Echografie gebaseerde beoordeling van coronaire Flow en Coronaire Flow Reserve Met behulp van de druk overbelasting Model in Muizen

Samenvatting

Coronaire flow reserve (CFR) is nuttig voor de beoordeling van myocard zuurstofbehoefte en evaluatie van cardiovasculair risico. Deze studie stelt een stapsgewijze transthoracale Doppler echocardiografische (TTDE) methode vast voor longitudinale monitoring van de veranderingen in CFR, zoals gemeten vanuit de kransslagader bij muizen, onder de experimentele drukoverbelasting van aortische banding.

Samenvatting

Transthoracale Doppler echocardiografie (TTDE) is een klinisch bruikbaar, niet-invasief hulpmiddel voor het bestuderen van de snelheid van de coronaire arteriële stroom en de coronaire doorstroomreserve (CFR) bij mensen. Verminderde CFR gaat gepaard met duidelijke intramyocardial en pericoronaire fibrose en wordt gebruikt als indicatie van de ernst van de disfunctie. Deze studie onderzoekt stap voor stap de real-time veranderingen gemeten in de coronaire stroomsnelheid, CFR en de systolische naar diastolische pieksnelheid (S/D) verhouding in het kader van een aortische bandmodel bij muizen. Door gebruik te maken van een Doppler-transthoracale beeldvormingstechniek die reproduceerbare en betrouwbare gegevens oplevert, beoordeelt de methode veranderingen in de stroom in de septale coronaire arterie (SCA), gedurende een periode van meer dan twee weken bij muizen, die eerder ofwel een aortische band ofwel een thoracotomie ondergingen.

Tijdens het beeldvormen werd hyperemie bij alle muizen geïnduceerd door isofluran, een verdovingsmiddel dat de coronaire stroomsnelheid verhoogde in vergelijking met de rustsnelheid. Alle beelden werden verworven door een enkele beeldvormer. Twee verhoudingen, (1) CFR, de verhouding tussen hyperemische en basale stroomsnelheden, en (2) systolische (S) naar diastolische (D) stroom werden bepaald, met behulp van een eigen software en door twee onafhankelijke waarnemers. Belangrijk is dat de waargenomen veranderingen in de coronaire stroom voorafgingen aan LV-disfunctie, zoals blijkt uit normale LV-massa en fractionele verkorting (FS).

De methode werd vergeleken met de huidige gouden standaard van coronaire beoordeling, histopathologie. De laatste techniek toonde duidelijke pathologische veranderingen in de coronaire arterie in de vorm van peri-coronaire fibrose die correleerde met de stroomsnelheidsveranderingen zoals beoordeeld door middel van echocardiography.

De studie onderstreept de waarde van het gebruik van een niet-invasieve techniek om de coronaire circulatie in muizenharten te monitoren. De methode minimaliseert overbodig gebruik van onderzoeksdieren en toont aan dat geavanceerde op ultrageluid gebaseerde indices, zoals CFR en S/D-verhoudingen, kunnen dienen als bruikbare diagnostische hulpmiddelen in een verscheidenheid van onderzoeksprotocollen, inclusief geneesmiddelenstudies en de studie van genetisch gemodificeerde stammen.

Inleiding

Klinische aortastenose (AS) is algemeen bekend om een ​​progressieve toename in linker ventrikel (LV) afterload promoten. Om dit te compenseren chronisch stijgende hemodynamische belasting, LV hypertrofie (LVH) ontstaat als een adaptieve respons ^1,2. De ontwikkeling van LVH wordt vaak geassocieerd met abnormaliteiten in coronaire microcirculatie. Men denkt dat microvasculaire disfunctie bijdraagt ​​chronische ischemie bij deze patiënten ^5. Naast coronaire stroom ^3,4, coronaire stroming reserve (CFR) vertegenwoordigt functionele wijziging van kransslagaders ^1,3 en wordt gedefinieerd als de verhouding van de maximale stroomsnelheid in hyperemie uitgangswaarde stroomsnelheid of resting stroomsnelheid ^4,6,7. CFR Verlagen van remodeling ^1-3,5-9 en wordt gebruikt als een index van de mate van functionele ernst van coronaire disfunctie ^1,10,17. Het is bekend verminderen bij vele vormen van gedilateerde cardiomyopathie ¹⁰ alsook coronaire stenosis ^6. CFR is ook een prognostische marker voor slechte klinische resultaten ^12.

LV remodeling in de setting van cardiale disfunctie zoals ischemie of LVH gaat tevens gepaard met uitgebreide fibrose, veranderingen in coronaire microcirculatie en verdikking van de kransslagaders ^1,2. Als gevolg van deze veranderingen in coronaire fysiologie, er waarschijnlijk remodelleren van de kransslagaders. Dit helpt de effecten van lage diffusie zuurstof en LV diastolische dysfunctie die kunnen leiden tot vatbaarheid voor myocardischemie ^1,2,13 verzachten.

Genetisch gemodificeerde muizen zijn nu een grote schaal voorkomt onderzoek tool voor het nabootsen van menselijke omstandigheden ziekten zoals coronaire atherosclerose ^{5,7,10,12,17.} Vooral de druk overbelasting model bij muizen is op grote schaal bestudeerd ^14,17. De trans-aorta vernauwing model (TAC) blijkt geassocieerd met uitgebreide fibrose en Coronary stenose resulteert gedeeltelijk uit mediale verdikking van kransslagaders en bijbehorende veranderingen in coronaire stromingspatronen ^1,11,17,19 vergelijkbaar met wat wordt gezien in de omgeving van LVH bij mensen. Hoewel bekend is dat langdurige drukoverbelasting leidt tot hartdecompensatie in ongeveer 4-8 weken, de effecten op coronaire miek en stroomreserve in deze modellen, vroeg stadium van de ziekte, en in verschillende stadia na banding, nog duidelijk worden afgebakend.

Talrijke stammen van muizen zijn momenteel beschikbaar voor onderzoeksdoeleinden, met inbegrip van goed gekarakteriseerde LDLR - / - of ApoE - / - muizen ^10-12, en deze zijn ontwikkeling van gevoelige technieken gevraagd voor de beoordeling van de cardiovasculaire functie en morfologie in levende muizen ^11-15. Dergelijke technieken omvatten MRI, PET, contrast CT hoogfrequente ultrasone en elektronenbundel tomografie ^2,9,17,19, die alle voorzien veelbelovende alternatieven voor invasievemethoden zoals cardiale catheterisatie en coronaire angiografie ^12. In muizen met zeer kleine afmetingen van de coronaire slagaders en hoge hartslag (HR), beeldvorming van coronaire circulatie vormt nog een technische uitdaging voor vele momenteel beschikbare technieken ^4,12. Interessant is er een exponentiële toename van technische ontwikkelingen op het gebied van transthoracale Doppler echocardiografie (TTDE), waaronder de ontwikkeling van hoogfrequente matrix scan hoofden met centrale frequenties van 15 tot 50 MHz waardoor axiale resoluties van ongeveer 30-100 urn is, op een diepte van 8-40 mm, en frame rates van meer dan 400 frames gevangen / sec. Op hun beurt zijn TTDE-gebaseerde technieken ontwikkeld tot een potentieel krachtig instrument voor groter ² of zelfs kleinere vaartuigen afbeelden zoals kransslagaders ^5,12.

Een andere kritische voorhand dat heeft toegestaan ​​onderzoekers aan diagnostische beeldvorming studies van het vaatstelsel te voeren in kleine eennimals is het zorgvuldig gecontroleerde gebruik van anesthetica die het hart en de ademhaling van de dieren tijdens het afbeelden ¹¹ te behouden. Gecontroleerde anesthesie onderhoud is bijzonder belangrijk voor studies in verband met vasodilatatie bij muizen, en het effect van anesthesie moet ook verder worden onderzocht in de context ^10,11. Bij mensen daarentegen, TTDE afgeleide CFR metingen een meer gebruikelijke hulpmiddel voor de beoordeling van vernauwde en niet belemmerd epicardiale coronaire slagaders, overwegend linker voorste dalende (LAD) coronaire arterie ^5,16. Echter, de prognostische rol van CFR en coronaire stroming veranderingen in asymptomatische patiënten en muizen met een behouden LV systolische functie in rust minder onderzocht ^16. Daarom was het doel van de studie was om eerst een duidelijke stap-voor-stap protocol vast, veranderingen in coronaire stroom met TTDE een drukoverbelasting muismodel evalueren; tweede, deze studie onderzocht de prognostische tekenificance van CFR en coronaire stroom veranderingen in reactie op overbelasting van stress druk in deze muizen. Onze hypothese was dat TTDE gebaseerde beoordeling van CFR en coronaire doorstroming nuttig in de vroege opsporing van coronaire dysfunctie dat LV dysfunctie kan voorafgaan kunnen zijn.

Protocol

OPMERKING: Alle procedures werden uitgevoerd bij muizen in overeenstemming met American Veterinary Medical Association (AVMA) richtlijnen en goedgekeurd Institutional Animal Care en gebruik Comités (IACUC) protocollen.

1. Studie Ontwerp

1. Gebruik 8-10 weken oude mannelijke C57BL / 6 muizen (BW ~ 25 g) in de studie.
2. Willekeurige de muizen (n = 11) in twee groepen, de studiegroep geselecteerd aorta banding (n = 8) en de controlegroep (n = 3) sham geopereerd via thoracotomie.
3. Bereid het dier voor de beeldvorming door het verwijderen van haar van de borst met behulp van ontharingscrème is dat medische kwaliteit.
4. Voer een eerste echo (deel 2) 24 uur voorafgaand aan de aorta banding van de uitgangswaarde parameters bepalen op dag -1, tussen een bereik van 1% en 2,5% isofluraan (gemengd met 100% O ₂ via neuskegel) geïnduceerde anesthesie.
5. Kies een medisch goedgekeurd anestheticum (dwz isofluraan) en toezicht houden op de mate van anesthesie (2-3% naar induce, en 1,0% te houden).
   Opmerking juiste anesthesie is cruciaal in het onderhoud van hartslag bij normale fysiologische tarieven (ongeveer 500 slagen / min).
6. Controleer de diepte van anesthesie door verlies van beweging van het dier in antwoord op een pedaal terugtrekking reflex. Gebruik paralube dierenarts zalf op de ogen tot droog te voorkomen tijdens het onder narcose.
7. Uit te voeren operatie op dag 0 ^20,21.
8. Voor aorta-banding, afbinden van de aorta met een 7-0 zijden hechtdraad rond een taps toelopende 26 G naald geplaatst op de boog.
   LET OP: Gegevens met betrekking tot de experimentele protocol, met inbegrip van de chirurgische aorta banding procedures, in het verleden ^20,21 beschreven.
9. Voeren na de operatie echografie (deel 2) op dag (en) 2, 6 en 13.
10. Euthanaseren de muizen op dag 14 en oogst de harten voor histologische evaluatie. Euthanaseren de dieren met een overdosis pentobarbital, gevolgd door verwijdering van een vitaal orgaan zoals het hart. Arresteer de harten in diastole en bevestig met formaline. Gebruik de procedure van het hart oogsten die al eerder ²² beschreven.
11. Fix alle hart weefsels met gebufferde 10% formaline oplossing. Voor trichroomkleuring, insluiten weefsels in paraffine voor het snijden. Gebruik de details van trichroomkleuring die goed voorheen ^14,23 hebben geïllustreerd.
12. Analyseer de gegevens met behulp van offline software (deel 3).

2. Imaging Protocol

1. Lange en korte beelden as van septale kransslagader (SCA) (B- Mode)
   1. Met behulp van MS550D sonde met centrale frequentie van 40 MHz is aangesloten op de actieve-poort, zet de applicatie standaard: "cardiale beeldvorming".
   2. Met het dier in rugligging op het verwarmde platform, en onder narcose aangestuurd via neuskegel, de positie van de sonde met behulp van het spoorwegsysteem voor parasternale lange as view (PSLAX) (Figuur 1A) te verkrijgen. Zorg er altijd voor dat het dier warm wordt gehouden op de voorverwarmde platform en lichaamstemperatuur wordt op fysiologische niveaus.
   3. Draai de probe (met kerf wijst caudaal) rechtsom zodat de sonde hoek 15 ° naar links parasternale lijn (lange as view) (Figuur 1B).
   4. Pas de probe hoek een kanteling aan de y-as van de sonde tot een volledige lengte langsaanzicht van SCA in het midden van het scherm (figuur 1B) te verkrijgen.
   5. Zodra de juiste oriëntatiepunten (aortaklep en longslagader) worden bekeken, cine winkel het beeld met de hoogste frame rate mogelijk.
   6. Door het gebruik van de "xy" assen micro-manipulatoren (figuur 1D), past u de sonde positie om de duidelijkste beeld van de SCA verkrijgen.
   7. Draai de probe van 90 ° (met kerf wijst caudaal) rechtsom zodat getande uiteinde van de sonde links van middellijn (korte as) (Figuur 1C).
2. Lange en korte beelden as van SCA (Color-Doppler Mode)
   1. Zodra afbeelding van een B-modus is vastgelegd of cine-opgeslagen, klikt u op de kleur Doppler-toets op het toetsenbord in te schakelen op kleur Doppler akoestische venster (figuur 2).
      Opmerking: Dit helpt om coronaire isoleren (witte pijl geeft SCA) hetzij lange (figuur 2A) of de korte as (figuur 2C). Rode kleur wordt gezien in real time en illustreert de stromingsrichting (weg van de aortaklep).
   2. Zorg ervoor dat de focus diepte (aangegeven door een gele pijlpunt aan de rechterkant van het beeldscherm), ligt in het centrum van de kransslagader.
   3. Zorg ervoor dat de gegevens worden opgenomen, met behulp van de cine-store-toets, op het hoogst mogelijke framerate (> 100 beelden / sec).
3. PW Doppler Imaging van SCA (Pulsed-Wave of PW-modus)
   1. Terwijl in kleur-Doppler-modus, klikt u op de PW sleutel tot op de kransslagader (Figuur 2, weergegeven in rood) brengen een geel-indicator lijn.
   2. Plaats de gelePW lijn in het midden van de kransslagader oog, onder een hoek die de gerichtheid van de stroming parallel. Let snelheidsmetingen sterk afhankelijk van de hoek van beeldverwerving.
   3. Pas de hoek van de stroming (PW hoek drukken) en monstervolume (SV-toets), zodanig dat de PW hoek sleutel is 60 ° of minder en monstervolume vangt stromen midden in het centrum van SCA.
   4. Gebruik cine opslag om de golfvormen die de snelheid van de coronaire stroming optimaal systole (S) en diastole (D) (Figuren 3A en 3B) geven vastleggen, met 1% en 2,5% isofluraan.

3. Gegevens Berekening en Analyse

1. Selecteer de snelheid tijdsintegraal (VTI) hulpmiddel om de piek systolische en diastolische snelheden van de in de figuren 3A en 3B beelden oplevert.
2. Bereken de coronaire doorstroming reserve-index (CFR) als de verhouding van hyperemic (2,5% isofluraan) maximale diastolische flage snelheid met de basislijn (1% isofluraan) maximale diastolische stroomsnelheid.
3. Bereken de S / D-verhouding als de piek systolische coronaire stroomsnelheid / maximale diastolische coronaire stroomsnelheid. Bepaal de verhouding bij aanvang (1% isofluraan) en hyperemie (2,5% isofluraan).
4. Raadpleeg de handleidingen van de fabrikant naar data-analyse uit te voeren met behulp van eigen software of verwijzen naar Cheng's Jupiter papier ² voor standaard hartfunctie parameters zoals FS, FAC, LVM,.

Resultaten

Van de 11 muizen die werden bestudeerd (banded, n = 8 en sham, n = 3) werden voldoende en reproduceerbare beelden verkregen door een enkele waarnemer op verschillende tijdstippen: bij aanvang (D-1), D2, D6 en D13 . Ook de stroomsnelheid bij de constrictieve plaats werd gemeten als 2225 ± 110,9 mm / s, in vergelijking met 277,5 ± 10,51 mm / s in de sham muizen op de dag na de operatie (p <0,05). De toename van de snelheid was de verificatie van de succesvolle oprichting van de druk overbelasting model. De SCA stroomsn...

Discussie

In deze ultrageluid gebaseerd onderzoek, werd niet-invasieve evaluatie van coronaire stroming reproduceerbaar onmiddellijk plaats, over dagen, in levende proefmuizen; voorts het protocol aangetoond potentieel kransslagader stoornis die in een vroeg stadium was en is geassocieerd met deficiëntie myocardiale perfusie detecteren. Deze methode zou uiteindelijk kunnen worden ingezet als klinisch hulpmiddel voor cardiovasculaire risicostratificatie en / of beoordelen van respons op therapeutische interventie.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Depilatory cream	Miltex, Inc.	Surgi-Prep	Toepassen 24 uur voorafgaand aan beeldvorming
Isofluraan	Baxter International Inc.	NDC 10019-773-40	2-3% voor inductie, en 1-1.5% voor onderhoud; hartslagen zullen worden gehandhaafd boven de 500 slagen per minuut
High Frequency Ultrasound	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	Vevo 2100
High-frequency Mechanical Transducer	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	MS250, MS550D, MS400