Analyse van autofagie in<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Door gebruikmaken van uithongering pads in combinatie met fluorescentiemicroscopie

Samenvatting

Een handige en krachtige methode voor het bestuderen van autofagie in Penicillium chrysogenum door het gebruik van hongerpaden (mengsels van agarose en leidingwater in een microscoopglas met een centrale holte) wordt hier gepresenteerd.

Samenvatting

De studie van cellulaire kwaliteitscontrolesystemen is uitgegroeid tot een zeer dynamisch en relevant veld van hedendaags onderzoek. Het is duidelijk geworden dat cellen over verschillende verdedigingslijnen beschikken tegen schade aan biologisch relevante moleculen zoals nucleïnezuren, lipiden en eiwitten. Naast orgaandynamica (fusie/fissie/beweeglijkheid/erfelijkheid) en nauwkeurig gecontroleerde protease-activiteit, heeft de afbraak van overtollige, beschadigde of aangetaste organellen door autofagie (cellulair ‘zelfetens’) veel aandacht gekregen van de wetenschappelijke gemeenschap. De regulatie van autofagie is behoorlijk complex en hangt af van genetische en omgevingsfactoren, waarvan er tot dusver vele niet zijn opgehelderd. Hier wordt een nieuwe methode gepresenteerd die het gemakkelijk bestuderen van autofagie in de filamenteuze schimmel Penicillium chrysogenum mogelijk maakt. Het is gebaseerd op de groei van de schimmel op zogenaamde ‘hongerpaden’ voor het op een reproduceerbare manier stimuleren van autofagie. monsters worden direct onderzocht door middel van microscopie en geëvalueerd op autofagie-inductie / voortgang. Het hier gepresenteerde protocol is niet beperkt tot gebruik met P. chrysogenum en kan gemakkelijk worden aangepast voor gebruik in andere filamenteuze schimmels.

Inleiding

Filamenteuze schimmels zijn uitstekend modelsysteem voor het bestuderen van ontwikkelingsprocessen. Ze bieden verschillende experimentele voordelen zoals goedkope teelt, de hoge aantallen van de nakomelingen en genetische toegankelijkheid. Het laatste punt is van bijzonder belang voor de bouw van transformanten die het mogelijk maken het onderzoek naar het belang van zo-ver uncharacterized genen voor verschillende cellulaire mechanismen. Schimmels zijn voor het ophelderen van verschillende elementen en mechanismen van cellulaire kwaliteitscontrole trajecten protease activiteit voor de afbraak van afwijkende eiwitten, mitochondriale dynamiek lid voor het handhaven mit....

Protocol

1. Bereiding van P. chrysogenum voor de Verhongering Experimenten

1. Als de P. chrysogenum stam van belang wordt van rijst (groene rijst ") gehouden, plaats 2-3 rijstkorrels bedekt met sporulerende mycelium in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Vul het met 500 ul YGG (10 g / l KCl, 20 g / l glucose, 10 g / l giststikstofbase, 5 g / l K ₂ HPO _4, 20 g / l gistextract).
   1. Vortex de buis gedurende 30 seconden zodat sporen efficiënt losmaken van de rijst.
   2. Incubeer de buis gedurende 1 dag bij kamertemperatuur (bijvoorbeeld tussen 20 en 25 ° C).
   3. Bereid een 1/50 verdunning van deze sporesuspensi....

Resultaten

Om het nut van de bovenstaande protocol peroxisoomafbraak beschreven in P. tonen chrysogenum stam Ws54-1255 (GFP-SKL) werd geanalyseerd. In deze stam GFP-SKL wordt meestal geïmporteerd in peroxisomen ^9. Dit resulteert in het verschijnen van meerdere bolvormen wanneer het monster wordt geanalyseerd door fluorescentiemicroscopie. Als autofagie optreedt, vacuolen vergroten. GFP-SKL wordt in vacuolen opgenomen door autofagie (pexophagy). Vanwege het feit dat GFP is tegen afbraak door proteasen v.......

Discussie

De hier gepresenteerde methode maakt het handig en reproduceerbare studie van autofagie in P. chrysogenum. Zo kan het worden gebruikt voor het screenen van de effectiviteit van verschillende verbindingen of zij kunnen moduleren de autophagy respons van deze schimmel of niet. De resultaten met rapamycine bewijzen dat remming van TOR signaal leidt tot een uitgesproken inductie van autofagie in P. chrysogenum die is ook aangetoond voor andere organismen ^11.

Het is m.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Microscope slides with central cavity	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	H884.1	Deze kunnen na reiniging meerdere keren worden gebruikt.
Glass beads	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	A553.1	Diameter: 0,25 - 0,50 mm