische prestaties en andere gezondheidsvoorschriften ^6-8. Ook verschillen in de verhoudingen van bepaalde peptiden in speeksel voorspellend vermoeidheid, waarbij fysiologische manifestaties omvatten gebrek aan concentratie, verminderde reactietijd en verminderde cognitieve functie ^4. Daarom kan de ontwikkeling van doelwitspecifieke biosensoren het niveau van kleine moleculen volgen onschatbare metrisch vast om de gezondheid en het prestatievermogen van een individual.

Historisch gezien is klein molecuul detectie werd uitgevoerd door arbeidsintensieve scheidingstechnieken of door antilichamen gebaseerde herkenning ^6,7. Recenter nucleïnezuur aptameren ^9,10 ontstaan ​​als herkenningselementen die duidelijke voordelen hebben boven antilichamen in specifieke toepassingen. Met hun vermogen aan een doelwit variërend in grootte van ¹¹ tot metaalionen weefsels ¹² binden, zijn aptameren grote schaal toegepast als herkenningselementen in biosensoren platformen ^13,14. Vergeleken met antilichamen, aptameren worden chemisch gesynthetiseerd en is derhalve eenvoudig reproduceerbare chemische modificaties voor oppervlakte immobilisatie of melding voeren. Aptameren kunnen worden geselecteerd met een hoge specificiteit onder de gewenste omstandigheden door aanpassing van de selectie toegepaste, terwijl antilichamen beperkt tot fysiologische omstandigheden ^15,16. Daarnaast aptameren kunnen hogere liganddichtheid door thEir kleiner formaat, wat resulteert in hogere doel signalering efficiency op een biosensor platform, en de verbeterde stabiliteit van aptamers zorgt voor herhaald gebruik en de sensor opslag op lange termijn ^16.

Aptameren worden gegenereerd in een proces bekend als SELEX, waarbij een initiële bibliotheek van sequenties is geëvolueerd van 10 ¹³ -10 ¹⁵ unieke moleculen een verrijkte uiteindelijke pool met verschillende (10 ¹ -10 ²⁾ sequenties met potentieel om het doelwitmolecuul binden. Het uiteindelijke verrijkte pool wordt vervolgens gesequenced en de dissociatie constanten _(Kd) worden verkregen uit bindingsassays van het hoogste kopieaantal sequenties van het doelwitmolecuul. Evolutie van het zwembad definitieve verrijkte populatie wordt gevolgd door monitoring van de percentage van de pool bindende het doel in elke ronde, totdat maximale verrijking wordt verkregen. Dit vindt plaats over een aantal evolutionaire rondes, waar bindingssequenties worden gescheiden van nonbinders en amplven met behulp van de polymerase kettingreactie (PCR). Het vermogen om effectief te verdelen en bindmiddelen behouden is een van de belangrijkste determinanten van de doeltreffendheid van selectie en direct invloed op de eigenschappen van de geselecteerde aptameren ^15. De SELEX partitioneren fase is moeilijker voor kleine moleculen, omdat zij niet de grootte of aantal functionele groepen dat het verdelingsproces eiwit doelwitten ^1,15 helpen bezitten. Bijvoorbeeld, veel eiwit partitioneren platforms vertrouwen op grootte of lading gebaseerde scheiding, maar de eigenschappen van gebonden DNA-klein molecuul doelwit complexen algemeen niet significant verschillend van dat van bindende sequenties, waardoor effectief afscherming ^1. Alternatieve SELEX partitionering methoden kunnen immobilisatie of de etikettering van de doelgroep te betrekken, die mogelijk invloed op de binding kenmerken van een klein molecuul. Bijgevolg is het ontwerp van een selectieprocedure te aptamers genereren voor kleine molecule richt requires speciale aandacht.

Diverse wijzigingen zijn aangebracht om de oorspronkelijke SELEX werkwijze tot compartimentering doeltreffendheid van de procedure, het verbeteren van de affiniteit of specificiteit van de sequenties in het uiteindelijke zwembad, of het ontvankelijker voor verschillende toepassingen ^15,16. Een SELEX modificatie kunnen selecteren op kleine moleculen ontworpen om structuur schakelen aptameren, of aptameren die een conformatieverandering op interactie met het doelmolecuul ^17,18 ondergaan genereren. In een voorbeeld van deze werkwijze wordt de bibliotheek gehybridiseerd met een kort stuk van bindende complementair DNA (cDNA) geïmmobiliseerd op magnetische beads ^17. Bij doelwit binden, de conformatieverandering bindende sequenties kunnen ze dehybridize van de cDNA vrij te geven in de bovenstaande vloeistof, terwijl de resterende nonbinders gehybridiseerd met de cDNA / kralen magnetisch verdeeld en afgevoerd. Deze methode is advantageous voor kleine moleculen omdat het niet immobilisatie of etikettering van de doelmolecuul dient om scheiding te bereiken.

Aptameren die in staat structuur-switching zijn bezitten een waardevolle eigenschap voor eventuele biosensor platform dat een verandering in aptameer structuur vereist de aanwezigheid van een doelmolecuul te detecteren. Specifiek kan aptameren gecombineerd met gouden nanodeeltjes (AuNPs) te testen die functioneren op basis van de structuur schakelprincipe een colorimetrische reactie in aanwezigheid van doelwitmolecuul na zout challenge ^19,20 produceren creëren. In een AuNP test, het enkelstrengs DNA (ssDNA) aptamer aanvankelijk adsorbeert aan de AuNP oppervlak en beschermt tegen zout uitdaging. De aanwezigheid van het doelwit induceert een conformationele verandering in de aptameer dat AuNP oppervlak bloot, waardoor een rood naar blauw kleurverandering na zouttoevoeging. AuNP assays ook aangetoond signaal waar micromolaire affiniteit aptameer amplificerens kunnen doelwit in gehalten orden van grootte hoger dan de dissociatieconstante _(Kd) ^21. Deze functie is vooral aantrekkelijk voor kleine molecule doelen, waar affiniteiten doorgaans variëren van lage micromolaire tot millimolaire concentraties ^1,15. In het algemeen is de test ook snel en relatief eenvoudig uit te voeren, stimuleren verder onderzoek aptameer-AuNP assays biosensor detectieplatformen.

Het doel van dit werk is om een ​​universeel protocol voor het selecteren-structuur te schakelen aptamers om kleine moleculen voor biosensoren applicaties met behulp van de stress marker cortisol als vertegenwoordiger molecuul bieden. Een AuNP biosensor detectie regeling is van belang vanwege de eenvoud van bediening en colorimetrische uitlezing, maar-structuur schakelen aptamers zijn van toepassing op alternatieve sensing platform uitgangen, zoals elektrochemische ²² of fluorescentie ²³ die ook zorgen voor de detectie via een verandering in aptamer conformation op doel bindend. Vergeleken met voorgaande methoden, werden meerdere negatieve selectie stappen opgenomen in het ontwerp ^17,18, en een eenvoudige UV-gebaseerde verrijking detectie regeling werd uitgevoerd (Figuur 1). Dit protocol is in tegenstelling met de radioligand verrijking detectiemethode gebruikt bij oudere werkwijzen ^17. De voorgestelde werkwijze opgenomen tevens een toename van de lengte van het cDNA capture probes gebruikt bij de selectie tot compartimentering efficiëntie en effectief afstemmen van de stringentie van de selectie na maximale verrijking waargenomen ^24. De afgestemd stringentie tot een lagere totale percentage DNA geëlueerd door het doel in het uiteindelijke zwembad, maar resulteerde in hogere aantal kopieën van een sequentie die bonden met verbeterde affiniteit in vergelijking met het hoogste aantal kopieën sequentie van een eerdere ronde. Het hoogste aantal kopieën sequentie van het uiteindelijke pool werd op een AuNP test om te illustreren dat de sequentie vatbaar is een platformdat vraagt ​​om een ​​structurele verandering op doel te geven bindend. Deze buffer gebaseerde test laat zien dat de reactie van de AuNP test door het veranderen van de dichtheid van DNA kan worden gemodificeerd op het oppervlak, en dient als proof-of-principle teneinde de toekomstige onderzoeksinspanningen gaan inzetten ontwikkelen klein molecuul-aptameergebaseerde AuNP biosensoren in fysiologische vloeistoffen.

Protocol

1. Bibliotheek en Primer Design en Synthese

1. Het ontwerp van de eerste bibliotheek en primers (dit onderwerp is uitvoerig besproken in eerdere publicaties) ^25,26.
   1. Synthetiseren de volgende sequenties voor dit onderzoek met behulp van standaard fosforamidietchemie:
      Bibliotheek: GAATGGATCCACATCCATGG-N ₄₀ -TTCACTGCAGACTTGACGAAGCTTGACGAA
      Forward Primer: GGAATGGATCCACATCCATGG
      Reverse Primer: biotine-AAGCTTCGTCAAGTCTGCAGTGAA
   2. Ontwerp het cDNA capture probes complementair aan het 5'gebied van de bibliotheek. Kies de aanvankelijke lengte door analyse van online smelttemperatuur software een smelttemperatuur enigszins boven RT voorzien, met elke verdere base levert een verhoogde smelttemperatuur.
      mer Capture Probe: CCATTCC-biotine
      mer Capture Probe: TCCATTCC-biotine
      mer Capture Probe: ATCCATTCC-biotine
2. Zuiveren de bibliotheek van standaard HPLC. Ontzouten is vol-ciënt voor de primers en vangprobes. Reconstitueren oligonucleotiden nuclease vrij water in de gewenste concentratie en bewaar bij -20 ° C gedurende enkele maanden.

2. Buffer, Bibliotheek, en Monstervoorbereiding

1. Maak 500 ml buffer in Millipore of nuclease-vrij water kwaliteit met concentraties van 50 mM Tris, 137 mM NaCl, 5 mM _MgCl2, pH 7.4. Filter de buffer door een steriele 0,2 micrometer membraan; opslag kan bij omgevingsomstandigheden maanden.
   1. Alternatief gebruik van andere buffers, zoals PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing), HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur), etc.
2. Instellen van twee thermomixers; set een tot 95 ° C en de andere houden omgevingsomstandigheden (~ 20 ° C in dit werk). Bereid een ijsemmer.
3. Warmte / snap koel de DNA-bibliotheek door het plaatsen van 100 pi bibliotheek (~ 2,5 nmol 10 ¹⁵ -10 ¹⁶ sequenties) in de thermomixer set eent 95 ° C gedurende 5 min. Plaats de buis op het ijs, terwijl de magnetische korrels worden bereid (paragrafen 3.1-3.6). Bepaal de concentratie van de DNA-bibliotheek door UV absorptie bij λ = 260 nm en toepassen van geschikte omrekeningsfactor voor de bibliotheek.
4. Bereid de doelgroep voorraad oplossingen in een medium geschikt voor het doel oplosbaarheid.
   1. Bereid 100 mM analyt voorraden in DMSO. Deze voorraden zijn haalbaar voor ongeveer 1 maand wanneer ze worden bewaard bij omgevingsomstandigheden, maar verschillende doelen zullen verschillende degradatie profielen te tonen.

3. Voorbereiding van Magnetic Kralen en Eerste selectieronde

1. Vortex 6.7 x 10 ⁸ kralen / ml streptavidine gecoate magnetische kralen en verwijder 400 ul om een nieuwe microcentrifugebuis. Plaats de buis op de magneet gedurende 2 minuten en verwijder het supernatant.
2. Was de kralen door het toevoegen van 400 ul bindingsbuffer, vortexen en afzuigen de supernatant na het plaatsende buis van de magneet om de korrels te scheiden. Herhaal dit proces drie keer.
3. Immobiliseer de vangprobe op de magnetische korrels door resuspenderen de parels in 400 pl bindingsbuffer met 50 uM (eind) vangprobe en incubatie gedurende 10 minuten onder zacht schudden op de thermomixer bij omgevingsomstandigheden.
4. Was de kralen drie keer met 400 ul van bindende buffer door het herhalen van het wassen stappen in paragraaf 3.2 beschreven om gratis invangingsprobe verwijderen.
5. Resuspendeer de kralen in 400 ul bindingsbuffer. Verwijderen van 100 pl van de kraal oplossing voor de volgende stappen, en behouden de resterende 300 ul bij 4 ° C te gebruiken voor verdere selectieronden voor maximaal drie weken.
6. Was de kralen tweemaal met 200 ul bindingsbuffer zoals beschreven in paragraaf 3.2.
7. Voeg 100 ul van snap gekoelde DNA uit paragraaf 2.3 aan de gewassen kralen en incubeer gedurende 30 minuten onder zacht schudden met de thermomixer bij omgevingsomstandigheden.
   NOTE: De DNA-concentraties in de eerste ronde zijn hoger dan die van daaropvolgende ronden sequentie verlies in eerdere rondes waarin unieke sequenties theoretisch aanwezig minimaliseren.
8. Kwantificeren het DNA in het supernatant met UV absorptie in paragraaf 2.3 en trek deze uit het aanvankelijke In punt 3.7 om de hoeveelheid DNA gebonden aan de kralen te beoordelen.
   1. Was de kralen met 200 ul bindingsbuffer gevolgd door twee extra wasbehandelingen met 200 ul bindingsbuffer zacht schudden op een thermomixer gedurende 5 minuten bij omgevingsomstandigheden.
9. Resuspendeer de kralen in 200 ul van 100 uM doelwit verdund in bindingsbuffer en roteren de thermomixer gedurende 30 minuten bij omgevingsomstandigheden. Bereid de werkoplossingen vers aan het begin van elke dag voor selectie, omdat het doel en controle waargenomen te aggregeren waterige oplossing tijd. Bewaar de bovenstaande oplossing die het target geëlueerd sequentie bevats voor verdere studie.
10. Voer de negatieve selectie na de voltooiing van 1-2 rondes door toevoeging van 200 ui 1 uM progesteron tot de volgens paragraaf 3.8.1 kralen. Schud zachtjes gedurende 30 min op de thermomixer bij omgevingsomstandigheden.
11. Met de magnetische staan ​​om de kralen te vangen en gooi het supernatant, wassen van de parels tweemaal in 200 ul bindingsbuffer vóór cortisol toevoeging als in paragraaf 3.9.

4. Verrijking Monitoring, PCR, en enkelstrengs DNA Generation

1. Voeg de bovenstaande vloeistof om een ​​dialyse cassette selectie verrijking controleren. Dialyse is nodig om cortisol van het geëlueerde DNA verwijderen omdat cortisol aanwezig in veel hogere concentraties dan het DNA, en ook een UV absorptiepiek dat de standaard DNA UV λ _max = 260 nm overlapt.
   1. Voer deze stap om de andere ronde (ronde 2, 4, 6, en 8) in de eerste ronden van selectie. Dit vermindert monster loss als potentieel enkele kopie aantallen van elke sequentie aanwezig zijn (hoogste diversiteit). Voor snellere resultaten kunnen alternatieve werkwijzen zoals grootte-uitsluiting kolommen ook worden gebruikt.
2. Dialyseer cassette met monster in vers 250 ml bindingsbuffer 2 uur bij omgevingsomstandigheden tweemaal. Vervang buffer en incuberen bij 4 ° CO / N.
3. Analyseer het gedialyseerde pool door UV-spectroscopie met het percentage DNA geëlueerd door het doel bepaald (vergelijk de resultaten van paragraaf 3.8).
4. Bereid een 3% agarosegel met 1% w / v ethidiumbromide. In dit werk stelt een gel van 1,5 g agarose, 50 ml TAE buffer (40 mM Tris acetaat, 1 mM EDTA, pH = 8,0) en 10 pi ethidiumbromide.
5. Cycle-optimaliseren van de gedialyseerd zwembad door het uitvoeren van een kleinschalig PCR (5 x 50 pi porties) met behulp van ~ 5-15 cycli. Voor de PCR componenten gebruikt 1x PCR reactiebuffer (alle eindconcentraties), 200 uM dNTP, 10% reactievolume van DNA-matrijs, 500 nM van elke primer, en 2.5U polymerase (2,5 U / ul voorraad).
   1. Run PCR in geoptimaliseerde omstandigheden bij 95 ° C gedurende 2 min, gevolgd door herhaalde cycli van 95 ° C (30 sec), 55 ° C (30 sec), en 72 ° C (1 min), vervolgens een 72 ° C (10 min) laatste verlenging en houd bij 4 ° C.
   2. Gebruik een 25 bp standaard ladder voor vergelijking en visualiseren op een gel imager. Selecteer het aantal cycli dat de hoogste intensiteit band produceert in de juiste grootte marker zonder ongewenste bijproducten.
   3. Analyseer de resultaten van de cyclus optimalisatie door het combineren 10 pi van elke PCR cyclus met 2 pl 6x blauw / oranje ladingskleurstof en laden in 5 afzonderlijke putjes van de 3% agarose gel bereid in stap 4.4 (125 V gedurende 45 minuten).
6. Voer een grootschalig PCR gebruik te maken van de voorwaarden en de juiste cyclus nummer bepaald in punt 4.5. Typisch 6-8 ml PCR reacties moesten de 1-2,5 nmol voor elke ronde deze selectie verkrijgen. Gebruik 8-strip buizen te vereenvoudigenhet hanteren van de vele buizen nodig zijn om dit volume voor PCR-amplificatie aliquot.
7. Bereid een 3% agarosegel zoals beschreven in paragraaf 4.4, en valideren dat het PCR-product band verschijnt op de juiste plaats van de stappen van de paragrafen 4.5.2-4.5.3.
8. Zetten de gehele dubbelstrengs DNA product van paragraaf 4.7 tot enkelstrengs DNA door de onderstaande stappen:
   1. Voeg 300 ul van met streptavidine beklede parels (niet magnetische) een kleine kolom geblokkeerd door frits. Was de kralen met 5 ml bindingsbuffer Door een luerlockspuit en toepassen van lichte druk op de plunjer. Haal de spuit uit de kolom en verwijder de zuiger van de spuit off-line na de toevoeging van elk materiaal, zodat de kralen niet worden verstoord door zuiger aspiratie.
   2. Voeg het PCR product en deze door de kolom met zachte druk op de zuiger. Gebruik verschillende kolommen zodanig dat niet meer dan 1-1,2 ml PCR product toegevoegd aan elke kolom. Gooi de laatste flow door aangezien het DNA wordt op de kolom door het biotinedeel op de anti-sense streng worden bewaard.
   3. Was de kolom met 5 ml bindingsbuffer.
   4. Dehybridize het DNA door toevoeging van 0,5 ml 0,2 M NaOH. Bewaar het eluaat omdat het de enkelstrengs sense DNA bevat.
9. Ontzouten het ssDNA in 0,2 M NaOH door toevoeging van 0,5 ml van een ontzoutingskolom bereid door wassen met nuclease vrij water. Gooi de eerste 0,5 ml vloeistof en voeg daarna 1 ml nuclease gratis water en verzamelen deze ontzout ssDNA- monster. Het gebruik van meerdere ontzouten kolommen is vereist voor elke 0,5 ml portie.
   1. Bepaal de concentratie van DNA geëlueerd door UV absorptie bij λ = 260 nm.
   2. Vacuüm drogen monster en reconstitueren in een geschikt volume bindingsbuffer. Als er niet genoeg DNA verkregen voor de volgende ronde van de selectie, herhalen secties 4.6-4.9.2.

5. daaropvolgende ronden van selectie en Sequencing

1. Pas de striktheid van de selectie voorwaarden, afhankelijk van de resultaten van de verrijking toezicht (paragraaf 4.1). In het algemeen maken stringenter in opeenvolgende selectieronden om de hoogste affiniteit bindmiddel van het zwembad selecteren.
   Opmerking: Dit kan een combinatie van verhoging van de DNA-concentratie, waardoor het aantal, tijd of het volume van de wasstappen, verlagen de doelconcentratie betrekken verhogen van de concentratie van de negatieve selectie verbinding, of een verscheidenheid van andere methoden ^27.
   1. Brengt de juiste controles in voorkomend geval aan de specificiteit van de sequenties voor de doelgroep molecuul te waarborgen. In dit werk, toepassen van een negatieve selectie molecuul (progesteron) naar het systeem (tabel 1) begint in ronde 3 en toenemende concentratie gedurende de selectie. Beginnend in ronde 11, pre-incubeer het DNA-zwembad voor 30 minuten met 10-20 uM progesteron voorafgaand aan immobilisatie van de kralen (voor paragraaf 3.7).
   2. Verhoog de lengte van de invangingsprobe na maximale verrijking wordt waargenomen.
2. Bereid de uiteindelijke zwembad (ronde 15) en andere zwembaden die maximaal verrijkte (ronde 13) en minimaal verrijkt (ronde 6) de voorwaarden voor sequencing van PCR-amplificatie met compatibele primers en een high fidelity polymerase.
   1. Het opzetten van een 50 ul reactie volume met uiteindelijke concentraties van 1x (reactie buffer), 200 M (elk dNTP), 400 Nm (elke primer), 0,5 ul van DNA-pool, en 0,5 pl polymerase. Cycle optimaliseren voor elke ronde de stappen beschreven in paragraaf 4.5 onder toepassing van dezelfde PCR-omstandigheden met uitzondering van een 7 min greep bij 72 ° C voor de laatste verlenging.
   2. Stuur 50 ul van de voorbereide zwembaden om een ​​sequencing faciliteit in microcentrifugebuisjes met grondig verzegeld met niet-klevende wrap caps. Plaats de buizen in een 15 ml conische buis ingepakt met noppenfolie en schip O / N met ijs packs aan de sequencing faciliteit.
3. Bepaal het aantal kopieën van elke sequentie aan de verrijking van de opeenvolgende pool (s) te beoordelen.
   1. Gebruik code-schrijven / sorteren stappen (Zie Aanvullende code File) voor next-generation sequencing data in FASTA formaat naar de frequentie / kopie aantallen van elke sequentie herhaald in de gegevens voor alle zwembaden door de sequencing faciliteit geleverd te bepalen:
4. Analyseer de specificiteit en affiniteit van het hoogste aantal kopieën sequenties. De soort interactie (eiwit of klein molecuul), structurele eigenschappen van de aptamer na binding, en de verwachte affiniteit zal bepalen welke methode geschikt is. Dit onderwerp wordt besproken in verder detail in een aantal referenties ^1,28-30.

6. AuNP Synthese en detectie

1. Synthetiseren de AuNPs behulp van de citraat reductie methode ^21. Meng 98 ml Millipore water met 2 ml 50 mM HAuCl ₄ tot koken.
2. Voeg 10 ml van 38,8 mM natriumcitraat alsZodra reflux begint. Kleur verandert in een rode kleur na enkele minuten. Blijf roeren van de oplossing gedurende 20 min met warmte af.
3. Laat de AuNP oplossing afkoelen tot kamertemperatuur gevolgd door filtreren door een 0,2 urn polyester membraan. Bewaar alle AuNP schorsingen in een donkere amberkleurige fles.
4. Bereken de AuNP concentratie UV absorptie via de extinctiecoëfficiënt van 2,4 x 10 ⁸ L mol ^-1 cm ^{-1 31.} De concentratie was 10 nM in dit werk, met een grootte van 17 ± 0,6 nm bepaald door dynamische lichtverstrooiing ^21.
5. Incubeer het DNA met 10 nM AuNP gedurende 1 uur bij omgevingsomstandigheden beschermd aluminiumfolie. Vary het volume van AuNP voldoende oplossing om alle gewenste tests worden uitgevoerd verschaffen (~ 1-2 ml). Beladingsdichtheden van 73, 120, en 200 D / NP (DNA moleculen per AuNP) werden in dit werk onderzocht, en het volume en de concentratie zal dienovereenkomstig variëren.
6. Verdun het DNA / AuNP oplossing 1: 1 met HEPES buffer (20 mM HEPES, 2 mM _MgCl2, pH = 7,4). Laat het mengsel equilibreren bij kamertemperatuur onder aluminiumfolie.
   OPMERKING: De tijd die nodig is voor deze stap zal moeten worden geoptimaliseerd door de onderzoeker. In dit werk, tijd variërend van enkele minuten tot O / N onderzocht.
7. Bereid analyt (cortisol, cholzuur, 2-methoxynaftaleen) stock oplossingen bij 100 mM in DMSO en dek af met aluminiumfolie. Maak verse initiële oplossingen voorafgaand aan elk experiment door verdunning van de voorraad tot 100 micrometer op een 1/3 verdunning van de cortisol binding buffer (paragraaf 2.1). Verdun de eerste oplossing met de 1/3 bindingsbuffer zodat een constant volume (10 pl) van doelwit aan een reeks concentraties genereren.
8. Optimaliseren van de zoutconcentratie vereiste toevoeging 80 ul van de DNA / AuNP oplossing met 10 ui 03/01 bindingsbuffer (aangeduid als de "blanco").
   1. Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur en voeg verschillende hoeveelheden NaCl Solution. Kijk voor de hoeveelheid zout die een nauwelijks visueel merkbare verandering in de richting van een blauwe tint na zout toevoeging (13-40 ul van 1 M NaCl gebruikt in dit werk) induceert. Dit biedt een goed uitgangspunt, maar kan verder aangepast naar aanleiding van de resultaten inclusief doelwit aanvulling nodig.
9. Combineer 80 pi van het DNA / AuNP oplossing met 10 ul van de beoogde oplossing en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Gebruik maken van een 96-well plaat en meerkanaalspipet om meerdere doelconcentraties tegelijk te analyseren, die altijd een blanco (paragraaf 6.8).
   1. Voeg de juiste hoeveelheid NaCl-oplossing (13 pl 1 M NaCl werd gebruikt in dit werk) en direct analyseren de absorptie bij 650 en 530 nm met een plaatlezer.
10. De resultaten worden als de verhouding van de absorptie waarden (E ₆₅₀ / E ₅₃₀₎ versus doelconcentratie genormaliseerd ten opzichte van de blanco meting.

Results

De striktheid van de voorwaarden was aanvankelijk laag naar bindmiddelen aanwezig in lage kopie-aantallen in de eerste paar ronden behouden bleef. De eerste ronde name geïmplementeerd laagste stringentie bindmiddelen gewoonlijk gepresenteerd als unieke sequenties uit de hoge cortisol en DNA-concentraties, en het ontbreken van negatieve selectie stappen behouden. Het succes van deze aptameer selectie wordt aangetoond door de ontwikkeling van de pools een laag percentage geëlueerd door het doel (ronde 2) een hogere fractie geëlueerd door het doel dat relatief constante rondes 12-13 (tabel 1) blijft. Dit plateau van DNA geëlueerd door het doelwit is van oudsher een eindpunt in de selectie ("verrijking"). Deze werkwijze verder de stringentie van de selectie gedaan nadat verrijking door verhoging van de lengte van het cDNA vangprobe (figuur 1). Verlenging deze probe verhoogt de sterkte van de hybridisatie tussen de CDNA en het zwembad, waardoor de smelttemperatuur _(Tm) van het complex, en die een sterkere wisselwerking tussen doelwit sequentie en de bindende sequenties vrij in oplossing. De eerste selectieronde uitgevoerd zwakkere cDNA interactie door een minder G basis op het 5'- uiteinde van de bibliotheek. Dit is in overeenstemming met het algemeen lager stringente omstandigheden in de eerste ronde, en het is niet te verwachten dat de andere dan de selectie van grote invloed door meer potentiële bindmiddelen alsook achtergrond sequenties (dehybridize op basis van de thermodynamica) door te geven naar de volgende selectieronde. Deze achtergrond sequenties werden geminimaliseerd als de selectie verder in de richting van verrijking door de uitvoering van een hogere stringente omstandigheden in volgende selectierondes. Wanneer het cDNA werd verlengd van een 7-meer tot een 8-mer in ronde 14 wordt het percentage DNA geëlueerd door het doel verlaagd van 15,3% tot 11,1% voor een _Tm steeg van 19,2 ° C tot 26,7 ° C. De cDNA wverder verlengd tot 9-mer in ronde 15 met een _Tm van 31,3 ° C, daalt de totale geëlueerd tot 3,3%.

Nadere informatie over verrijking kan worden verkregen door sequencing verschillende zwembaden, zowel verrijkte en niet-verrijkte voorbeelden, teneinde de progressie van de pools in elke ronde sporen. Next generation sequencing (NGS) is ontstaan ​​als een krachtige methode voor het rangschikken van selectie, vooral omdat hogere sequentie leest (totaal aantal gerapporteerde sequenties) worden verkregen vergeleken Sanger sequentiebepaling. Deze hogere volgorde leest presenteren een grotere dekking van het totaal aantal sequenties in het zwembad, met een meer volledig beeld van de diversiteit van de sequenties. NGS verwijdert ook de vertekening klonen ³² en zorgt voor het rangschikken van meerdere pools in één partij met de toevoeging van streepjescodes ^24,33. NGS werd gebruikt om de progressie van verrijking analyseren van drie afzonderlijke pools in deze steekproef (figuur 2). Zwembadenvan rond 6 (lichte verrijking tegenover ronde 2 met% elueerde), rond 13 (hoogste verrijking) en ronde 15 (hoogste stringentie) werden gekozen als representatieve punten van de selectie. Het aantal kopieën van elke unieke sequentie werden uitgezet als een percentage van het totale aantal sequentie bed voor elke pool. De top gerangschikt (hoogste aantal kopieën) sequentie slechts vormden 0,1% van alle sequenties in ronde 6 (33.435 totaal sequenties, 22.463 unieke sequenties). Omdat het zwembad wordt maximaal verrijkt in ronde 13, de top gerangschikt sequentie toe tot 15,4% van het totale pool (17681 totaal sequenties, 2987 unieke sequenties), 150x hoger dan in ronde 6 omvatten ondanks slechts ~ 5x toename verrijking waargenomen met UV . Rond 15 (28919 totaal sequentie leest, 2980 unieke sequenties) gestegen tot 44,9% van sequenties door de enige top gerangschikt sequentie hoewel het UV verrijking controle aantoont dat de hoeveelheid geëlueerd door het doel was ~ 5x lager dan die van ronde 13 ( Tabel 1 ). Verrijking wordt ook aangetoond door het lagere percentage van unieke sequenties (67% in ronde 6 tot 10% in ronde 15) als het zwembad evolueert van vele verschillende sequenties met potentieel doelwit bindend. Daarnaast is de top gerangschikt sequentie in ronde 13 (15.3) was de derde hoogste kopieaantal sequentie in ronde 15 na het cDNA lengte uitgebreid, en de als tweede sequentie in ronde 13 werd de hoogste kopieaantal sequentie in ronde 15 (15 -1):

15-1 GGAATGGATCCACATCCATGGATGGGCAATGCGGGGTGGAGAATGGTTGCCGCACTTCGGCTT
CACTGCAGACTTGACGAAGCTT

15-3 GGAATGGATCCACATCCATGGGAGGGTTGGAAGGGAGGGGCCCGGGGTGGGCCATCGTTCGTT
CACTGCAGACTTGACGAAGCTT

Eerdere studies onderzochten de binding van deze twee sequenties door microschaal thermophoresis en evenwichtsdialyse ^24. De resultaten toonden significante cortisol bindend voor sequence 15-1 (K _d = 6,9 ± 2,8 uM door evenwichtsdialyse; 16.177; 0,6 uM door microschaal thermophoresis) terwijl minimale bindende waargenomen tussen cortisol en volgorde 15-3. Hieruit blijkt dat de toegenomen lengte van de vangprobe in ronde 15 geholpen bij het verstrekken hogere stringentie omstandigheden ontleden hogere affiniteit bindmiddel. Daarnaast noch sequentie toonde waarneembare binding aan de negatieve selectie molecule, progesteron, waaruit blijkt dat toevoeging van de negatieve selectiestappen was gunstig voor de procedure.

Het feit dat een grotere affiniteit bindmiddel gebleken volgende maximale verrijking (bepaald volgens de traditionele werkwijze voor het analyseren het percentage DNA geëlueerd door het doel) na verhoogde stringentie omstandigheden verdere ronden van selectie toegepast valideert de werkwijze uitstrekt over de lengte van de cDNA vangst sonde post-verrijking. Dit resultaat toont dat nummer op een sequentie zwembad en affiniteit voor het doelwit kan alleen worden gekoppeld onder bepaalde omstandigheden ^24,34, in concontrast met een voorafgaand verslag impliceert een directe correlatie ^35. Het benadrukt ook het voordeel van de controle verrijking door NGS, in plaats van uitsluitend door de% geëlueerd strategie gebruikelijk in de meeste selecties, die van nature kan variëren van de ene naar de volgende ronde als hogere stringente omstandigheden worden toegepast. Echter,% uitgewassen is nuttig voor het bewaken verrijking wanneer soortgelijke omstandigheden in verschillende rondes worden toegepast. Zo rondes 10/06 alle betrokken vergelijkbare omstandigheden zonder significante verandering in verrijking (tabel 1). Wanneer dit wordt gemeten over meerdere rondes, de omstandigheden zijn waarschijnlijk te streng om verrijking te bevorderen, en de onderzoeker moet striktheid afnemen in de volgende ronde. Zo werd de cortisol concentratie verhoogd van 35 uM tot 100 uM in rondes 11-13% en geëlueerd steeg van 2,5% in ronde 10-14,5% in ronde 12. Derhalve% geëlueerde kan dienen als leidraad voor het instellen van de strengheid in de loop van een selectie wanneer Similar omstandigheden worden vergeleken elke ronde, en kunnen aanvullende informatie NGS voor het bepalen van een keuze eindpunt.

Sequentie 15-1 werd aangebracht op een AuNP assay om te bepalen of een sequentie gekozen op een wijze produceren structuur switching aptameer zouden functioneren in een test die steunt op een structurele verandering na doelwit binden aan een respons. Vorige initiële studies toonden dat de AuNP assay met 15.1 reageerde op de stress biomarker cortisol, maar niet twee andere markers stress, epinefrine en norepinefrine, of cholinezuur, een marker van leverziekte structureel vergelijkbaar met cortisol ^24. De respons werd waargenomen in het normale bereik van vrij cortisol gerapporteerd in menselijk serum (~ 150-600 nM) ^6, valideren dat de voor een structurele verandering van cortisol bindende aptameer veroorzaakt een reactie in de AuNP assay. In dit huidige werk, werd de karakterisering van het systeem een ​​stap verder gebracht door het aanpassende dekking (dichtheid) van 15-1 op de AuNP oppervlak. Met behulp van dezelfde reeks voorwaarden, werd het DNA dekking verhoogd van 73 D / NP (DNA-moleculen / AuNP), tot 120 D / NP en 200 D / NP (figuur 3). Galzuur produceerde een minimale respons, met uitzondering van 10 uM bij 200 D / NP. De reactie van de test verminderd als de dekking is toegenomen evenals de detectielimiet (LOD). De LOD was 29,5 nM voor 73 D / NP, 145,2 nM voor 120 D / NP, en 27,3 uM voor 200 D / NP. Dit resultaat is het eens met het werk van Smith et al., Die geïllustreerd dat de respons van een AuNP test gebruik te maken van de cocaïne aptamer gedaald toen de aptamer dekking werd verhoogd van 60 D / NP tot 300 D / NP ^36. Dit impliceert dat het detectiebereik voor het doelwit van belang aangepast kan worden gebaseerd op het optimaliseren van het DNA dekking oppervlak in de AuNP assay. Dit kan nuttig zijn bij het vergelijken, bijvoorbeeld de reeks van vrij cortisol in humaan serum (~ 150-600 nM) versus humaan speeksel (~ 5-25 nM) ^{6,37. Terwijl de fysiologische vloeistoffen zijn veel complexer dan deze buffer test, de resultaten geven een uitbreiding op het werk proof-of-principle aantonen dat AuNP omstandigheden kan worden aangepast afhankelijk van de toepassing, en dat verdere werkzaamheden naar verbreding van het medium om biologische vloeistoffen zou zijn van belang de biosensor gemeenschap.}

Figuur 1. Overzicht van structuur switching selectiemethode. Een klein gebiotinyleerd cDNA vangprobe wordt geïmmobiliseerd op met streptavidine gecoate magnetische korrels. Het cDNA is complementair aan het 5'gebied van de bibliotheek, hybridiseren de bibliotheek aan de kralen. Als doel wordt toegevoegd, wordt een conformationele verandering geïnduceerd bindende sequenties bevrijden van de kraal, zodat afscherming vergemakkelijkt door een magneet. Het supernatant wordt vastgehouden aan verrijking monitor (% DNA geëlueerd door the doel) met UV na dialyse van het doel van het DNA. Deze stap is alleen nodig als de doelmolecule absorbeert in het UV-gebied hetzelfde als DNA. Sequenties worden vervolgens PCR versterkt en voorbereid voor de volgende ronde van selectie. Als de selectie vordert, wordt negatieve selectie toegepast, waarbij sequenties geëlueerd door de negatieve selectie molecuul worden weggegooid, en de kralen met potentieel doelwit bindmiddelen worden vervolgens geïncubeerd met een doelgroep. De lengte van de cDNA probe wordt verhoogd na maximaal verrijking (% elueerde) om de stringentie van selectie te verhogen. Dit cijfer is met toestemming overgenomen uit ^24. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Ronde	[Cortisol] (uM)	[Progesteron] (uM)	Gebonden DNA (pmol)	% Geëlueerd door Target	cDNA Lengte
1	100	0	357,57	N / A	7-mer
2	50	0	145,49	1.4	7-mer
3	50	1	188,74	N / A	7-mer
4	50	5	336,4	2.3	7-mer
5	35	5	88,05	N / A	7-mer
6	35	10	303,89	3.1	7-mer
7	35	10	255,01	N / A	7-mer
8	35	10	236,81	2.1	7-mer
9	35	10	318,95	2.6	7-mer
10	35	10	297,18	2.5	7-mer
11	100	10	147,61	N / A	7-mer
12	100	10	154,36	14.5	7-mer
13	100	10	150,39	15.3	7-mer
14	75	20	247,71	11.1	8-mer
15	50	40	409,63	3.3	9-mer

Tabel 1. Selectie progressie en verrijking door% elutie ²⁴ < strong>. N / A (niet van toepassing) wordt gerapporteerd voor rondes waar dialyse / UV verrijking controle niet werd uitgevoerd in vroege selectie rondes om het verlies van een klein aantal kopieën sequenties te beperken. Deze tabel is met toestemming overgenomen uit ^24.

Figuur 2. Selectie verrijking bepaald door next-generation sequencing (A) Ronde 6.; (B) Ronde 13; (C) Ronde 15. sequenties werden gerangschikt op basis van het aantal te kopiëren. Het hoogste kopienummer sequentie verhoogd van die een klein percentage van het totale sequentie zwembad in ronde 6 (0,1%) een hoog percentage in ronde 15 (44,9%) als het zwembad was verrijkt cortisol bindende sequenties. Dit cijfer is met toestemming overgenomen uit ^24.et = "_ blank"> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3. AuNP assay reactie van variërende aptameer 15-1 dekking. De dichtheid van de aptameer geïncubeerd met de AuNPs werd verhoogd van 73 D / NP (rode driehoek), 120 D / NP (groen vierkant) en 200 D / NP ( blauwe cirkel). Cortisol reacties zijn felle kleuren, cholzuur respons is in lichte kleuren. De test respons is verbeterd voor cortisol bij lagere dichtheden en verminderen de LOD en bereik het doel kan worden opgespoord binnen. De voorwaarden met de hoogste cortisol respons (73 D / NP) werden verder gekenmerkt in het lineaire bereik om meer punten te bieden binnen de verwachte normale bereik van vrije cortisol gemeld in humaan serum (~ 150-500 nm) en speeksel (5-25 nM ) ^6,37. De minimale respons van galzuur toepassing van dezelfde 73 D / NP omstandigheden heeft zijnen beschreven in eerdere werk ^24. Alle percelen vertegenwoordigen het gemiddelde ± SEM voor twee- of drievoud metingen.

. Figuur 4. Representatieve resultaten van de PCR-cyclus optimalisatie Van links naar de Wells vertegenwoordigen: 4 cycli, 6 cycli, 8 cycli, 10 cycli, 12 cycli, negatief (geen DNA-template), 25 bp DNA-ladder standaard. Optimale omstandigheden worden waargenomen bij 8 cycli, waar het enkel product band is bij een hoge intensiteit zonder overversterking producten aanwezig bij hogere cycli.

Figuur 5. AuNP assay incubatietijd optimaliseren. De incubatietijd van de AuNP / DNA stap 73 D / NP verminderd van O / N (figuur 3) en 30 min, en het doel INCUbation werd onmiddellijk gevolgd door zout toevoeging plaats na 20 minuten (figuur 3). (A) Een respons wordt waargenomen voor cortisol (blauwe diamant), maar niet voor galzuur (groene cirkels) of 2MNP (2-methoxynaftaleen, rode vierkanten). Alle percelen vertegenwoordigen het gemiddelde ± SEM voor twee- of drievoud metingen. (B) Van links naar rechts: blank, 10 uM cortisol, 10 uM cholzuur, 10 uM 2MNP. Visuele verandering kan worden waargenomen met het blote oog voor cortisol. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Discussion

Het feit dat kleine moleculen biologisch belangrijke, maar vormen slechts 19% van aptameren gerapporteerde maakt zijn ontworpen voor het selecteren van aptameren die voor kleine moleculen van grote betekenis zijn. SELEX van kleine moleculen is bijzonder uitdagend minder functionele groepen, structurele motieven, en de oppervlakte zijn beschikbaar voor interactie met sequenties vergeleken met proteïnen ¹ en er wordt geschat dat minder dan 30% van de selecties voor alle doelen pogingen hebben geleid tot een aptameer ^38. Daarom moet men bij wijze van uitzondering op de hoogte van de experimentele opzet en uitvoering om succesvol te selecteren een aptameer aan een klein molecuul doelwit zijn.

De aptameer selectiemethode in dit werk beschreven is voordelig omdat het voor kleine moleculen zonder enige chemische modificatie die hun bindende eigenschappen kunnen veranderen. Ook elutie gebaseerd, hetgeen betekent dat aangezien tHij DNA niet de doeltaal, aanvankelijk gebonden vervolgens geëlueerd uit de magnetische korrels van het doelwit DNA interactie met de kraal matrix niet worden geamplificeerd voor de volgende ronde van selectie omdat bindmiddelen aan het molecuul van belang vrijkomen in het supernatant buffer en niet-specifieke matrix bindmiddelen blijven gebonden. Omgekeerd wordt een negatieve selectiemethode tegen de matrix vereist voor methoden die het doelwit elke ronde immobiliseren op de vaste drager omdat DNA dat interageert met de matrix wordt versterkt naast de beoogde binders ^1. De huidige methode is ontworpen als een T _m beperkte selectie strategie. Dit betekent dat de _Tm van de cDNA / zwembad hybridisatie dicht bij KT gehouden. Morse gebruikt dezelfde strategie, maar paste een 6-mer cDNA probe met een _Tm <10 ° C met selectievoorwaarden bij 4 ° C ^17. Onze applicatie was een biosensoren assay uitgevoerd bij kamertemperatuur, zodat de lengte van het cDNA werd aangepastly. Dit houdt de stringentie van de selectie laag genoeg zodat potentiële binders niet verloren gaan omdat het doelwit bindende interactie optreedt in een afgelegen locatie met een conformationele verandering die het ontwrichten cDNA binding induceert. De afscherming doeltreffendheid van de voorgestelde werkwijze is laag omdat sommige sequenties dehybridize uitsluitend gebaseerd op thermodynamica. Daarentegen Nuţiu et al. Pasten een 15-meer cDNA en konden alleen aptameren identificeren twee van de vier doelen, mogelijk omdat de _Tm van het 15-meer is te hoog om een afgifte van een klein molecuul doelwit toestaan ^18. Daarom, terwijl de huidige selectie strategie zal vele ronden nodig om de achtergrond sequenties te verwijderen, door het beheersen van de striktheid van de selectie en het minimaliseren van het verlies van potentiële bindmiddelen de kans op succes zal worden verhoogd.

Veel onderzoekers nieuw voor aptamer selectie zijn zich niet bewust van de belangrijke aspecten die verband houden met de PCR vanpotentiële binders. Cycle optimalisering (sectie 4.5) is nodig omdat over-amplificatie van DNA-bibliotheken produceert ongewenste nevenproducten (gewoonlijk groter in omvang) met hoge cyclus nummers en het gewenste product kan verdwijnen met een overmaat van slechts 5 cycli ^39. Bij over-amplificatie, de PCR producten niet meer zijn die sequenties geëlueerd door het doel, en de kans van slagen selectie aanzienlijk verminderd. Figuur 4 illustreert een voorbeeld van cyclus optimalisatie van toer 5 in dit werk. De laagste cyclus produceert een minimale product band, de band toeneemt in hoeveelheid tot en met 8 cycli; 10 cycli van de band begint een overgang naar een hogere maat over-amplificatieproduct en wordt bijna geheel uit de overname geamplificeerde product binnen 12 cycli. Een ander detail dat veel onderzoekers onervaren in SELEX kan het hoofd zien is dat het hele zwembad moet worden versterkt in de grootschalige PCR-amplificatie (paragraaf 4.6) in de first ronde verlies bindmiddelen beperken. Het aantal unieke sequenties vanaf oligonucleotiden ^4N, waarbij 4 geeft de vier nucleïnezuur basen en N het aantal basen in het willekeurige gebied van de bibliotheek. Voor dit werk, N = 40, wat resulteert in een sequenties ruimte van 1,2 x 10 ²⁴ mogelijk unieke sequenties. De 2.5 nmol bibliotheek in de eerste selectieronde overeenkomt met ~ 10 ¹⁵ moleculen, wat betekent dat elk exemplaar van DNA waarschijnlijk is vertegenwoordigd in het oorspronkelijke pool als een unieke sequentie. Daarom moet de totale hoeveelheid DNA geëlueerd van de korrels door het doel worden versterkt tot een exemplaar van elk mogelijk bindmiddel behouden voor de volgende selectieronde. Zodra deze eerste versterking heeft plaatsgevonden, meerdere exemplaren zijn beschikbaar voor selectie in de volgende rondes waar een homogene oplossing wordt aangenomen voor de bemonstering.

De concentratie van de doelgroep moet ook zorgvuldig worden overwogen in elke ronde. Nuţiu et al. Gebruikda concentratie van 1 mM doel gedurende het selectieproces, en geselecteerde een ATP aptamer met K _d = 600 uM ^18. Zowel de huidige werkzaamheden en onderzoek Morse ¹⁷ begon met 100 uM doel, verlagen in de loop van de selectie, bleek aptameren met lage micromolaire affiniteiten. Precies welke ronde de striktheid moet worden verhoogd (lagere doel concentratie) hangt af van wanneer verrijking wordt waargenomen. Een andere belangrijke stap is voor een goede negatieve selectie stappen zijn dus aptameren tonen specificiteit voor het doelmolecuul. Welke controles worden gebruikt is afhankelijk van de beoogde toepassing van de geselecteerde aptamer. Zo aptameer 15-1 is ontworpen als een herkenningselement in een biosensoren assay voor cortisol, dus progesteron werd gebruikt als een negatieve selectie molecuul omdat het een metabolische voorloper van cortisol die in fysiologische vloeistoffen ^40. De ATP aptamer door Nuţiu et al geselecteerd. </ Em> omvatten geen negatieve selectie stap, en de wisselwerking met structureel vergelijkbare moleculen, waaronder ADP, AMP, adenosine, en dATP ^18.

Een laatste opmerking van overweging is dat de AuNP test vereist vaak aanzienlijke optimalisatie voor elke aptamer / doelwit paar. Op zoek naar de hoeveelheid zout die een nauwelijks visueel merkbare verandering in de richting van een blauwe tint na zout Daarnaast induceert is een goed uitgangspunt, maar aanpassing van het uitgangspunt zou kunnen worden verplicht om een ​​reactie te observeren. We hebben ook gevonden dat de assay produceert drastisch verschillende reacties afhankelijk van buffer concentratie (de keuze buffer kan verdund worden omdat de hoge zoutconcentratie buffers veroorzaakt vaak aggregatie) en samenstelling, mate van DNA dekking (figuur 3), monstervoorbereiding (sommige organische oplosmiddelen gebruikt om het doel te ontbinden kan een hoge achtergrond die maskers richten respons), de temperatuur, het type zout en concentratie, en incuba veroorzakentie tijd (van beide DNA met AuNP en DNA / AuNP met doel). Onder volledig geoptimaliseerde omstandigheden worden de resultaten meestal waargenomen met een doel incubatietijd <5 min, tonen het voordeel van een snelle reactie van het doelwit AuNP biosensoren platform. Bijvoorbeeld, in figuur 5 de incubatietijd van de aptameer / AuNP stap verlaagd van O / N (figuur 3) en 30 min, en het zout werd onmiddellijk toegevoegd (<10 sec) na toevoeging doel dan 20 minuten later (figuur 3 ) met een ladingsdichtheid van 73 D / NP. Dit verhoogde de cortisol respons op ~ 82% hoger dan de blanco (figuur 5A) en 10 uM doelconcentratie versus ~ 40% op de nieuwe condities (figuur 3). Deze reactie kan onderscheiden met het blote oog (figuur 5B) zijn. Merk op dat het lineaire bereik van cortisol detectie anders dan op de nieuwe condities, suggereert dat deze omstandigheden kunnen worden geoptimaliseerd voor een gewenstedetectiebereik. Galzuur en 2-methoxynaftaleen (2MNP) controles niet tot een significante reactie (Figuren 5A-B). Onderzoekers moeten zich ervan bewust dat het terugdringen van deze incubatie tijden verhoogde respons van analyten met de AuNP oppervlak, die kan bijdragen aan de algehele verbeterde signaal (doel) of achtergrond (non-target moleculen) kan vergemakkelijken. Daarom is zorgvuldige AuNP assay design en prestaties karakterisering is noodzakelijk voor elke aptamer / target paar.

Deze procedure beschrijft een protocol voor het selecteren van kleine molecule-structuur switching aptameren die functioneren in een biosensoren platform zoals beschreven AuNP assay, waarbij een conformationele verandering van het DNA vereisen om de aanwezigheid van doelwit. Echter kan deze methode worden toegepast op andere biosensor systemen zoals elektrochemische of fluorescentie die functioneren op dezelfde uitgangspunt voor vrijwel elke grootte doel. De kracht van het protocol verder experimenteel worden ontwikkeldverschillende benaderingen. Ten eerste kan de selectie zelf eventueel worden verbeterd door onderzoeksmethoden optimalisatie zoals het bepalen van de ideale _Tm van de cDNA / library hybridisatie die een interactie die zwak genoeg is om met een klein molecuul doelwit, maar sterk genoeg om de hoeveelheid te verminderen voorziet van achtergrond sequenties dehybridized uitsluitend uit de thermodynamica. Dit zal het aantal cycli dat nodig is voor de selectie condenseren, bespaart tijd in de arbeid en het verminderen van reagens consumptie. Verder onderzoek naar wijzigingen in de keuze zou zijn om de meest gunstige concentratie van kralen en DNA bepalen die een diverse populatie van sequenties wordt blootgesteld aan het doelwit, met name in de eerste ronde. Het succes van deze proof-of-principle experimenten bieden een basis om verder te investeren in de richting van het optimaliseren en aanpassen van de AuNP buffer test om fysiologische vloeistoffen. Er is een legitieme behoefte aan een snelle, robuuste biosensing platform dat kan functies als diagnostisch hulpmiddel van de fysiologische toestand van een individu, en verdere ontwikkeling van de AuNP assay in menselijk serum, zouden zweet of speeksel ontmoet deze huidige kloof.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dynabeads M280 Streptavidin	Invitrogen	112.06D	Compatibel met DynaMag-2 Magnet
DynaMag-2 Magnet	Invitrogen	12321D	Compatibel met Dynabeads M280 Streptavidin
Streptavidin Sepharose High Performance	GE Healthcare	17-5113-01	Dit is een hoogdensiteits streptavidin product voor ssDNA voorbereiding
Hydrocortison	Sigma	H4001	≥98%
Progesteron	Sigma	P0130	≥99%
Cholzuur	Sigma	C1129	≥98%
NanoDrop ND-1000	NanoDrop	ND-1000	Vervangen door ND-2000 model
Tris Base	Promega	H5135	≥99.9%
Natriumchloride	Sigma	S9888	≥99.5%
Magnesiumchloride Hexahydraat	Fluka	63068	≥98%
500 ml Filtersysteem	Corning	430769	0.22 µm cellulose acetaatmembraan
DNA Bibliotheek	Operon	Aangepast	HPLC gezuiverd
Alle andere DNA	IDT	Aangepast	Capture probes en primers — ontzilt; Aptamers — HPLC
Thermomixer	Eppendorf	R	Elk model met  temperatuur en mengsnelheidscontrole zal werken
PfuUltra II Fusion HotStart DNA Polymerase, 400 rxn	Agilent	600674	Taq polymerase kan ook worden gebruikt
Deoxynucleotide Mix, PCR-Grade	Agilent	200415	Andere merken zullen hier werken
10x Gekloond Pfu DNA Polymerase Buffer	Agilent	200532	Deze buffer werd geoptimaliseerd voor PfuUltra II polymerase
GeneAmp PCR Systeem	Applied Biosystems	9700	Elk model dat het mogelijk maakt om de deksel te openen voor cyclusoptimalisatie zal werken
Agarose-LE	Ambion	AM9040	≥99.9%
Ethidiumbromide	Sigma	E-1510	Acute toxiciteit, inademing; vermoedelijke carcinogeen
Lege Synthese Kolommen, 1 µm Expedite Style	Glen Research	20-0021-01	Dit model is ideaal vanwege de Luer-Lok fitting om te koppelen met spuit
Vervangende Filters Expedite	Glen Research	20-0021-0F	1 µm grootte
Illustra NAP-25 Kolommen	GE Healthcare	17-0852-01	Elk merk met DNA graad hars gel filtratie kolom zal werken
Slide-A-Lyzer Dialyse Cassette	ThermoFisher Scientific	66205	2k MWCO gebruikt
Gold(III) chloride hydraat	Sigma	254169	99.999% zuiverheid is belangrijk
Natriumcitraat Dihydraat	SAFC	W302600	We hebben gevonden dat de verbinding geproduceerd door verschillende fabrikanten AuNP assays sterk beïnvloedt
SpectraMax	Molecular Devices	M5	Resultaten waren vergelijkbaar met Bio-TEK systeem
Synergy	Bio-TEK	HT	Resultaten waren vergelijkbaar met Molecular Devices systeem
HEPES Buffer	Amresco	J848	Elk merk dat een gesteriliseerd product maakt, zal werken
250 ml Filtersysteem	Corning	430767	0.22 µm cellulose acetaatmembraan
UV Spectrophofotometer	Varian	Cary 300	Andere merken zullen hier werken
5 ml Spuit	Becton-Dickinson	309646	Dit model is ideaal vanwege de Luer-Lok fitting om te koppelen met Expedite kolom
ThermoEC Minicell Primo	ThermoFisher Scientific	EC320	Compatibel met voeding
Voeding	Fisher Scientific	FB300	Compatibel met ThermoEC Minicell Primo
Dimethyl Sulfoxide	Sigma	D8418	Ontvlambare vloeistof
2-Methoxynaphthaleen	Sigma	148245	99%
Assay Plate	Corning	3370	96-well Platte Bodem, Steriele