Methodenartikel

Probe-gebaseerde real-time PCR Benaderingen voor kwantitatieve meting van microRNAs

DOI:

10.3791/52586

⸱

14 april 2015

 ,  ,  ,  , 
1Diabetes and Islet Biology Group, NHMRC Clinical Trials Centre, Faculty of Medicine, The University of Sydney, 2Biomarkers Laboratory, NHMRC Clinical Trials Centre, Faculty of Medicine, The University of Sydney

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Circulerende microRNAs zijn onlangs naar voren gekomen als veelbelovend en nieuwe biomarkers voor verschillende vormen van kanker en andere ziekten. Het doel van dit artikel is om drie verschillende probes gebaseerde real-time PCR-platforms en methoden die beschikbaar zijn om te kwantificeren en te bepalen de overvloed aan circulerende microRNAs zijn te bespreken.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Probe-gebaseerde kwantitatieve PCR (qPCR) een voorkeur werkwijze voor het meten transcript overvloed, omdat het een van de meest gevoelige detectiemethoden een nauwkeurige en reproduceerbare analyse levert. Probe-gebaseerde chemie biedt de minst achtergrond fluorescentie in vergelijking met andere (dye-based) chemie. Momenteel zijn er verschillende platforms die gebruik probe gebaseerde chemie transcript overvloed kwantificeren. qPCR in een plaat met 96 putjes is de meest gewoonlijk gebruikte methode is echter slechts maximaal 96 monsters of miRNAs kunnen worden getest in een enkele run. Dit is tijdrovend en vervelend als een groot aantal monsters / miRNAs worden geanalyseerd. High-throughput-probe gebaseerde platforms zoals microfluidics (bijv TaqMan Array Card) en nanofluidics arrays (bijv OpenArray) bieden hun gemak reproduceerbaar en efficiënt op te sporen de overvloed van meerdere microRNAs in een groot aantal monsters in een korte tijd. Hier tonen we de experimentele opstelling eennd protocol voor miRNA kwantificering van serum of plasma-EDTA monsters met probes gebaseerde chemie en drie verschillende platforms (96 putjes, microfluïdische en nanofluidics arrays) met toenemende doorvoer.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MicroRNAs (miRNAs) zijn ~ 22 nucleotide niet-coderende (nc) RNA's, functioneren als regulatoren van genexpressie 1-3. De meeste miRNAs bij dieren verricht door sequentiespecifieke baseparing met een mRNA, gericht op de 3'-UTR, hetgeen leidt tot negatieve regulatie van genexpressie 2-4. Dit gebeurt meestal via remming van mRNA translatie of door ribosomale drop-off. miRNAs in omloop is aangetoond om nieuwe biomarkers in onderzoek en klinische velden voor diverse ziekten zoals diabetes 5-7, ovariale 8, 9, prostaat- en borstkanker 10,11, hepatitis B-12 en andere auto-immuunziekten 13. Onderzoek is uitgevoerd overvloedige miRNAs identificeren in verschillende cellen of weefsels, en in omloop uit menselijk plasma en serum, die gemakkelijker en met minder invasieve 9,11-15.

Verschillende methoden van miRNA kwantificering hebben e geweestIngesteld met behulp van meerdere platforms, zoals de standaard 96-well plaat platform 4,12,16-18, de microfluidics kaart platform 12,18-23 en de nanofluidics testplatform 17,24. Kwantitatieve real time PCR (qPCR) biedt de mogelijkheid om relatieve of absolute aantal transcripten te meten met behulp van meerdere (dye of probes gebaseerde) chemie. Probe-based real-time PCR chemie biedt het voordeel van lage achtergrond fluorescentie en hoge gevoeligheid voor een enkel transcript kopie detecteert. Het is relatief kosteneffectief, eenvoudig te gebruiken en zeer reproduceerbaar, waardoor het een favoriete methode voor het kwantificeren en het bepalen van miRNA expressie 25. Probe-based qPCR methode houdt in het algemeen in twee stappen: reverse transcriptie (RT) en qPCR 4,26,27. RT is waar de stamlus RT-primer wordt gehybridiseerd met een rijpe of primaire miRNA molecuul en omgezet in complementaire (c) DNA. Kwantificering van het cDNA wordt vervolgens uitgevoerd met miRNA-specifieke PCR primers26-28. Het principe van probe-gebaseerde qPCR is gebaseerd op de detectie van complementaire streng verlenging in real time, waarbij hydrolyse van de fluorescent gemerkte probe omvat. Deze probes zijn ontworpen om een ​​fluorescente reporter en een quencher die net elkaar om FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) kunnen worden onderzocht. Detectie van de emissie van de fluorescentie rapporteur (zender) wordt gemaskeerd door de nabijheid van de quencher molecule. Wanneer Taq polymerase (pol) zich vanaf de stroomopwaartse primer en een vork (einde van de sonde de 5 ') bereikt, het Taq pol exonuclease activiteit hydrolyseert de sonde, waardoor de fysische dissociatie / scheiding van de fluorescente emitter van de quencher. Deze release van een enkel molecuul van fluorescentie zender wordt opgenomen door de detector en gepresenteerd als een incrementele toename van de fluorescentie signaal van die goed / reactie. De toename in fluorescentie is evenredig met de hoeveelheid PCR product gegenereerd, waardoor een nauwkeurige quantification van de geamplificeerde doel 26,28.

Met de toenemende vraag in miRNA kwantificering zijn gemiddelde tot hoge doorvoer technologieën ontwikkeld om een ​​groter aantal monsters in een korte tijd te verwerken. TaqMan Low Density Array (TLDA) is een middelgrote doorvoer innovatief microfluïdische ontwerp op probes gebaseerde qPCR chemie met een toename van het aantal miRNAs op een plaat geanalyseerd. TLDA omvatten het gebruik van een vooraf bepaalde pool van RT-primers die worden gebruikt voor het synthetiseren van het cDNA. Deze cDNA's worden vervolgens gesponnen tot een aangepaste 384 goed micro-fluïde kaart om de expressie van meerdere miRNAs gebruik qPCR 22,26,29 bepalen. Elk putje van de kaart bevat gedroogde primers en probes specifieke miRNA (s) versterken, dus tot 384 reacties kunnen in één TLDA kaart 26 verwerkt.

De nanofluidics array is een high-throughput platform dat wordt gebruikt voor detectie van gen transcripten 24 gebruikmaking van dezelfde probes gebaseerde chemie. Het maakt gebruik van een eigen matrix met hydrofobe-hydrofiele interacties eenvoudig laden van de 33 nanoliter reactiemengsel in een array van 3072 doorgaande gaten op een roestvrij stalen glijbaan 24 te vergemakkelijken. Dit artikel richt zich op het aantonen hoe deze werkwijzen voor het kwantificeren van miRNAs in serum / plasma wordt uitgevoerd en de kritische factoren die moeten worden overwogen bij het uitvoeren en interpretatie van dergelijke gegevens. Genomen om rekening te houden, zullen hun individuele voordelen en beperkingen in dit artikel worden besproken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Totaal RNA kan worden geïsoleerd uit serum met behulp van een in ons laboratorium 30 of met andere commercieel verkrijgbare kits vastgesteld protocol.

OPMERKING: Aanvullende interactief spreadsheets voor de reactie volumes berekenen in elk experiment (met 5% overmaat volume verwerkt pipetteren inbegrepen) zijn voorzien.

1.-Probe gebaseerde real-time qPCR behulp van een standaard 96-well plaat Platform

  1. cDNA synthese (reverse transcriptie) op het serum / plasma RNA monsters voor miRNA
    1. Bereken en neem 10 ng van RNA voor elk cDNA-synthese reactie. Voeg nuclease-vrij water tot het eindvolume van 10 ng RNA 1,67 gl meenemen (5 pi reactie). Houd monsters op ijs.
    2. Selecteer de miRNA en ontdooien hun RT primers.
    3. Ontdooi de RT reagens mengsel componenten: RT Buffer (10X), dNTPs (100 mM), RNase Inhibitor (20 U / ul). Bewaar nooit plaats enzym (recombinant Moloney murine leukemie virus(RMoMuLV)) (recombinanat Moloney murine leukemie virus (rMoMuLV) reverse transcriptase (50 U / ul) op ijs. Bewaar het bij -20 ° C totdat het nodig is of in een vriezer blok.
    4. Bereid RT reagens in ijs zoals beschreven in Tabel 1A. Het wordt aanbevolen om ten minste 5% overmaat volume op basis pipetteerfout bereiden.
    5. Voeg 2,33 ul van de RT reagens mix elk in een 0,2 ml PCR-buis / plaat.
    6. Vortex de RT-primer buizen te mengen, dan centrifuge kort bij 10.000 xg gedurende 10 sec. Voeg 1 ul van het miRNA specifieke RT-primer hun respectievelijke PCR-buizen of platen. Voeg 1,67 ul van de verdunde RNA hun respectievelijke PCR buisjes of putjes in de plaat. Voer alle toevoegingen op het ijs.
    7. Centrifugeer de reactiebuis of plaat bij 1950 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
    8. Stel de miRNA cDNA-synthese-programma van de thermische cycler met de volgende afstelling: 16 ° C gedurende 30 min, 42 ° C gedurende 30 min, 85 °C gedurende 5 min en 4 ° C on hold.
    9. Stel reactievolume 10 pl. Laad de reactie buizen of plaat in PCR-apparaat. Start de RT run. Sla de cDNA (RT) reactie bij -20 ° C, als real time PCR-amplificatie niet onmiddellijk overgegaan.
  2. Probe-gebaseerde real-time qPCR voor de detectie van volwassen miRNAs
    1. Ontdooi de geselecteerde probes gebaseerde qPCR assays (20X) voor het betreffende RT product.
    2. Meng de correctheid enige oplossing van real-time PCR (qPCR reagens mix) van wervelende de fles.
    3. Bereid de qPCR reagens mix voor elke miRNA te analyseren. Ter voorbereiding van de qPCR verkrijgen van een steriele 1,5 ml microcentrifugebuis per miRNA monster en de componenten toe te voegen in elke buis zoals beschreven in Tabel 1B. Het wordt aanbevolen om ten minste 5% overmaat volume op basis pipetteerfout bereiden.
    4. Voeg 4.2 ul van de respectievelijke qPCR reagens mengsel aan elk putje van een optische plaat met 96 putjes (of buizen). Voeg 0,8 ulvan de respectieve cDNA reactie (gesynthetiseerd in stap 1.1 per miRNAs) naar desbetreffende holte.
    5. Verzegeling van de plaat met de juiste optische kap. Centrifugeer de plaat (of buizen) op 1950 g gedurende 5 min bij 4 ° C
    6. Zet de computer aan, 96-well plaat / microfluidics scala lezer en tenslotte de software te starten. Zorg ervoor dat de machines goed zijn aangesloten en correct blok en verwarmde deksel (voor snelle 96 well plaat) op hun plaats.
    7. Kies een experiment als 96-well snel blok (0,1 ml), standaard curve, TaqMan reagentia en snelle modus. Stel qPCR de Real Time PCR met behulp van de volgende programma cycling condities: 95 ° C gedurende 20 seconden, 50 cycli (95 ° C gedurende 1 sec, 60 ° C gedurende 30 sec).
    8. Stel reactievolume 10 pl. Laad de reactie buis of plaat in het instrument. Druk op "Start run". Het programma duurt ongeveer 1 uur in beslag nemen.

2.-Probe gebaseerd Microfluidics Array Card (Card A en B)

OPMERKING: Probe-based miRNA panel wordt geleverd als een set van twee 384-wells microfluïdische kaarten (Array-kaart A en Array kaart B). Elke kaart bevat gedroogde primers en probes voor maximaal 380 miRNAs en controles. cDNA product (met of zonder pre-amplificatie) specifiek kaart A of kaart B op de respectieve array voor real time PCR geladen.

  1. Reverse transcriptie (RT)
    1. Gebruik dit protocol voor een totaal RNA ingang van 1-1,000 ng. Als de ingang is tussen 1-350 ng, het uitvoeren van een pre-amplificatie (pre-amp) stap. Voor ingangen boven 350 ng, laden cDNA direct op de array kaarten zonder pre-amp.
      LET OP: Voor serum miRNA profilering, te beginnen met 100 ng van totaal RNA. Voor een complete miRNA profiel, lopen twee vooraf gedefinieerde pools van RT-primer sets van RT reacties (Poule A en Poule B) per monster.
    2. Ontdooi de volgende reagentia op ijs. RT Primers (10x): Poule A en Poule B, dNTPs met dTTP (100 mM), RT Buffer (10x), MgCl2 (25 mM), RNase Inhibitor (20 U / &# 181; l). Laat het enzym (recombinant Moloney murine leukemie virus (rMoMuLV)) reverse transcriptase (50 U / ul) op ijs niet te houden. Bewaar het bij -20 ° C totdat het nodig is.
    3. Voorzichtig vortex alle reagentia, behalve het enzym en vervolgens kort centrifugeer de buizen bij 10.000 xg gedurende 10 sec.
    4. Combineer reagentia, zoals beschreven in Tabel 2A, in twee buizen; één buis voor Pool A, de andere voor Poule B. Elke buis zal slechts een vooraf gedefinieerde pool van RT primer set bevatten, hetzij van Pool A of uit Poule B. Het wordt aanbevolen om ten minste 5% te bereiden overtollig volume te compenseren voor pipetteerfout .
    5. Omkeren om te mengen, en dan centrifuge kort bij 10.000 xg gedurende 10 sec. Aliquot 100 ng van elk RNA monster in een nieuwe buis, voeg vervolgens een geschikt volume van nuclease-vrij water tot een totaal van 3 pi maken.
    6. Portie 4,5 ul van de juiste RT reagens mix in respectievelijke buizen. Omkeren om te mengen, en vervolgens kort centrifugeren bij 10.000 xg gedurende 10 sec. Incubeer op ijsgedurende 5 min.
    7. Leg monsters in een thermocycler en start de RT onder de volgende omstandigheden: 40 cycli (16 ° C gedurende 2 min, 42 ° C gedurende 1 min, 50 ° C gedurende 1 sec), 85 ° C gedurende 5 min, bij 4 ° C. WINKEL cDNA gegenereerd door deze vooraf gedefinieerde pool van RT-primers bij -15 tot -25 ° C of onmiddellijk gebruikt.
  2. Pre-amplificatie
    1. Ontdooi de vooraf gedefinieerde pool van pre-amp primers op ijs. Zachtjes vortex primers, en vervolgens kort hen centrifuge bij 10.000 xg gedurende 10 sec. Werveling TaqMan PreAmp reagens mix (2X) door zachtjes te tikken, om te mengen.
    2. Combineer reagentia, zoals beschreven in Tabel 2B, in twee buizen; één buis voor Pool A, de andere voor Poule B.
      Opmerking: Zoals hierboven beschreven zal Pool voorversterker primers naar buis A en Pool B primers naar buis B. Het verdient aanbeveling om ten minste 5% overmaat volume op basis pipetteerfout bereiden.
    3. Omkeren om te mengen, en vervolgens kort centrifugeren bij 10.000 xg gedurende 10 sec.Portie 22,5 ul van de juiste PreAmp reagens mix in nieuwe buizen. Aliquot 2.5 pi van de cDNA monster (bereid in de RT-stap) in de betreffende buis.
    4. Omkeren om te mengen, en vervolgens kort centrifugeren bij 10.000 xg gedurende 10 sec. Incubeer op ijs gedurende 5 minuten. Leg monsters in een thermocycler en start de voorversterker cyclus. Fietsen omstandigheden: 95 ° C gedurende 10 min, 55 ° C gedurende 2 min, 72 ° C gedurende 2 minuten, 12 cycli (95 ° C gedurende 15 sec, 60 ° C gedurende 4 min) 99,9 ° C gedurende 10 min, bij 4 ° C.
    5. Omkeren voorversterkt cDNA te mengen, en vervolgens kort centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 10 sec. Voeg 75 ul van 0,1 x TE buffer (pH 8,0) pre-geamplificeerde cDNA (1: 4 verdunning). Omkeren verdunde pre-amp monsters te mengen, en vervolgens kort centrifugeren bij 10.000 xg gedurende 10 sec. WINKEL verdunde pre-geamplificeerde cDNA bij -15 tot -25 ° C gedurende maximaal een week, of onmiddellijk gebruikt.
  3. Laden microfluidics kaarten en het uitvoeren van qPCR
    1. Houd de microfluidicsmiRNA-kaarten buiten voor ten minste een half uur op kamertemperatuur komen. Dooi verdunde voorversterkt cDNA op ijs en meng door de buizen, gevolgd door korte draai. Meng qPCR reagens mix door werveling van de fles.
    2. In de nieuwe buis voeg 450 ul van qPCR reagens mix tot 9 ul verdund voorversterkt cDNA. Voor kaart A, gebruiken voorversterkt product bereid met primer Poule A. Voeg 441 ul van nuclease gratis water te maken van het uiteindelijke volume tot 900 ul. Keer de buis te mengen, en vervolgens kort centrifugeren bij 10.000 xg gedurende 10 sec.
    3. Verwijder de TLDA kaart uit de verpakking (als het eenmaal op kamertemperatuur zijn gekomen) en plaats deze op een schone omgeving met folie naar beneden. Voeg 100 ul PCR reactiemengsel in elk van de 8 vulpoorten op de kaart. Er zijn 2 poorten op elk van de reservoir (8 reservoirs in totaal op elke kaart).
      OPMERKING: De vulopening is het grotere gat waar het reactiemengsel wordt toegevoegd, terwijl de ontluchting poort is het kleinere gat. Elke miRNA TLDA kaart heeft 8 reservoirs, die elk leiden tot 48 putjes (24 wells in een kolom x 2 kolommen), waardoor loading alle 384 putten in de kaart met dezelfde PCR-mix. Zorg ervoor dat Pool A en Poule B van elk monster worden op respectieve TLDA kaarten geladen. Plaats de array-kaart in de gespecialiseerde microfluidics scala kaarthouder emmers in de centrifuge.
    4. Voor de microfluidics reeks kaarten, gebruik een geschikte centrifuge (zoals Heraeus Multifuge 3SR, 230V centrifuge) en specifieke emmers (zoals "TaqMan Array Card" houders). Elke emmer kan maximaal 3 kaarten (geladen / leeg). Zorg er altijd voor dat alle 3 slots van een emmer bezet zijn en de emmer wordt in evenwicht gehouden door het plaatsen van vergelijkbare emmer (deze bak moet ook 3 kaarten, leeg of vol bevatten) in de tegenovergestelde sleuf van de centrifuge. Terwijl het plaatsen van de kaart in de emmer houder, zorg ervoor dat de 8 reservoirs projecteren naar boven en reactieputjes geconfronteerd met de buitenwand van centrifuge.
      1. Spin kaarten bij 331 xg gedurende 1 min bij kamertemperatuur. Naeerste spin, opent u de centrifuge en visueel zorgen de reactie mix is ​​afgegeven door de 384 putten. Herhaal de spin in dezelfde instellingen voor nog 1 keer. Neem de kaart uit emmer en zorgen dat het niveau van reactiemengsel in elk van de reservoirs 8 is uniform. Inconsistenties in de vloeistofvolumes links in de reservoirs maakt de kaart ongeschikt verdere gebruik.
    5. Microfluidics serie kaarten hebben een speciale sealer die een precisie naald samenstel (slede) aan het fluïdum distributiekanalen van de array verzegelen en even het reactiemengsel verspreiden in alle putjes (totaal reactievolume 1 pl / putje) heeft.
    6. Breng de wagen naar de beginpositie en steek de geladen kaart in de sealer met folie naar boven en in de rij om de stylus pennen op de sealer. In een langzame, regelmatige en uniforme beroerte, duw de wagen over de kaart tot het eindpunt van de sealer bereikt. Verwijder de verzegelde scala kaart en vervolgens sneed de reservoirs van de kaart met behulp van een schaar.
    7. Zorg ervoor dat de juiste blok, verwarmde deksel en monster drager is geïnstalleerd in de microfluidics reeks real-time PCR-systeem / machine.
    8. Zet de computer aan, dan is de microfluidics-array systeem en ten slotte de software te starten. Zorg ervoor dat de machines goed zijn aangesloten. Kies een experiment arrays kaart, standaard curve, TaqMan reagentia en de normale modus. Importeer de installatiebestanden voor een van de kaart A en kaart B. Sla het bestand op.
    9. Plaats de verzegelde kaart in de lade instrument met goed A1 in de linker bovenhoek en barcode naar de voorkant van het instrument. Druk op "Start Uitvoeren". Het programma duurt ongeveer 2 uur in beslag nemen.

3. Probe-based Nanofluidics Human miRNA Panel

  1. Reverse transcriptie (RT)
    1. Gebruik dit protocol voor een totaal RNA ingang van 50-200 ng echter 100 ng is optimaal voor de meeste monsters. Voor een complete miRNA profiel, lopen twee vooraf gespecificeerdened zwembaden van RT-primer sets van RT reacties (Poule A en Poule B) per monster.
    2. Ontdooi de reagentia op ijs: voorgedefinieerde pool van RT-primer sets (10X), dNTPs met dTTP (100 mM), RT Buffer (10x), MgCl2 (25 mM), RNase Inhibitor (20 U / ul). Mis enzym (recombinant Moloney murine leukemie virus (rMoMuLV) reverse transcriptase (50 U / ul) niet op ijs bewaren. Bewaar het bij -20 ° C tot gebruik. Voorzichtig vortex alle reagentia, behalve het enzym en kort centrifugeer ze bij 10.000 xg gedurende 10 sec.
    3. Combineer reagentia, zoals beschreven in Tabel 3A, in twee buizen; één buis voor Pool A, de andere voor Poule B. Elke buis zal slechts een vooraf gedefinieerde pool van RT-primer set bevatten, hetzij van Pool A of uit Poule B. Het wordt aanbevolen om ten minste 5% meer dan het volume te compenseren voor pipetteren bereiden error.
    4. Pipet te mengen en vervolgens centrifuge kort bij 10.000 xg gedurende 10 sec. Portie 100 ng van elk RNA-monster in een nieuwe buis, voeg dan een geschikt volumevan nuclease-vrij water tot een totaal van 3 pi maken. Portie 4,5 ul van de juiste RT reagens mix in de betreffende buis.
    5. Omkeren om te mengen, en vervolgens kort centrifugeren bij 10.000 xg gedurende 10 sec. Incubeer op ijs gedurende 5 minuten. Leg monsters in een thermocycler en start de RT-programma. Fietsen condities: 40 cycli (16 ° C gedurende 2 min, 42 ° C gedurende 1 min, 50 ° C gedurende 1 sec), 85 ° C gedurende 5 min, bij 4 ° C. WINKEL cDNA gegenereerd met deze vooraf gedefinieerde pool van RT-primerset bij -15 tot -25 ° C of onmiddellijk gebruik.
  2. Pre-amplificatie (pre-amp)
    1. Ontdooi de vooraf gedefinieerde pool van pre-amp primer ingesteld op ijs. Voorzichtig vortex primers, vervolgens kort te centrifugeren bij 10.000 xg gedurende 10 sec. Werveling TaqMan PreAmp reagens mix (2X) te mengen.
    2. Combineer reagentia, zoals beschreven in tabel 3B, in twee buizen; één buis voor Pool A, de andere voor Poule B. Elke buis zal slechts een vooraf gedefinieerde pool van RT-primer sets bevatten, ofwel frOM Pool A of uit Poule B. Het wordt aanbevolen om ten minste 5% meer dan het volume te compenseren voor het pipetteren fout te bereiden.
    3. Pipet te mengen, en vervolgens kort centrifugeren ze bij 10.000 xg gedurende 10 sec. Portie 22,5 ul van de juiste PreAmp reagens mix in nieuwe buizen. Aliquot 2.5 pi van de cDNA monster in de desbetreffende buis. Omkeren om te mengen, en vervolgens kort centrifugeren de buizen bij 10.000 xg gedurende 10 sec. Incubeer op ijs gedurende 5 minuten.
    4. Leg monsters in een thermocycler en uitvoeren van de pre-amp. Stel reactievolume 25 pl. Fietsen omstandigheden: 95 ° C gedurende 10 min, 55 ° C gedurende 2 min, 72 ° C gedurende 2 minuten, 12 cycli (95 ° C gedurende 15 sec, 60 ° C gedurende 4 min) 99,9 ° C gedurende 10 min, bij 4 ° C.
    5. Omkeren voorversterkt cDNA te mengen, en vervolgens kort centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 10 sec. In nieuwe buizen voeg 4 pi voorversterkte cDNA 156 ui 0,1 x TE-buffer pH 8,0 (1:40 verdunning). Omkeren verdunde pre-amp monsters te mengen, en vervolgens kort centrifuge bij 10.000 xg gedurende 10 sec. WINKEL verdunde en onverdunde pre-geamplificeerde cDNA bij -15 tot -25 ° C gedurende maximaal een week, of onmiddellijk gebruikt.
  3. Laden Nanofluidics Arrays en uitvoeren van qPCR
    1. Download de desbetreffende plaat bestand (.tpf) van de website 31 met behulp van de nanofluidics reeks dia serienummer. Dit bevat de run informatie voor de specifieke nanofluidics reeks dia.
    2. Dooi verdunde voorversterkt cDNA en TaqMan Real-Time qPCR reagens mix (als u voor de eerste keer) op ijs. Meng qPCR reagens mix door werveling van de fles. In nieuwe buizen voeg 22,5 ul van qPCR reagens mengsel 22,5 gl verdunde pre-geamplificeerde cDNA. Voorzichtig vortex te mengen, en vervolgens kort centrifugeren bij 10.000 xg gedurende 10 sec.
    3. Aliquot 5 pi van elk monster in 8 putten (2 kolommen, 4 rijen) van de nanofluidics reeks workflow 384-wells monster plaat. Zorg ervoor dat Pool A en Poule B van elk monster zijn in aangrenzende 8-goed blokken (zie Figure 1 of Aanvullend excel sheet voor de lay-out).
      1. Elk monster plaat kan maximaal acht dia's ter waarde van monsters bevatten. Echter, kan het systeem voor nanofluidics scala alleen verwerken 4 nanofluidics arrays in één run. Als er meer dan vier dia's ter waarde van monsters op één monster plaat te worden geladen, zorg er dan voor de overige secties worden afgedicht. Seal met OpenArray monster plaatafdichter.
        OPMERKING: Het is raadzaam om vooraf te snijden de sealer in de gewenste secties, zodat de delen kunnen worden afgedicht / individueel ontsloten om verdamping te verminderen. Alternatief kan de plaat afgesloten met een intact sealer en vervolgens secties kan afzonderlijk worden uitgesneden bij het laden.
    4. Centrifugeer plaat bij 490 xg gedurende 1 min bij 4 ° C. Laad de nanofluidics reeks dia's binnen 1 uur. Vanwege de beperkte tijd toegestaan ​​om de dia's te dichten, dan kunt u alleen laadt één dia per keer. Verwijder de nanofluidics reeks dia uit de vriezer en laat het tot kamertemperatuur te komenerature (~ 15 min).
    5. Zorg ervoor dat de juiste blok, verwarmde deksel en monster drager is geïnstalleerd in de nanofluidics-array systeem. Zet de computer aan, en real-time PCR-systeem en het laadsysteem. Toegang tot de betreffende software en ervoor te zorgen dat de machines zijn aangesloten. Verwijder het laadsysteem verbruiksgoederen (Array schuifdeksel, plug and onderdompeling vloeistof) uit de verpakking.
    6. Trek voorzichtig aan de zuiger van de onderdompeling vloeistof spuit los te maken. Verwijder het deksel, plaats tip over en spoel de lucht vanaf de punt. Plaats het laadsysteem tips binnen de machine en verwijder het deksel. Plaats monster plaat binnen PCR-systeem.
    7. Doe handschoenen aan. Zorgen dat ze goed gesloten om het risico van per ongeluk het markeren van de schuifdeksel minimaliseren. Open voorzichtig glijbaan verpakking. Langzaam tip dia in de hand. Raak de bovenkant van de dia niet aan.
    8. Plaats glijden in de PCR-systeem, de barcode op de linkerzijde. Verwijder sluitmachine van het deel van het monster plaat bedoeld voor het laden. Gebruik het laadsysteemsoftware om de dia barcode in te voeren, schuift positie, monster positie en tip configuratie.
    9. Wanneer alle relevante controles zijn voltooid, drukt u op de belasting glijbaan. Terwijl de PCR systeem laadt de schuif, verwijder de transparante en rode kunststof van de bodem van het schuifdeksel. Wanneer klaar is met laden, verwijder voorzichtig en sluit de schuif binnen 90 sec.
      1. Plaats de dia binnen de plaat klem. Plaats de dia deksel op de dia. Klem 30 sec. Zorg ervoor dat het deksel is zo geplaatst dat barcode correct wordt weergegeven. Verwijder de assemblage van de plaat klem.
      2. Positie onderdompeling vloeistof spuit binnen de dia zodat het uiteinde is te drukken tegen het deksel. Langzaam vult dia met onderdompeling vloeistof, waardoor de vloeistof loopt langs het deksel. Eenmaal vol is, sluit de dia met de stekker, het draaien van de schroef totdat de hendel afbreekt.
      3. Verwijder de plastic afdekking op de top van het schuifdeksel, en vervolgens zorgvuldig te plaatsen in de dia drager van de real-time PCR-systeem. Zorg dat er support op de bodem van de schuif wanneer deze wordt neergelaten, zodat het niet plotseling dalen en kan de bovenkant van de slede niet aanraken. Het is OK om de zijkanten van de schuif / cassette.Initialize de PCR-systeem te raken en start het programma voor qPCR binnen 1 uur.
    10. Selecteer "OpenArray" in het PCR-systeemsoftware. Druk op "Find Slide IDs". Dit zal een paar minuten duren. Als de software de plaat ID niet kan vinden, zal het vragen om het handmatig te worden ingevoerd.
    11. Druk op "Bevestig Plate Centres". Nogmaals, zal dit een paar minuten duren. Controleer dat de rode punt binnen het centrum en dat er geen vingerafdrukken / vlekken op de bovenkant van de slede. Laad de respectieve .tpf bestand voor elke dia en geef een naam en locatie resultaat bestand. Druk op "Start Uitvoeren". Het programma duurt ongeveer 2 uur in beslag nemen.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De aanbevolen volume voor een miRNA probe gebaseerde assay qPCR reactie 20 pl. OPMERKING: Wij hebben bevestigd dat een reactievolume van 5 ul kan zelfde resultaat bereikt met 20 gl volume 4,7,30 produceren. Het reactievolume op 5 ul verlagen zorgt voor een afname van 75% in reagens kosten zonder noemenswaardig verlies van gevoeligheid. Zoals weergegeven in figuur 2, reactievolume van 20 pl en 5 pl een sterke co-verhouding tot 39 cycli (met r2 van 0,92, p = 0.0002).

Microfluidics matrix verschaft een middel om gegevens over 754 miRNAs uitgedrukt in een monster in ongeveer 5 uur (voor kaart A en kaart B), wat een efficiëntere manier van analyseren van meervoudige monsters in vergelijking met conventionele 96 putjes PCRs. We vergeleken miRNA microfluidica scala kaart voor hetzelfde monster (Monster A en Monster A repeat) Figuur 3A -. B toont een Bland-Altman plot ( 3A) en Correlatie perceel (3B) voor alle 754 miRNAs getest voor deze monsters. Er zijn 3 verschillende miRNAs controle (U6, RNU44 en RNU48) willekeurig op zowel de kaarten (Kaart A en B) op meerdere locaties. Wanneer U6 cyclus drempelwaarde (Ct) waarden worden vergeleken tussen de 2 runs, we significante verschillen tussen de waarden (tabel 4) niet waarnemen. Het is ook belangrijk op te merken dat U6 wordt uitgedrukt op grotere overvloed (lagere Ct-waarde) in de beoordeelde monster. We vervolgens vergeleken alle miRNAs die Ct-waarden hebben tussen 0-19,99 in zowel de runs (n ​​= 150), die vergelijkbaar zijn met de expressie van miRNAs had overall met een co-efficiënte van de bepaling van de 98% (Figuur 3C-D). Van alle 277 miRNAs die Ct-waarden hebben tussen 20 en 29.99 in zowel de pistes, 16 miRs verschilde significant tussen de originele en herhaal runs (figuur 3E - F) Het aantal miRNAs met significant verschil betwee.n de runs toegenomen (89 van 327) als de Ct-waarden werden geselecteerd 30-40 voor beide runs (figuur 3G - H).

De nanofluidics matrix platform levert gegevens 754 miRNAs van elk serum / plasma monster getest, zoals weergegeven in figuur 4A Het is belangrijk om deze versterking te bestuderen -. Zoals bij alle qPCR - zodat het resultaat indicatief waar amplificatie. Elk van de 48 subarrays (figuur 1) bevat ook een bepaling voor de drie meest populaire "housekeeping" ncRNAs. U6, RNU44 en RNU48 Figuur 4B illustreert een typische clustering van U6 replica van een enkel monster. Deze replica's te tonen lage standaarddeviatie (SD <0,5) en zo zijn een indicator van de betrouwbaarheid. Alternatief Figuur 4C toont de verhoogde variabiliteit van U6 duplo (SD> 0.5) in een tweede monster. Dit doet de geldigheid o niet ontkennenf de resterende assays, hoewel het noodzakelijk een grondiger kritiek. U6, zoals met de meeste "housekeeping" miRNAs in biologische vloeistoffen, kan een variabele expressie hebben. Opgemerkt moet worden dat één van de monsters, die in figuur 4C, wordt 4-voudig minder U6 inhoud dan die weergegeven in figuur 4B. Daar de U6 monster gepresenteerd 4C is 75% minder beginnen dan degene die in paneel 4B, is een verdergaande variabiliteit verwacht vanwege de Poisson verdeling van transcripten, die wordt verergerd door de kleine reactievolume 17.

Een ander handig hulpmiddel is de Kwaliteitscontrole (QC) beelden, beschikbaar voor de export een keer de run is voltooid. Een selectie van deze toepassingen de fluorescentie van ROX, de passieve kleurstof in de qPCR reagens mengsel, te bevestigen dat elk doorgaand gat correct is geladen (figuur 5). Een through-hole, of zelfs een eigen band subarray, kan niet laden vanwege onvoldoende monstervolume, verdamping, aanwezig in de putjes van de 384-wells monster plaat, het niet het monster plaat zegel, of gebreken volledig te verwijderen binnen de Accufill systeem of de tips bubbels. Elke gelost doorgaande gaten moeten worden geïdentificeerd aan de etikettering miRNAs te vermijden als "niet op te sporen", terwijl in werkelijkheid de test werd nooit geladen. Als dit probleem wordt aangetroffen, bevestigt dat ten minste 5 ul van het monster / mastermix in elk putje van de 384-wells monster plaat is geplaatst, wordt het monster plaat behoorlijk voorafgaand gecentrifugeerd om het laden, de folie afdichting is volledig verwijderd, en de geladen OpenArray dia wordt afgesloten en lopen binnen de toegestane tijd voor alle opeenvolgende series. Als het laden problemen blijven bestaan, kunnen deze meer kans te worden met betrekking tot specifieke partij of het lot van de arrays of aanverwante verbruiksartikelen en verdere hulp gezocht moet worden door de fabrikant.

"Src =" / files / ftp_upload / 52586 / 52586fig1.jpg "/>
Figuur 1: Lay-out van de monsters voor de Nanofluidics Array workflow: (A) Elke 384-wells monster plaat kan steekproeven houden voor maximaal 8 nanofluidics arrays. (B) Verwaterde, wordt voorversterkt cDNA geplaatst in 8 putten (2 kolommen met 4 rijen), met zwembad A en Poule B in aangrenzende 8-goed groepen. Elke cirkel staat voor een goed. (C) elk putje van de monsterplaat wordt in een submatrix van de nanofluidics matrix geladen. Elk klein vierkant vertegenwoordigt één subarray.

figure-results-1
Figuur 2: Co-verhouding analyse conventionele 96-wells PCR platforms: Co-verhouding van 20 pl en 5 pl reactievolume op TaqMan real-time qPCR met een standaard 96-putjesplaat platform CT waarden (39 cycli). We vergeleken 4 verschillende microRNAs (miR-375, miR-30c, miR-30d en miR-7) in 4 verschillende humaan serum en plasma monsters. Slechts 11 punten uitgezet omdat de anderen waren niet op te sporen. R 2 = 0,92, p = 0.0002.

figure-results-2
. Figuur 3: De doorgeven miRNA profilering behulp microfluidics serie kaarten met behulp van 2 microfluidics kaarten (kaart-A en kaart-B), wordt een profiel van 754 miRNAs gegenereerd (A - B). Zoals hier getoond, gebruikten we hetzelfde monster voor 2 microfluidics scala loopt naar de reproduceerbaarheid van de microfluidics kaart resultaten te controleren. We zagen een soortgelijke uitdrukking van miRNAs in het algemeen, met Ct-waarden tussen 0-19,99 (C - D). Er zijn weinig miRNAs (16 van 277) met Ct-waarden tussen 20-29,99 en significante verschillen tussen repeat runs (E - F). Negenentachtig van 327microRNA met hogere Ct-waarden (30-40) vertoonden significante verschillen tussen beide punten (G - H).   De gegevens worden geanalyseerd met behulp van gepaarde T-test. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-3
Figuur 4: Vertegenwoordiger Profiel van PCR-product amplificatiecurven: Is een representatieve waarde van de gecombineerde (A) amplificatiecurven van alle miRNA doelen voor een menselijk plasma monster. Een assay voor U6 (a common control ncRNA) wordt in elke submatrix. Het monster in (B) vertoont een lage variabiliteit (SD <0,5), terwijl (C) toont een hoge standaarddeviatie (SD> 0,5) binnen U6 repliceert. Beide monsters zijn total RNA geïsoleerd uit menselijk plasma. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-4
Figuur 5: QC Analyse van Nanofluidics Arrays: Kwaliteitscontrole (QC) beelden van een correct geplaatste nanofluidics array (links) en een verkeerd geladen nanofluidics array (rechts). De passieve kleurstof, ROX (aanwezig in de qPCR reagens mix), fluoresceert om een ​​correct geplaatste through-hole aan te geven. De array op de rechter heeft verschillende subarrays / doorgaande gaten die niet worden geladen met de qPCR reagens mix en deze moeten worden geïdentificeerd als vals-negatieve PCR-reacties.

Onderdelen Volume per 5 ul reactie (pl)
RT buffer (10x) 0.5
dNTPs (100 mM) 0.05
RNase inhibitor 0.6
Nuclease-vrij water 1.39
Reverse transcriptase 0,33
Totale volume 2.33

Tabel 1A: RT reagens mengsel componenten in een 5 pl RT-reactie voorbereiding TaqMan real-time qPCR met een standaard 96-putjesplaat platform.

Onderdelen Volume per 5 ul reactie (pl) Volume per 20 ul reactie (pl)
Snelle PCR mastermix (2x) 2.5 10
TaqMan qPCR assay (20x) * 0.25 1
Nuclease-vrijwater 1.45 5.8
Totaal Volume: 4.2 16.8

* Testcomponent op basis van de geselecteerde miRNA getest.

Tabel 1B: qPCR reagens mengsel componenten in een 5 of 20 ul qPCR reactie voorbereiding TaqMan real-time qPCR met een standaard 96-putjesplaat platform.

Onderdelen Volume per reactie (pl)
Megaplex RT Primers (10x) 0.8
dNTP met dTTP (100 mM) 0.2
Multiscribe Reverse Transcriptase (50 U / ul) 1.5
10X RT Buffer 0.8
MgCl2 (25 mM) 0.9
RNase Inhibitor & # 160; (20 U / ul) 0.1
Nuclease-vrij Water 0.2
Totaal 4.5

Tabel 2A: RT reagens mix componenten in een 5 pl RT-reactie voorbereiding op TLDA miRNA paneel.

Onderdelen Volume per reactie (pl)
TaqMan PreAmp Mastermix (2x) 12.5
Megaplex PreAmp Primers (10x) 2.5
Nuclease-vrij water 7.5
Totaal 22.5

Tabel 2B: Voorversterking reagens mix componenten in een 25 ul pre-amplificatie reactie voorbereiding op TLDA miRNA paneel.

"Cellspacing =" 0 "> Onderdelen Volume per reactie (pl) Megaplex RT Primers (10x) 0.75 dNTP met dTTP (100 mM) 0.15 Multiscribe Reverse Transcriptase (50 U / ul) 1.5 10X RT Buffer 0.75 MgCl2 (25 mM) 0.9 RNase Inhibitor (20 U / ul) 0.09 Nuclease-vrij Water 0.35 Totaal 4.5

Tabel 3A: RT reagens mengsel componenten in een 5 pl RT-reactie voorbereiding op probes gebaseerde nanofluidics miRNA panel.

Bestanddeels Volume per reactie (pl)
TaqMan PreAmp Mastermix (2x) 12.5
Megaplex PreAmp Primers (10x) 2.5
Nuclease-vrij water 7.5
Totaal 22.5

Tabel 3B:. Voorversterking reagens mix componenten in een 25 ul pre-amplificatie reactie voorbereiding op-sonde gebaseerd nanofluidics miRNA panel OPMERKING: De interactieve aanvullende Excel-spreadsheets voorzien voor de drie platforms, al goed voor de 5% bijtelling te compenseren voor het pipetteren fout.

Monster A Monster A repeat
15,535 16,156
15,471 15,652
15.623 16,063
15,963 15,889
14,006 13,993
14,502 14,623
14,907 14,384
13,732 14,946

Tabel 4: De doorgeven miRNA U6 profileren met behulp van microfluidics scala kaart. Met behulp van twee microfluidics serie kaarten (A en B). Ct-waarden van U6 controle miRNA uit Monster A (totaal = 8). Consistente U6 controle miRNA overvloed waargenomen tussen de runs.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De kritische stappen in de probes gebaseerde qPCR protocollen om nauwkeurige en reproduceerbare resultaten te verkrijgen om er zeker 1) dezelfde hoeveelheid en concentratie van RT-product wordt in elke qPCR reactie geladen, 2) de juiste verhoudingen en hoeveelheden van de componenten die nodig zijn voor qPCR reactie worden voorbereid en goed gemengd, 3) de correcte en consistente volumes worden toegevoegd aan elke qPCR reactie, en 4) de voorbereiding en het laden van elk monster en het reactiemengsel wordt voltooid in de kortst mogelijke tijd, terwijl nog steeds bewust van de bovenstaande kritische stappen eerder vermeld.

De microfluidics reeks kaarten nodig geschikte centrifuge en specifieke emmers. Elke emmer kan maximaal 3 kaarten (geladen / leeg). Zorg er altijd voor dat alle 3 slots van een emmer bezet zijn en de emmer wordt in evenwicht gehouden door het plaatsen van vergelijkbare emmer (deze bak moet ook 3 kaarten, leeg of vol bevatten) in de tegenovergestelde sleuf van de centrifuge. Terwijl het plaatsen van de kaart in de bucket houder, zorg ervoor dat de 8 reservoirs projecteren naar boven en reactieputjes geconfronteerd met de buitenwand van centrifuge. Spin kaarten bij 331 xg gedurende 1 min bij kamertemperatuur. Na de eerste spin, opent u de centrifuge en visueel zorgen de reactie mix is ​​afgegeven door de 384 putten. Herhaal de spin in dezelfde instellingen voor nog 1 keer. Neem de kaart uit emmer en zorgen dat het niveau van reactiemengsel in elk van de reservoirs 8 is uniform. Inconsistenties in de vloeistofvolumes links in de reservoirs maakt de kaart ongeschikt verdere gebruik.

Om dezelfde concentratie van het RT-product, wordt dezelfde ingang concentratie van RNA toegevoegd in elke RT-reactie. Het totale RNA-concentratie wordt gemeten met een micro-volumespectrophotometer. De waargenomen 260/280 verhouding kan zo laag als 1.3 voor de RNA geïsoleerd uit plasma / serum zijn; dit lijkt geen effect te hebben op downstream-qPCR gerelateerde verwerking of gegenereerd 30. Ook de verhouding 260/280de RNA monsters hierin geteste tussen 1,3-1,7 geen abnormale effecten in het qPCR waargenomen.

Bij gebruik van laag gehalte RNA monsters, zoals die van biovloeistoffen, kan het moeilijk zijn om RNA voorafgaand aan de verwerking kwantificeren. Wij raden het gebruik van synthetische spike-in in het RNA-isolatie, evenals het omgekeerde fasen transcriptie. In onze ervaring, Arabidopsis thaliana miRNA kandidaten (ATH-miR-159a en ath-miR-172a) de voorkeur boven Caenorhabditis elegans miRNAs (zoals CEL-miR-39 of CEL-miR-54), die in onze ervaring hoger kunnen hebben homologie dan die van A. thaliana. Het gebruik van dergelijke fasespecifieke spike-in kan verklaren de normalisatie van miRNA data over meerdere monsters geanalyseerd op verschillende tijdstippen. Met behulp van een vaste ingang volume van RNA voor cDNA-synthese reactie wordt ook aanbevolen 32,33.

De drie probes gebaseerde protocollen voor miRNA kwantificering hier beschreven vereisen verschillende hoeveelhedentotaal RNA-ingang, verschillende workflows en kosten. Elk van de workflows zijn ontworpen om te voorzien in verschillende doorvoersnelheden op basis van het aantal miRNA targets en het aantal te analyseren monsters. Met toenemende doorvoer (96 rxn 384 rxn 3072 rxn), de kosten per reactie afneemt met een toename in de hoeveelheid gegevens verkregen over een tijdseenheid. Omdat al deze platforms gebruiken TaqMan chemie kan worden verwacht de kwaliteit van de gegevens verkregen vergelijkbaar. TaqMan qPCR is een bekende methode voor het identificeren van de overvloed van miRNAs in serum / plasma monsters 9,11,27. Hoewel de drie platforms besproken dezelfde chemie, een afname van het reactievolume leidt tot een afname van het dynamisch bereik van transcript detectie (Farr RJ et al., Ongepubliceerde gegevens). De 96-well qPCR platform is een lagere doorvoersnelheid, maar hoge gevoeligheid platform en in onze ogen, de "gouden standaard" voor alle probes gebaseerde (of kleurstoffen gebaseerde) PCR-platforms. Dit kan echterde meest economische of efficiënt platform niet zijn als enkele honderden of duizenden monsters worden geanalyseerd en voor meerdere microRNAs. Microfluidics (TLDA) en nanofluidics (OA) platforms zijn high-throughput / content platforms ontworpen om acquisitie van grotere gegevens mogelijk te maken in een kortere tijd. Hoewel batch verschillen waargenomen in de TLDA kaarten, kan deze worden geminimaliseerd door het vragen TLDA kaarten van dezelfde partij. We merken op dat TLDA platform (figuur 3) toonde significante verschillen in 17% van mid - lage abundantie miRNAs bij testen met dezelfde monster op verschillende partijen TLDA kaarten. Daarom adviseren wij het gebruik van de dezelfde partij nummers voor analyse met behulp van TLDA kaarten. Deze variatie kan ook worden veroorzaakt door de technische variabiliteit inclusief mogelijke laad- en pipetteringsfouten. Echter, raden wij bestellen / aanvragen van dezelfde partij TLDA kaarten. Geen significante batch variatie werd waargenomen op de OA platform. Ondanks dit, TaqMan gebaseerd ExperimenTal qPCR benadert aanbod gemak naar de overvloed van miRNAs in plasma / serum monsters te meten. De lage, middelhoge en hoge throughput benaderingen hier besproken bieden de flexibiliteit om een ​​reeks van samples en miRNAs met behulp van een zeer efficiënte, reproduceerbare en schone (lage ruis) chemie analyseren.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Artikel verwerkingskosten / publicatie werden gedekt door Life Technologies, na de aanvaarding van dit manuscript voor publicatie.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle auteurs erkennen de ondersteunende infrastructuur van de NHMRC CTC, Universiteit van Sydney, de Juvenile Diabetes Research Foundation (JDRF), Australië en de Rebecca Cooper Foundation, Australië. Dit onderzoek werd gefinancierd door subsidies van de Australian Research Council (FT110100254) en de JDRF, Australië (CRN201314) naar WW, RJF AAH en MvJ uitgevoerd helemaal nat lab experimenten, ASJ uitgevoerd data-analyse. WW schreef het eerste ontwerp. AAH gepland de studie en de gegevens geanalyseerd. Alle auteurs gelezen en akkoord over de definitieve versie van het manuscript, cijfers en werkbladen voor publicatie voorgelegd.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
96 well-platform
Voor Reverse transcriptie
TaqMan MicroRNA Assays INV SM Applied Biosystems
 		4427975https://www.lifetechnologies.com/au/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-assays/mirna-ncrna-taqman-assays/single-tube-mirna-taqman-assays.html?ICID=search-4427975
De assays worden geleverd als een pakket met RT-primers en PCR-primer.
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription KitApplied Biosystems
 		4366597 of 4366596https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366597?ICID=search-4366597 of http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366596?ICID=search-4366596
De TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit is dezelfde kit die wordt gebruikt voor reverse transcriptie in alle drie deTaqMan platform- 96-well platform, TLDA en OpenArray.
Voor qPCR uitgevoerd op een 96-well platform
2x TaqMan Fast Universal PCR Master Mix, geen AmpErase UNG Applied Biosystems
 		4367846https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4367846?ICID=search-4367846
De 2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix wordt gebruikt voor qPCR op  de twee TaqMan platforms-96-well platform en TLDA.
MicroAmp Optical Adhesive FilmApplied Biosystems4311971https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4311971?ICID=search-product
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0,1 ml Applied Biosystems4346907https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4346907?ICID=search-product
Microfluidics platform (TLDA)
Voor Reverse transcriptie
Zie 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 of 4366596) (zoals hierboven getoond).
Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1Applied Biosystems
 		4399966https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399966?ICID=search-4399966
De Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 wordt gebruikt voor RT op  de twee TaqMan platforms- TLDA en OpenArray.
Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0Applied Biosystems
 		4444281https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444281?ICID=search-4444281
De Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 wordt gebruikt voor RT op  de twee TaqMan platforms- TLDA en OpenArray.
OFOF
Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0Applied Biosystems
 		4444750http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444750?ICID=search-4444750
De Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 wordt gebruikt voor RT op  de twee TaqMan platforms- TLDA en OpenArray.
Voor Pre-amplificatie
TaqMan PreAmp Master MixApplied Biosystems
 		4391128 of 4488593https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4391128?ICID=search-4391128 of http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4488593
De TaqMan PreAmp Master Mix wordt gebruikt voor pre-amplificatie van qPCR op  de twee TaqMan platforms- TLDA en OpenArray.
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 Applied Biosystems
 		4444303https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444303?ICID=search-4444303
De Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 wordt gebruikt voor pre-amplificatie van qPCR op  de twee TaqMan platforms- TLDA en OpenArray.
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1Applied Biosystems
 		4399233https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399233?ICID=search-4399233
De Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 wordt gebruikt voor pre-amplificatie van qPCR op  de twee TaqMan platforms- TLDA en OpenArray.
1x TE Buffer (100 ml)Invitrogen12090-015https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12090015?ICID=search-product
De 1x TE Buffer wordt gebruikt voor pre-amplificatie van qPCR op  de twee TaqMan platforms- TLDA en OpenArray.
Om de 384 well microfluidics (TLDA) kaart te laden en uit te voeren
TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 Applied Biosystems4444913https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444913
Nanofluidics platform (OpenArray)
Voor Reverse transcriptie
Zie 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 of 4366596) (zoals hierboven getoond).
Voor Pre-amplificatie
Zie TLDA pre-amplificatie reagentia (zoals hierboven getoond)
Om de slides te laden en uit te voeren
TaqMan OpenArray Human MicroRNA Panel, QuantStudio 12K Flex (1 paneel)Applied Biosystems
 		4470187https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4470187?ICID=search-4470187
QuantStudio 12K Flex OpenArray Accessoires Kit Applied Biosystems
 		4469576https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/446

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ambros, V. The functions of animal microRNAs. Nature. 431, 350-355 (2004).
  2. Alvarez-Garcia, I., Miska, E. A. MicroRNA functions in animal development and human disease. Development. 132, 4653-4662 (2005).
  3. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
  4. Joglekar, M. V., Wei, C., Hardikar, A. A. Quantitative estimation of multiple miRNAs and mRNAs from a single cell. Cold Spring Harb Protoc. 2010, pdb prot5478(2010).
  5. Joglekar, M. V., Parekh, V. S., Hardikar, A. A. Islet-specific microRNAs in pancreas development, regeneration and diabetes. Indian J Exp Biol. 49, 401-408 (2011).
  6. Farr, R. J., Joglekar, M. V., Taylor, C. J., Hardikar, A. A. Circulating non-coding RNAs as biomarkers of beta cell death in diabetes. Pediatr Endocrinol Rev. 11, 14-20 (2013).
  7. Joglekar, M. V., Joglekar, V. M., Hardikar, A. A. Expression of islet-specific microRNAs during human pancreatic development. Gene Expr Patterns. 9, 109-113 (2009).
  8. Iorio, M. V., Croce, C. M. MicroRNA profiling in ovarian cancer. Methods Mol Biol. 1049, 187-197 (2013).
  9. Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. P Natl Acad Sci USA. 105, 10513-10518 (2008).
  10. Mattie, M. D., et al. Optimized high-throughput microRNA expression profiling provides novel biomarker assessment of clinical prostate and breast cancer biopsies. Mol Cancer. 5, 24(2006).
  11. Zhu, W., Qin, W., Atasoy, U., Sauter, E. R. Circulating microRNAs in breast cancer and healthy subjects. BMC Res Notes. 2, 89(2009).
  12. Zhu, H. T., et al. Identification of suitable reference genes for qRT-PCR analysis of circulating microRNAs in hepatitis B virus-infected patients. Mol Biotechnol. 50, 49-56 (2012).
  13. Yamada, H., Itoh, M., Hiratsuka, I., Hashimoto, S. Circulating microRNAs in autoimmune thyroid diseases. Clin Endocrinol (Oxf). , (2014).
  14. Liu, R., et al. Serum MicroRNA Expression Profile as a Biomarker in the Diagnosis and Prognosis of Pancreatic Cancer. Clinical Chemistry. 58, 610-618 (2012).
  15. Gilad, S., et al. Serum microRNAs are promising novel biomarkers. PLoS One. 3, e3148(2008).
  16. Joglekar, M. V., Parekh, V. S., Mehta, S., Bhonde, R. R., Hardikar, A. A. MicroRNA profiling of developing and regenerating pancreas reveal post-transcriptional regulation of neurogenin3. Dev Biol. 311, 603-612 (2007).
  17. Hardikar, A. A., Farr, R. J., Joglekar, M. V. Circulating microRNAs: understanding the limits for quantitative measurement by real-time PCR. J Am Heart Assoc. 3, e000792(2014).
  18. Wu, C., et al. Diagnostic and Prognostic Implications of a Serum miRNA Panel in Oesophageal Squamous Cell Carcinoma. PLoS One. 9, e92292(2014).
  19. McDonald, M. K., Capasso, K. E., Ajit, S. K. Purification and microRNA profiling of exosomes derived from blood and culture media. J Vis Exp. , e50294(2013).
  20. Joglekar, M. V., et al. The miR-30 family microRNAs confer epithelial phenotype to human pancreatic cells. Islets. 1, 137-147 (2009).
  21. Genda, Y., et al. microRNA changes in the dorsal horn of the spinal cord of rats with chronic constriction injury: A TaqMan(R) Low Density Array study. Int J Mol Med. 31, 129-137 (2013).
  22. Wang, B., et al. Systematic evaluation of three microRNA profiling platforms: microarray, beads array, and quantitative real-time PCR array. PLoS One. 6, e17167(2011).
  23. Cuk, K., et al. Circulating microRNAs in plasma as early detection markers for breast cancer. Int J Cancer. 132, 1602-1612 (2013).
  24. Morrison, T., et al. Nanoliter high throughput quantitative PCR. Nucleic Acids Res. 34, e123(2006).
  25. Git, A., et al. Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression. RNA. 16, 991-1006 (2010).
  26. Benes, V., Castoldi, M. Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR, how to use it and what is available. Methods. 50, 244-249 (2010).
  27. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33, e179(2005).
  28. Schmittgen, T. D., et al. Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA. Methods. 44, 31-38 (2008).
  29. Kodani, M., et al. Application of TaqMan low-density arrays for simultaneous detection of multiple respiratory pathogens. J Clin Microbiol. 49, 2175-2182 (2011).
  30. Taylor, C. J., Satoor, S. N., Ranjan, A. K., Pereirae Cotta,, V, M., Joglekar, M. V. A protocol for measurement of noncoding RNA in human serum. Exp Diabetes Res. 2012, 168368(2012).
  31. TPF & SPF File Download Options [Internet]. , Available from: http://www.appliedbiosystems.com/absite/us/en/home/products/tpf-spf-download.html (2014).
  32. Turchinovich, A., Weiz, L., Langheinz, A., Burwinkel, B. Characterization of extracellular circulating microRNA. Nucleic Acids Res. 39, 7223-7233 (2011).
  33. Li, Y., Kowdley, K. V. Method for microRNA isolation from clinical serum samples. Anal Biochem. 431, 69-75 (2012).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

microRNA kwantificering96 wells plaatmicrofluidische arraynanofluidische arrayserum en plasmaproevenreverse transcriptiepreamplificatiefluorescent probe detectiehigh throughput PCR

Gerelateerde artikelen