Het doel van dit protocol is om borsttumorigenesis te bestuderen. Met deze techniek worden muisborsttumoren verwijderd en worden primaire cellen bereid uit tumoren. Er is een longextractieprotocol opgenomen voor het bestuderen van longmetastasen. Verder is er nog een protocol opgenomen voor het analyseren van muis embryonale fibroblasten van het muizenembryo.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Primaire tumor en MEF Cell Isolation om te studeren longmetastase
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Bij tumorvorming in de borst vormt het uitzaaiingsstadium van de ziekte de grootste bedreiging voor de getroffen persoon. Normale borstcellen met veranderde genotypen hebben nu de mogelijkheid om andere weefsels binnen te dringen en daar te overleven. In dit protocol worden muisborsttumoren verwijderd en primaire cellen worden bereid uit tumoren. De cellen die uit deze procedure zijn geïsoleerd, zijn vervolgens beschikbaar voor genprofileringsexperimenten. Voor succesvolle metastase moeten deze cellen in staat zijn om intravasatie te ondergaan, te overleven in de circulatie, extravasatie naar verre organen te ondergaan en te overleven in dat nieuwe orgaansysteem. De longen zijn het typische doelwit van metastase van borstkanker. Er is een reeks genen ontdekt die de selectiviteit van metastase naar de long mediëren. Hier beschrijven we een methode om longmetastase te bestuderen vanuit een genetisch gemodificeerde muismodel. Verder is er nog een protocol inbegrepen voor het analyseren van muis embryonale fibroblasten (MEF's) van het muis embryo. MEF-cellen van hetzelfde diertype geven een aanwijzing voor genexpressie van niet-kankercellen. Samen zijn deze technieken nuttig bij het bestuderen van muisborsttumorigenese, de bijbehorende signaalmechanismen en paden van de abnormaliteiten in embryo's.
Inleiding
Metastase is de laatste stap in de progressie van borstkanker 1. Het omvat een reeks stappen waarbij kwaadaardige cellen vrijkomen van de primaire tumor en worden verspreid naar andere organen 2. De cellen moeten in staat zijn om intravasatie te ondergaan, te overleven in circulatie, extravasatie naar verre organen en te overleven in dat nieuwe orgaansysteem 3. Elke stap in tumorigenese wordt strikt gecontroleerd door cellen door verschillende genetische en epigenetische veranderingen 4. Om de mechanismen van borstkankertumorigenese te bestuderen, zijn muismodelsystemen gebruikt vanwege hun korte levensduur, kleine omvang en snelle voortplantingstijd. Enkele grote voordelen van het gebruik van muismodellen in kankeronderzoek zijn de moleculaire en fysiologische overeenkomsten die ze delen met mensen 5.
Gevestigde muis- en menselijke cellijnen zijn uitgebreid gebruikt in borstkankeronderzoek. Hoewel we enige informatie over de stappen in metastase kunnen verkrijgen met behulp van deze cellen, zullen genetisch gemanipuleerde diermodellen met tumorsuppressoren/oncogenen veel meer informatie geven over tumorontwikkeling en metastase vanaf het embryonale stadium. Dus, met deze muismodellen kunnen we genetische en ontwikkelingsregulatie van tumorgroei verkrijgen. Bovendien speelt het tumormicro-omgeving ook een belangrijke rol in de genexpressie van tumorcellen en het kan moeilijk zijn om hetzelfde scenario na te bootsen met studies met gevestigde cellijnen. Primaire menselijke mammaire tumoren kunnen ook worden gebruikt om muis mammaire tumorigenese te bestuderen. Het grootste nadeel van het gebruik van geïsoleerde borsttumoren is dat deze nieuw geïmplanteerde tumor niet de vaat- en lymfweefsel van de muis heeft. Terwijl de genetische muismodelsystemen voor het bestuderen van mammaire tumorigenese ons in staat stellen de stappen van metastase te volgen, het tumormicro-omgeving te analyseren en toegang tot het hele lichaam 5.
Het algemene doel van dit protocol is om borsttumorigenese bij muizen te bestuderen. Het is bekend dat borstkanker zich meestal verspreidt naar de hersenen, long en bot. Dit protocol maakt het mogelijk om primaire mammaire tumorcellen te isoleren, evenals borstkankermetastase naar de long te bestuderen. Bovendien is een ander protocol voor het analyseren van muis embryonale fibroblasten (MEF's) uit het muis embryo opgenomen. Samen zijn deze technieken nuttig bij het bestuderen van muis mammaire tumorigenese.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle muis experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met protocollen door de Institutional Animal Care en gebruik Commissies (IACUC) van LSU School of Medicine goedgekeurd. Alle instrumenten moeten voorafgaand aan de dissectie worden geautoclaveerd.
1. Voorbereiding van de primaire cellen van Mouse borsttumoren
- Gebruik een muismodel dat genetisch werd ontworpen met de muis borsttumorvirus Polyoma Midden T-antigeen (MMTV-PyMT-transgene muis), die spontaan ontwikkelen tumoren zoals eerder beschreven 6.
- Offer muizen met isofluraan (99,9%) en spuit 75% ethanol in een steriele omgeving (figuur 1A) waarborgen.
- Open de huid ter plaatse van de urethrale opening aan de hals met een schaar. Speld de huid naar een gemakkelijke toegang tot organen (Figuur 1B) mogelijk te maken.
- Isoleer de borstklier tumor en was met koude steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) (pH 7,4) (Figuur 1C).
- Breng de tumoreen steriele 10cm weefselkweek plaat en hak het met een steriel scheermesje en schaar om ongeveer 1 mm 3 stuks. Daaropvolgende stappen moeten worden uitgevoerd in een steriele laminaire stroming kap.
- Incubeer de gehakte tumorweefsel met collagenase opgelost in serumvrij DMEM medium bij een eindconcentratie van 1 mg / ml op een rocker gedurende 2 uur bij 37 ° C. Centrifugeer de suspensie tumorweefsel gedurende 3 minuten bij 200 x g.
OPMERKING: De collagenase incubatie essentieel voor enzymatische dissociatie van het weefsel. - Verwijder het supernatant en was het neerslag 3 maal met PBS (pH 7,4) door centrifugeren gedurende 3 min bij 200 x g. Na de laatste wasbeurt, giet het supernatant.
- Resuspendeer het weefsel met 2 ml trypsine EDTA gedurende 5 minuten bij 37 ° C onder Tuimelschijfmeter. Centrifugeer de schorsing gedurende 3 min bij 200 xg en herhaal de wasbeurten.
- Resuspendeer het weefsel pellet in normale groei medium (DMEM, 10% FBS, 2X pen / strep) op een 10cm plaat. Veranderingde media dagelijks gedurende de volgende 3 dagen. Kweekcellen tot het gewenste aantal cellen is verkregen.
OPMERKING: Ongeveer 1x10 7 cellen worden geïsoleerd van deze procedure. Andere muizen mammaire tumorigenese modellen, zoals MMTV-Neu, geven lagere opbrengst aan cellen in vergelijking met MMTV-PyMT. Bij gebruik van modellen met een lagere opbrengst te produceren, is het nuttig om te beginnen met een groter tumor en kweekcellen langer.
2. Mouse Lung Extraction te visualiseren longmetastase
- Voorafgaand aan long extractie, verwijder de lever en het middenrif. Verdrijven de ribben zonder de longen.
- Met een fijne schaar, opent het bovenste gedeelte van de trachea die dichter bij de halsader.
- Met behulp van een catheter, injecteert een middel zoals 1 ml Z-fix en India inkt door de luchtpijp in de longen (figuur 2A) vullen. Het insluiten Z-fix Longen in paraffine.
- De-vlek de longen geïnjecteerd met Oost-Indische inkt in Fekete's oplossing(100 ml 70% alcohol, 10 ml 10% gebufferde formaline en 5 ml ijsazijn) gedurende 5 min. Definieer tumor knobbeltjes op secundaire locaties met een ≥ 0,5 mm in diameter, bepalen de knobbeltjes als metastase.
LET OP: Door de bronchiën en bronchiole blokkade door de tumor, kunnen tumoren niet absorberen 15% Oost-Indische inkt, en dus normaal longweefsel zal zijn in het zwart, en tumoren zal worden in witte kleur 7. Dit visualisatie van afzonderlijke tumoren (figuur 2B) toe.
3. Voorbereiden van muis embryonale fibroblasten (MEF) van muizenembryo's
- Offer zwangere muizen met isofluraan (99,9%) en spuit 75% ethanol om een steriele omgeving te verzekeren.
- Open de huid ter plaatse van de urethrale opening aan de hals met een schaar en isoleer de embryo's uit de uterus.
- Wees voorzichtig niet om de embryo's te storen bij het openen van de huid.
- Verwijder de baarmoederhoorns en spoel ze in koud steRILE PBS (pH 7,4).
- Scheid het embryo uit de placenta zeer zorgvuldig en plaats embryo's in een 10cm plaat met ijskoud PBS (pH 7,4).
- Verwijder de kop, lever en darm van het embryo en plaats het resterende deel in een 12 well weefselkweek plaat met PBS (pH 7,4).
- Breng de embryo lichaam een 12 wells plaat met trypsine EDTA en in kleine stukjes (~ 1 mm 3) met een steriele scheermesje en schaar. Incubeer het gehakselde materiaal met 5 ml trypsine EDTA gedurende 5 minuten bij 37 ° C.
- Inactiveer trypsine door toevoeging van 1 ml foetaal runderserum (FBS) met de gehakte embryo. Centrifugeer de suspensie bij 200 xg snelheid gedurende 10 minuten, verwijder het supernatant, resuspendeer de pellet met 1 ml warm DMEM medium geheel overgaat de inhoudsopgave voor een 10cm schotel met 10 ml DMEM (met 20% FBS en 2X penicilline / streptomycine ).
- Verander het medium elke dag gedurende twee dagen. Kweken van de cellen tot de gewenste cellnummer bereikt.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De tumorprogressie moment waarop het dier offeren hangt af van de studie en IACUC richtlijnen. In figuur 1A, 100 dagen oud C57BL / 6 muis met de muis borsttumorvirus Polyoma Midden T-antigeen (MMTV-PyMT) werd geofferd op drie maanden. De huid werd geopend uit het gebied van de urethra opening aan de hals van de schaar en de huid was vastgepind om gemakkelijke toegang tot organen figuur 1B laten. Hierdoor konden gemakkelijk toegang tot de tumor die werd verkregen in figuur 1C.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol is voor het isoleren van primaire cellen van een nieuwe muis tumor. Lysaten bereid uit deze werkwijze bruikbaar voor eiwitten, DNA en RNA-analyse. Kankercellen uit de primaire borsttumor metastaseren vaak naar de hersenen, longen en botten 1. Inbegrepen is een techniek om de long voor de detectie van metastasen extraheren. Kleuring van de long met een inktvlek zal voor de visualisatie van tumoren zoals getoond in figuur 2B. Vaststelling van de longen in Z-fix oplossing zal ons to...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen onthullingen.
Dankbetuigingen
We willen NIH, LACaTS en Ochsner Clinic Foundation bedanken voor de financiële steun.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| DMEM | HyClone | SH30243.01 | Bewaar bij 4 °C |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life technologies | 25300-062 | Bewaar bij – 20 °C |
| Collagenase Type IV | Sigma-Aldrich | C5138 | Bewaar bij – 20 °C |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | Bewaar bij – 20 °C |
| Pen Strep | Life technologies | 15140-122 | Bewaar bij 4 °C |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-106 | Bewaar bij – 80 °C |
| Z-fix | ANATECH | #174 | Bewaar bij RT |
| India Ink | Yasutomo | Bewaar bij RT | |
| AERRANE (Isoflurane) | Baxter | NDC 10019-773-60 | Bewaar bij RT |
| Ethanol | EMD | AX0441-3 | Bewaar bij RT |
Referenties
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Natur. 436 (7050), 518-524 (2005).
- Poste, G., Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis. Natur. 283 (5743), 139-146 (1980).
- Wan, L. Tumor Metastasis Moving New Biological Insights into the Clinic. Nat Med. 19 (11), 1450-1464 (2013).
- Bergers, G., Benjamin, L. E. Tumorigenesis and the angiogenic switch. Nat Rev Cancer. 3 (6), 401-410 (2003).
- Frese, K. K., Tuveson, D. A. Maximizing mouse cancer models. Nat Rev Cancer. 7 (9), 654-658 (2007).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Mol Cell Biol. 12 (3), 954-961 (1992).
- Wexler, H. Accurate Identification of Experimental Pulmonary Metastases. J Natl Cancer Inst. 36 (4), 641-645 (1966).
- Boczkowski, D., Nair, S. K., Nam, J. H., Lyerly, H. K., Gilboa, E. Induction of tumor immunity and cytotoxic T lymphocyte responses using dendritic cells transfected with messenger RNA amplified from tumor cells. Cancer Res. 60 (4), 1028-1034 (2000).
- Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nat Rev Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).
- Watts, A. M., Kennedy, R. C. Quantitation of Tumor Foci in an Experimental Murine Tumor Model Using Computer-Assisted Video Imaging. Anal Bioche. 256 (2), 217-219 (1998).
- Rosenberg, S. A., et al. Regression of Established Pulmonary Metastases and Subcutaneous Tumor Mediated by the Systemic Administration of High-Dose Recombinant Interleukin 2. J Exp Me. 161 (5), 1169-1188 (1985).
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Re. 8 (4), 212(2006).
- Veer, L., et al. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature. 415 (6871), 530-536 (2002).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
