Het doel van dit protocol is om borsttumorigenesis te bestuderen. Met deze techniek worden muisborsttumoren verwijderd en worden primaire cellen bereid uit tumoren. Er is een longextractieprotocol opgenomen voor het bestuderen van longmetastasen. Verder is er nog een protocol opgenomen voor het analyseren van muis embryonale fibroblasten van het muizenembryo.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Primaire tumor en MEF Cell Isolation om te studeren longmetastase
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Bij tumorvorming in de borst vormt het uitzaaiingsstadium van de ziekte de grootste bedreiging voor de getroffen persoon. Normale borstcellen met veranderde genotypen hebben nu de mogelijkheid om andere weefsels binnen te dringen en daar te overleven. In dit protocol worden muisborsttumoren verwijderd en primaire cellen worden bereid uit tumoren. De cellen die uit deze procedure zijn geïsoleerd, zijn vervolgens beschikbaar voor genprofileringsexperimenten. Voor succesvolle metastase moeten deze cellen in staat zijn om intravasatie te ondergaan, te overleven in de circulatie, extravasatie naar verre organen te ondergaan en te overleven in dat nieuwe orgaansysteem. De longen zijn het typische doelwit van metastase van borstkanker. Er is een reeks genen ontdekt die de selectiviteit van metastase naar de long mediëren. Hier beschrijven we een methode om longmetastase te bestuderen vanuit een genetisch gemodificeerde muismodel. Verder is er nog een protocol inbegrepen voor het analyseren van muis embryonale fibroblasten (MEF's) van het muis embryo. MEF-cellen van hetzelfde diertype geven een aanwijzing voor genexpressie van niet-kankercellen. Samen zijn deze technieken nuttig bij het bestuderen van muisborsttumorigenese, de bijbehorende signaalmechanismen en paden van de abnormaliteiten in embryo's.
Inleiding
Metastase is de laatste stap in de progressie van borstkanker 1. Het omvat een reeks stappen waarbij kwaadaardige cellen vrijkomen van de primaire tumor en worden verspreid naar andere organen 2. De cellen moeten in staat zijn om intravasatie te ondergaan, te overleven in circulatie, extravasatie naar verre organen en te overleven in dat nieuwe orgaansysteem 3. Elke stap in tumorigenese wordt strikt gecontroleerd door cellen door verschillende genetische en epigenetische veranderingen 4. Om de mechanismen van borstkankertumorigenese te bestuderen, zijn muismodelsystemen gebruikt vanwege hun korte levensduur, kleine omvang en....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle muis experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met protocollen door de Institutional Animal Care en gebruik Commissies (IACUC) van LSU School of Medicine goedgekeurd. Alle instrumenten moeten voorafgaand aan de dissectie worden geautoclaveerd.
1. Voorbereiding van de primaire cellen van Mouse borsttumoren
- Gebruik een muismodel dat genetisch werd ontworpen met de muis borsttumorvirus Polyoma Midden T-antigeen (MMTV-PyMT-transgene muis), die spontaan ontwikkelen tumoren zoals eerder beschreven 6.
- Offer muizen met isofluraan (99,9%) en spuit 75% ethanol in een steriele omgeving (figuur 1A) waarborgen.....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De tumorprogressie moment waarop het dier offeren hangt af van de studie en IACUC richtlijnen. In figuur 1A, 100 dagen oud C57BL / 6 muis met de muis borsttumorvirus Polyoma Midden T-antigeen (MMTV-PyMT) werd geofferd op drie maanden. De huid werd geopend uit het gebied van de urethra opening aan de hals van de schaar en de huid was vastgepind om gemakkelijke toegang tot organen figuur 1B laten. Hierdoor konden gemakkelijk toegang tot de tumor die werd verkregen in figuur 1C.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol is voor het isoleren van primaire cellen van een nieuwe muis tumor. Lysaten bereid uit deze werkwijze bruikbaar voor eiwitten, DNA en RNA-analyse. Kankercellen uit de primaire borsttumor metastaseren vaak naar de hersenen, longen en botten 1. Inbegrepen is een techniek om de long voor de detectie van metastasen extraheren. Kleuring van de long met een inktvlek zal voor de visualisatie van tumoren zoals getoond in figuur 2B. Vaststelling van de longen in Z-fix oplossing zal ons to.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen onthullingen.
Dankbetuigingen
We willen NIH, LACaTS en Ochsner Clinic Foundation bedanken voor de financiële steun.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| DMEM | HyClone | SH30243.01 | Bewaar bij 4 °C |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life technologies | 25300-062 | Bewaar bij – 20 °C |
| Collagenase Type IV | Sigma-Aldrich | C5138 | Bewaar bij – 20 °C |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | Bewaar bij – 20 °C |
| Pen Strep | Life technologies | 15140-122 | Bewaar bij 4 °C |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-106 | Bewaar bij – 80 °C |
| Z-fix | ANATECH | #174 | Bewaar bij RT |
| India Ink | Yasutomo | Bewaar bij RT | |
| AERRANE (Isoflurane) | Baxter | NDC 10019-773-60 | Bewaar bij RT |
| Ethanol | EMD | AX0441-3 | Bewaar bij RT |
Referenties
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Natur. 436 (7050), 518-524 (2005).
- Poste, G., Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis. Natur. 283 (5743), 139-146 (1980).
- Wan, L.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
