Methoden voor het karakteriseren van de co-ontwikkeling van biofilm en Habitat Heterogeniteit

Samenvatting

Biofilms hebben complexe interacties met hun omgeving. Om biofiel-omgevingsinteracties grondig te onderzoeken, presenteren we hier een reeks methoden om een heterogene chemische omgeving te creëren voor biofilmontwikkeling, om lokale stroomsnelheid te kwantificeren en om massatransport in en rond biofilmkolonies te analyseren.

Samenvatting

Biofilms zijn oppervlak bevestigd microbiële gemeenschappen die complexe structuren hebben en produceren aanzienlijke ruimtelijke heterogeniteit. Biofilm ontwikkeling wordt sterk gereguleerd door de omringende stroom en voedingswaarde milieu. Biofilm groei verhoogt ook de heterogeniteit van de lokale micro-omgeving door het genereren van complexe stroomvelden en stoftransport patronen. Om de ontwikkeling van heterogeniteit in biofilms en interacties tussen biofilms en hun lokale micro-leefgebied te onderzoeken, we groeiden mono-species biofilms van Pseudomonas aeruginosa en dual-species biofilms van P. aeruginosa en Escherichia coli onder nutritionele gradiënten in een microfluïdische stroomcel. Wij bieden gedetailleerde protocollen voor het creëren van voedingsstoffen gradiënten binnen de stroom cel en voor de teelt en het visualiseren van biofilm ontwikkeling onder deze omstandigheden. We ook aanwezig protocollen voor een reeks optische methoden ruimtelijke patronen kwantificeren biofilmstructuur, stromen distrimies dan biofilms, en massatransport rond en binnen de biofilm kolonies. Deze methoden ondersteunen uitgebreide onderzoeken van de co-ontwikkeling van biofilm en de habitat heterogeniteit.

Inleiding

Micro-organismen hechten aan oppervlakken en vormen biofilms - celaggregaten bevindt in een extracellulaire polymere matrix ^1. Biofilms gedragen zich heel anders uit individuele microbiële cellen, omdat biofilms hebben dramatische ruimtelijke heterogeniteit als gevolg van een combinatie van interne beperkingen transport van opgeloste stoffen en ruimtelijke variaties in de celstofwisseling ^2,3. Zuurstof en voedingsstoffen concentraties drastisch verlagen op het raakvlak van biofilm en omringende vloeistof en krijgen verder uitgeput binnen in de biofilm ^2. Ruimtelijke variaties in biofilm ademhaling en eiwitsynthese kan ook optreden als reactie op gelokaliseerde zuurstof en voedingsstoffen beschikbaarheid ^2.

In aquatische en bodem omgevingen, de meeste bacteriën wonen in biofilms. Natuurlijke biofilms uit te voeren belangrijke biogeochemische processen zoals fietsen koolstof en stikstof en het verminderen van metalen ^4,5. Klinisch, biofilmvorming is responsbaar voor langere pulmonale en urineweginfecties ^6. Biofilm geassocieerde infecties zijn zeer problematisch, omdat de cellen in biofilms hebben een extreem hoge weerstand tegen antimicrobiële middelen in vergelijking met hun planktonische tegenhangers ^6. Omdat biofilms zijn belangrijk in uiteenlopende situaties, is een aanzienlijke hoeveelheid onderzoek gericht op het begrijpen van de omgevingsfactoren die biofilm activiteiten en de ruimtelijke heterogeniteit in biofilms en het omliggende micro regelen.

Eerdere studies hebben aangetoond dat biofilm ontwikkeling sterk wordt gereguleerd door een aantal omgevingsfactoren: biofilms ontwikkelen verschillende morfologie onder verschillende stromingscondities; zuurstof en beschikbaarheid van voedingsstoffen invloed biofilm morfologie; en hydrodynamische shear stress invloed op de bevestiging van planktonische cellen aan oppervlakken en het detachement van de cellen van biofilms ^7-9. Verder externe stroming beïnvloedt de levering van substraten into en binnen biofilms ^10. De groei van biofilms verandert ook omringende fysische en chemische omstandigheden. Bijvoorbeeld biofilm groei leidt tot lokale uitputting van zuurstof en voedingsstoffen ^2; biofilms accumuleren anorganische en organische verbindingen uit de omgeving ^11; en biofilm clusters af te leiden stroom en toename oppervlakte wrijving ^12,13. Omdat biofilms interactie met hun omgeving in een zeer complexe manieren, is het essentieel om informatie over de biofilm eigenschappen en milieu-omstandigheden gelijktijdig te verkrijgen, en multi-disciplinaire aanpak moeten worden gebruikt om volledig te karakteriseren biofilm-omgeving interacties.

Hier presenteren we een reeks geïntegreerde methoden ruimtelijke patronen in microbiële groei in mono-soorten en dual-species biofilms karakteriseren onder een opgelegde voeding gradiënt, en de resulterende wijziging van de lokale chemische en vloeibare micro observeren. We sparst beschrijven het gebruik van een recent ontwikkelde dubbele inlaat microfluïdische stroom cel biofilmgroei observeren onder goed gedefinieerde chemische gradiënten. We demonstreren dan het gebruik van deze microfluïdische stroomcel de groei van beide soorten bacteriën, Pseudomonas aeruginosa en Escherichia coli, in biofilms observeren onder verschillende voedingsomstandigheden. We zien hoe in situ visualisatie van fluorescerende tracer propagatie in biofilm kolonies kunnen worden gebruikt om kwantitatief beoordelen patronen van stoftransport in biofilms. Tenslotte laten we zien hoe microschaal particle volgen velocimetry, uitgevoerd onder confocale microscopie kan worden gebruikt om locale stromingsveld verkrijgen rond de groeiende biofilms.

Protocol

1. Flow Cell Setup en Enting

. OPMERKING: Gebruik een dubbel-inlaat microfluïdische stroom cel in Song et al, 2014 ¹⁴ tot biofilms groeien. Deze stroom cel is in staat om goed gedefinieerde gladde chemische gradiënten creëren. De stroomcel ontwerp wordt getoond in figuur 1 en stroomcel fabricage is eerder beschreven Song et al., 2014 ^14. Hier detail we door gebruikmaking P. aeruginosa en E. coli biofilms te vormen, maar andere soorten kunnen ook geschikt zijn. We gebruikten P. aeruginosa PAO1- gfp, die constitutief brengt een groen fluorescerend eiwit (GFP) als modelorganisme voor biofilm ontwikkeling. Daarnaast gebruikten we E. coli DH5a naar mixed-species biofilms met P. vormen aeruginosa. P. aeruginosa en E. coli stammen werden gekweekt op LB-agarplaten.

1. Bereid de stroom cel met behulp van polydimethylsiloxaan (PDMS) gebonden aan eendekglaasje via zuurstofplasma behandeling zoals beschreven in ^14. De afmetingen van de stroomcel kamer zijn 23 mm x 13 mm x 0,24 mm (lengte x breedte x diepte).
2. Bereid gewijzigd FAB groeimedium ^15. Om biofilmgroei observeren onder een voedingswaarde gradiënt binnen de stroom cel, introduceren gewijzigd FAB medium ¹⁵ met 0,6 uM glucose in één inlaat en FAB medium invoeren, zonder dat koolstofbron door de andere inlaat. Filter-steriliseren (poriëngrootte = 0,2 pm) van de glucose-stockoplossing (60 mM) alvorens het aan het FAB medium. Ook autoclaaf de FAB medium met cyclus 1 (vloeistof, 15 min; 121 ° C, 17 psi) voor gebruik.
3. Steriliseren van de stroom systeem. Voorafgaand aan inoculatie autoclaaf de gehele stroombaan (gemiddeld flessen, buizen, bel vallen, stroom cellen) met cyclus 1, behalve de kunststof driewegkleppen (wegwerp en vooraf gesteriliseerde) stroomopwaarts van de stroomcel. (Drie manieren kleppen worden gebruikt voor het injecteren Cell Cultuur, fluorescerende tracer en microkraaltjes.) Om besmetting tijdens de montage te voorkomen, hebben betrekking op alle slangen en connector openingen met aluminiumfolie of autoclaafzakken voor het autoclaveren.
4. Sluit de stroom systeem. Monteer de componenten van de stroom celsysteem voorzichtig (zie Video stroomsysteem montage) en leveren groeimedium aan de stroomcel via een peristaltische pomp die precies regelt de stroomsnelheid.
5. Bereid celcultuur voor inenting door de overdracht van een kolonie van P. aeruginosa of E. coli van LB platen 3 ml LB bouillon en schud de cultuur O / N bij 225 rpm en 37 ° C. Verdun de O / N celkweken in 1 ml gesteriliseerd water tot een uiteindelijke _OD600 = 0,01 in het inoculum. (Cultuur en verdun de bacteriën in een laminaire stroming kap om besmetting te voorkomen.)
6. Voor de experimenten met gemengde species biofilms verdunnen twee bacterieculturen tot een verhouding van 1: 1 in 1 ml met een equivalente OD ₆₀₀ = 0,01 voor elke bacterie.
7. Inoculeer de stroom cel. Injecteer 1 ml van het inoculum aan de stroomcel toevoer van de driewegklep. Na de injectie onderbreken de stroom gedurende 1 uur om bacteriële cellen te hechten aan het dekglas. (Zorg ervoor dat de stroom cel wordt geplaatst met het dekglaasje kant naar beneden te laten opgeschort cellen om zich te vestigen op het dekglaasje.)
8. Na 1 uur hervat de stroom en pomp het groeimedium naar de stroomcel met een constante snelheid van 0,03 ml / min voor elke inlaat voor 3 dagen.

2. Kenmerkend Biofilm ontwikkeling in reactie op Nutrient Verlopen Met behulp van confocale microscopie

OPMERKING: P. aeruginosa kan worden afgebeeld met constitutief tot expressie gebracht GFP, maar E. coli in mixed-species biofilms moet worden afgebeeld door tegenkleuring.

1. Let op de 3-daagse biofilms met behulp van confocale microscopie. Voor de representatieve resultaten, observeren biofilms met een confocale microscoop met een 63x objectief. Voorafgaand aan de beeldvorming, markde dubbele inlaat stroom cel met een raster op de cover glas kant. (Het doel van dit netwerk is om de experimentator om de beeldvorming regio's te lokaliseren binnen de stroom cel kamer.)
2. Om tegenkleuring, verdunnen 10 ul van cel-permeant rode fluorescerende nucleïnezuur vlek, zoals groen fluorescerend nucleïnezuur vlek zoals STYO 62, stockoplossing (1 mM) in 990 pi gesteriliseerd water en dan langzaam te injecteren de verdunde vlek met behulp van een injectiespuit in de stroomcel kamer uit de stroomopwaartse driewegklep. Houd de doorstroomcel stagnerende en in het donker gedurende 30 min, vervolgens opnieuw de stroom te spoelen ongebonden kleurstof gedurende 15 min.
3. Voeren confocale beeldvorming. Activeer de 488 nm Argon laser voor excitatie en de uitstoot verzamelen kanalen voor GFP (500-535 nm) en nucleïnezuur vlek (voor groen fluorescerend nucleïnezuur vlek, 650-750 nm). Pas winsten en offsets voor beide kanalen om heldere en zuivere beelden te hebben. Selecteer xyz en gelijktijdige imaging-modus. Gebruik de z-bedieningsknop naar identify de onderkant en bovenkant van de biofilm op het veld. Stel de z-stap tot 0,5 urn voor het verkrijgen van een 3-D afbeelding stack. (Om een ​​hoge beeldkwaliteit te garanderen, gebruikt u een lijn gemiddeld vier voor het acquisitie.)
4. Om de ruimtelijke patronen van biofilm ontwikkeling binnen de stroomcel, stock biofilms kaart met drie of meer lengterichting (x) afstanden langs de stroomcel inlaat en drie dwarse (y) posities ten opzichte van de opgelegde nutritionele verloop, zoals in figuur 1 .

3. Kenmerkend Intern transport van opgeloste stoffen door injecties van Conservatieve TL Tracer

OPMERKING: Een conservatieve fluorescerende tracer, zoals Cy5, kan worden gebruikt om stoftransport patronen te detecteren binnen de biofilm.

1. Los Cy5 (Mono Reactive-NHS Ester) in water tot een uiteindelijke concentratie van 10 mg / ml als een voorraadoplossing. Bewaar de Cy5- voorraad oplossing in een -20 ° C vriezer.
   OPMERKING: Als Cy5- is licht-SENSITive, op te slaan, te verdunnen en injecteer Cy5 oplossingen in het donker.
2. Voorafgaand aan de injectie van de fluorescerende tracer, neem een ​​3-D afbeelding stapel van de 3-daagse biofilm met confocale microscopie (met een 63x objectief). (Wide gebieden van biofilm kolonies zijn ideaal voor tijdreeksen observaties kleurstof transport.) Kies Ook een z-vlak met goed gescheiden kolonies voor beeldvorming (zie figuur 5A).
3. Voor elk Cy5 injectie experiment, verdun 2 pi van de Cy5 voorraadoplossing in 998 pi gesteriliseerd water injectievloeistof met een Cy5 concentratie van 20 ug / ml verkregen.
4. Stop de pomp om de stroom onderbreken en injecteer het Cy5 oplossing in het stroomopwaartse deel van de stroomcel met een injectiespuit via de 3-wegklep. (Het is belangrijk om luchtbellen te voorkomen dat de stroombaan tijdens het injecteren. Bubble vallen moeten worden opengehouden gedurende het opnieuw injecteren.)
5. Na het injecteren van de Cy5 oplossing, sluit de zeepbel vallen, passen de 3-weg klep, en start depompen naar de geïnjecteerde Cy5 oplossing in de stroomcel leveren.
6. Schakel confocale imaging-modus om XYT. Activeren Cy5 en GFP-kanalen onder gelijktijdige imaging-modus. Pas confocale instellingen op Cy5- intensiteit (laser intensiteit, gain en offset) om te voorkomen dat het verzadigen van signalen, die van cruciaal belang voor de kwantificering. (Hoge temporele resolutie heeft de voorkeur voor het visualiseren van de kleurstofpenetratie. Echter, snel scannen vermindert de beeldkwaliteit.) Kies de juiste scansnelheid en lijn gemiddeld om de tijd resolutie van beeldvorming en de beeldkwaliteit in evenwicht te brengen. Voor dit protocol gebruiken een lijn gemiddelde van vier en een frame rate van 0,15 Hz.
7. Hervat de stroom naar Cy5 geven in de stroomcel (nog steeds bij een stroomsnelheid van 0,03 ml / min). Tegelijkertijd starten tijdreeksen confocale beeldvorming.
8. Kwantificeren Cy5- penetratie door radiaal gemiddeld Cy5- intensiteit binnen een 2-D ronde biofilm kolonie. Om gemiddeld eerst de rand van een biofilm cluster identificeren vervolgens een afstand kaart voor een 2-D gedeelte van de clusterEn tenslotte gemiddelde radiale patronen van Cy5 intensiteiten penetratie curve (zie figuur 6) te genereren.
   1. Om computationeel realiseren stap 3.8, gebruiken BioSPA (Biofilm Ruimtelijke Pattern Analysis) softwarepakket (ongepubliceerd, software en handleiding beschikbaar op aanvraag) of andere beeldanalyse programma.
   2. Om BioSPA gebruiken, eerst importeren een beeld geplaatst in BioSPA. Selecteer vervolgens de juiste drempel voor GFP en Cy5 kanalen om binaire beelden te maken. In de analyse / berekening menu, selecteer Geavanceerde Analyse en vervolgens Diffusion Analysis. Gebruik de GFP kanaal naar de rand van een cluster definiëren en gebruik het vormgereedschap een cluster als het gebied van belang (ROI) te selecteren.
   3. Dubbelklik op de geselecteerde biofilm cluster diffusie analyses uit te voeren. Sla de verspreiding analyseresultaten en kalibreren Cy5 intensiteit Cy5 concentratie met behulp van een kalibratiecurve.
      1. Om Cy5- concentratie ijklijn opstellen, meten Cy5- intensiteiten over een Cy5 concentration gradiënt onder confocale microscopie. (Cy5 intensiteit en concentratie hebben een lineair verband.)

4. Het karakteriseren van de Omringende Flow Field door Tracking fluorescerende deeltjes

OPMERKING: Fluorescerende deeltjes, zoals fluorescerende microbolletjes kunnen worden gebruikt om het stromingsveld karakteriseren om biofilms. Stromingsveld rond biofilms kan worden berekend vanaf het moment-serie observaties van deeltje posities met behulp van Particle Tracking velocimetry software. De hier getoonde resultaten werden verkregen met de Streams 2.02 softwarepakket ¹⁶ (software te downloaden en gebruikershandleiding verkrijgbaar bij http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml ).

1. Verdun de fluorescerende microbolletjes (diameter ~ 1 m) in gesteriliseerd water tot een uiteindelijke vaste concentratie van 0,2% en een eindvolume van 0,5 ml. Vortex om ervoor te zorgen dat de microbolletjeszijn goed verspreid.
2. Injecteren en leveren de verdunde fluorescerende microbolletjes in de stroom cel volgende procedures uit stappen 3,3-3,5. Zodat een nauwkeurig volgen van de deeltjes pad gebruiken relatief lage stroomsnelheid (0,01 ml / uur voor het deeltje traceerresultaten in dit document).
3. Schakel confocale instellingen modus XYT naar deeltje beweging volgen op een z-slice en neem de tijd-serie beelden. (Een frame rate van 1 Hz gebruikt voor representatieve resultaten in deze paper.) Herhaal deeltje injectie en het op verschillende plaatsen z 3-D stromingsveld genereren.
4. Pre-proces van de tijdreeksen confocale beelden door het aftrekken van de achtergrond fluorescentie signaal (het signaal in de eerste verworven afbeelding van het beeld set) met behulp van ImageJ (software te downloaden en handleiding beschikbaar op http://imagej.nih.gov/ij/ ) of andere programma's.
5. In ImageJ, open de eerste afbeelding van een afbeelding set en importeer de afbeelding set. Onder Proces / Image Calculator, aftrekken van de eerste afbeelding uit de afbeelding set. Sla de pre-bewerkte afbeelding set.
6. Om stroom vectoren, import tijdreeksen confocale beelden in Streams 2,02 berekenen. Onder "Open proces view", selecteren en uitvoeren "Identificeer deeltjes". Gebruik de juiste drempel om deeltjes te identificeren. Gebruik 0,5 en 5 micrometer als minimale en maximale diameter van drempels voor 1 micrometer deeltjes.
7. Vervolgens onder "Open proces view", selecteren en uitvoeren "PTV analyse pijplijn" om deeltje paden te genereren. Controleer het deeltje paden om te zien of ze vertegenwoordigen deeltje beweging. Tot slot, selecteren en uitvoeren "Create snelheidsveld" om een ​​stroom vector kaart te genereren.

Resultaten

De dubbele inlaat microfluidic stroomcel maakt waarneming van biofilm groei onder een welbepaalde chemische gradiënt gevormd door het mengen van twee oplossingen binnen de stromingskamer. De resulterende chemische gradiënt werd vroeger waargenomen door kleurstof injectie en in detail gekarakteriseerd door Song et al. ^14. Smooth concentratie gradiënten werden gevormd in de dwarsrichting, zoals getoond in figuur 1. Het concentratieprofiel was steil nabij de inlaat heb downstream ontspa...

Discussie

We toonden een suite van methoden om drie belangrijke biofilm-omgeving interacties te karakteriseren: biofilm reactie op chemische gradiënten, effecten van biofilm groei op de omliggende stroom micromilieu, en biofilm heterogeniteit als gevolg van interne beperkingen transport.

Wij toonden eerst het gebruik van een nieuwe microfluidic stroomcel een goed gedefinieerde chemische helling biofilm ontwikkeling leggen. Een goed gedefinieerde chemische gradiënt binnen de stroomcel genereren, is het...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Peristaltische pomp	Gilson	Miniplus 3	Flow cell setup en inoculatie
Pompslang 0,50 mm OVC, Oranje/Geel	Gilson	F117934	Flow cell setup en inoculatie
Driewegkraan met draaibare mannelijke Luer-lock	Smiths Medical	MX9311L	Flow cell setup en inoculatie
Sylgard 184 Solar Cell Encapsulation voor het maken van zonnepanelen	ML Solar LLC		Flow cell setup en inoculatie
Pyrex middelgrote fles, 1 L, GL45	VWR	16157-191	Flow cell setup en inoculatie
C-FLEX slang	Cole-Parmer	06422-02	Flow cell setup en inoculatie
1 ml TB-slang	BD	309659	Flow cell setup en inoculatie
Polymeerslang	IDEX	1520G	Flow cell setup en inoculatie
Steriele Intramedic Luer Stub Adapter	Clay Adams	427564	Flow cell setup en inoculatie
PrecisionGlide-naald	BD	305195	Flow cell setup en inoculatie
Spectrofotometer	HACH		Flow cell setup en inoculatie
Spuitfilters - steriele (0,2 μm)	Fisherbrand	09-719A	Flow cell setup en inoculatie
MAXQ-schuddelaar	Thermo Scientific		Flow cell setup en inoculatie
Ammoniumsulfaat	Sigma Aldrich	A4418	Groeimedia
Dinatriumfosfaat anhydrisch	Sigma Aldrich	RES20908-A7	Groeimedia
Monobasisch kaliumfosfaat	Sigma Aldrich	P5655	Groeimedia
Natriumchloride	Sigma Aldrich	S7653	Groeimedia
Magnesiumchloride	Sigma Aldrich	M8266	Groeimedia
Calciumchloride	Sigma Aldrich	C5670	Groeimedia
Calciumsulfaat dihydraat	Sigma Aldrich	C3771	Groeimedia
IJzer(II)sulfaat heptahydraat	Sigma Aldrich	215422	Groeimedia
Mangaan(II)sulfaat monohydraat	Sigma Aldrich	M7634	Groeimedia
Koper(II)sulfaat	Sigma Aldrich	451657	Groeimedia
Zinksulfaat heptahydraat	Sigma Aldrich	Z0251	Groeimedia
Kobalt(II)sulfaat heptahydraat	Sigma Aldrich	C6768	Groeimedia
Natriummolybdaat	Sigma Aldrich	243655	Groeimedia
Boorzuur	Sigma Aldrich	B6768	Groeimedia
Dextrose	Sigma Aldrich	D9434	Groeimedia
Luria Bertani Broth	Sigma Aldrich	L3022	Groeimedia
TCS SP2 Confocal Microscopie	Leica		Fluorescente beeldvorming
SYTO 62	Life Technology	S11344	Fluorescente beeldvorming
Cy5	GE Healthcare Life Sciences	PA15100	Fluorescente beeldvorming
Rode fluorescente (580/605) FluoSphere	Life Technology	F-8801	Fluorescente beeldvorming
BioSPA	Packman Lab		Beeldverwerking
ImageJ	NIH		Beeldverwerking
Volocity	PerkinElmer		Beeldverwerking
Streams 2.02	University of Cantebury		Beeldverwerking