Gedroogde bloed vlekken - voorbereiden en verwerken voor gebruik in immunoassay en moleculaire technieken

Samenvatting

De voorbereiding en de verwerking van gedroogd bloed vlekken (DBS) voor hun per slot van rekening zijn nog steeds slecht gestandaardiseerd voor de meeste diagnostische toepassingen. Om te overwinnen deze tekortkoming, is een uitgebreide stapsgewijze protocol voorgesteld en vervolgens geëvalueerd ten aanzien van de doeltreffendheid ervan voor het detecteren van merkers van virale infecties.

Samenvatting

Het idee van het verzamelen van bloed op een kaart van papier en vervolgens met behulp van de gedroogde bloed vlekken (DBS) voor diagnostische doeleinden is een eeuw geleden ontstaan. Sindsdien DBS testen voor decennia heeft bleven voornamelijk toegespitst op de diagnose van infectieziekten met name in resource-beperkte instellingen of de systematische screening van pasgeborenen voor erfelijke metabole aandoeningen en enige onlangs hebben een verscheidenheid van nieuwe en innovatieve DBS toepassingen begonnen te ontstaan. Jarenlang werden vooraf analytische variabelen alleen ten onrechte beschouwd als op het gebied van het testen van de DBS en zelfs vandaag de dag, met uitzondering van pasgeboren screening, de gehele vooraf analytische fase, die bestaat uit de voorbereiding en verwerking van DBS voor hun uiteindelijk is niet gestandaardiseerd. Gezien deze achtergrond, wordt een uitgebreide stapsgewijze protocol, waarin al de essentiële fasen, voorgesteld, dat wil zeggen, de inzameling van bloed; voorbereiding van bloed vlekken; drogen van bloed vlekken; opslag en vervoer van DBS; elutie van DBS, en ten slotte analyses van DBS eluaten. De doeltreffendheid van dit protocol werd het eerst geëvalueerd met 1762 gekoppelde serum/DBS paren voor het opsporen van de markers van hepatitis B-virus, hepatitis C-virus en humaan immunodeficiëntie virusinfecties op een geautomatiseerde analytische platform. In een tweede stap, werd het protocol gebruikt tijdens een pilot-studie, die werd uitgevoerd op actieve drugsgebruikers in de Duitse steden van Berlijn en Essen.

Inleiding

Het idee van het gebruik van bloed, verzameld op een papieren kaartje gemaakt van cellulose wordt toegeschreven aan Ivar Christian Bang (1869 – 1918), de vader van de moderne klinische Microanalyse^{1, 2}. In 1913, bepaald Bang glucose uit eluaten van gedroogde bloed vlekken (DBS)³ en later ook uitgevoerd stikstof metingen met behulp van de Kjeldahl-methode met deze filtreerpapier techniek². Vervolgens verschillende onderzoekers gemeld op het gebruik van DBS voor serologisch onderzoek om de diagnose van syfilis². Zoals vroeg in 1924, Chapman de voordelen van DBS testen samengevat wanneer hij met name benadrukte vier items, die vandaag nog steeds geldig zijn: (1) in vergelijking met conventionele Venapunctie, minder bloed volume is vereist en dit feit was belangrijkste in pediatric diagnostiek; (2) de bloedinzameling is eenvoudig, niet invasieve en goedkoop; (3) het risico van bacteriële besmetting of hemolyse is minimaal; en (4) DBS kan worden gehandhaafd voor lange periodes met bijna geen verslechtering van de analyten^{2, 4}. Naast het gebruik ervan bij het testen op syfilis, verder vroege toepassingen van de techniek van de DBS opgenomen, bijvoorbeeldde opsporing van antilichamen tegen mazelen, bof, poliovirus, parainfluenza virus en respiratoir syncytieel virus (RSV) in 1953², de identificatie van Shigella in ontlasting gedroogd op filterpapier en per reguliere post verzonden vanuit Indonesië naar Leiden in Nederland alsmede de opsporing van antilichamen tegen Schistosoma in DBS in endemische gebieden genomen en geanalyseerd van meer dan drie maanden later⁵ . In 1963, vijftig jaar na Bang de oorspronkelijke mededeling^{2, 6}, Guthrie uiteindelijk gepubliceerd zijn beroemde methode voor de diagnose van fenylketonurie van DBS verkregen door de prik van een hiel van pasgeborenen^{7, 8}.

Hoewel vanaf dat moment, DBS werden beschouwd als een algemeen toepasselijke methode voor het verzamelen, opslaan, vervoeren en analyseren van allerlei menselijke lichaamsvochten⁵, het gebruik ervan in diagnostiek bleven voornamelijk gericht op de diagnose van infecties met name in de resource-beperkte instellingen en de systematische screening van pasgeborenen voor erfelijke stofwisselingsziekten voor decennia^{9, 10}. Sinds 2005, hebben een scala aan nieuwe en innovatieve toepassingen van DBS echter begonnen te ontstaan. Dit resulteerde in een bijna exponentiële toename van het aantal respectieve wetenschappelijke publicaties over DBS van ongeveer 50 naar bijna 450 per jaar op dit moment. De opkomende toepassingen behoren tot verschillende gebieden zoals toxicologisch - en farmacokinetische studies, metabole profilering, therapeutische drug controle, forensische toxicologie, of effecten van milieuverontreiniging control^{10, 11}.

DBS testen dus, heeft een triomftocht door klinisch laboratorium diagnostiek in de afgelopen 100 jaar². Zoals in klinische chemie¹², evenwel waren tijdens deze Mars vooraf analytische variabelen niet voldoende geacht voor vele jaren. Inderdaad, zelfs vandaag de dag, na deze vooraanstaande activiteiten als de CDC's filtreerpapier evaluatie project¹³ of de formulering van een nationale norm voor bloedinzameling op filterpapier in het kader van pasgeboren screening¹⁴, de vooraf analytische fase is nog steeds grotendeels ondergewaardeerd in de meeste van de andere velden, waarin het testen van de DBS toegepaste^{5, 10 is}.

Gezien deze achtergrond, een uitgebreide stapsgewijze protocol^14-16 voor gebruik in immunoassay en moleculaire technieken, waarin alle essentiële stappen, wordt voorgesteld voor de voorbereiding en verwerking van DBS in de volgende mededeling: (1) collectie van bloed; (2) voorbereiding van bloed vlekken; (3) drogen van bloed vlekken; (4) de opslag en het vervoer; (5) de elutie van DBS; en tot slot (6) analyses van DBS eluaten. De effectiviteit van het protocol werd eerst geëvalueerd met 1762 gekoppelde serum/DBS paren voor het opsporen van hepatitis B virus (HBV) surface antigeen (HBsAg), antistoffen tegen HBV core-antigeen (anti-HBc), antistoffen tegen HBV-surface antigeen (anti-HBs), HBV-DNA, antilichamen het hepatitis C-virus (HCV) (anti-HCV), HCV-RNA en humaan immunodeficiëntie virus (HIV) 1-p24-antigeen/anti-HIV 1/2 met een volledig geautomatiseerde platform of gevoelige kwalitatieve nucleic acid tests. ¹⁷. in een tweede stap, het protocol werd gebruikt in de pilot-studie "Drugs en chronische infectieziekten" ("DRUCK studie") die werd uitgevoerd door het Robert Koch Instituut in nauwe samenwerking met het nationaal referentiecentrum voor Hepatitis C in actieve drugsgebruikers in het Duitse steden van Berlijn en Essen¹⁸.

Protocol

Aangezien het protocol is ontworpen voor gebruik in de medische diagnostiek, moet de toepassing ervan voldoen aan de beginselen van de verklaring van Helsinki-¹⁹. Voor het eerste deel van de resultaten gepresenteerd in deze mededeling, zowel een afzonderlijke overeenkomst door de patiënten en goedkeuring door een ethische Commissie leek te zijn overbodig om twee redenen: (1) "Upon toelating" te Essen universitair ziekenhuis, "elke patiënt biedt schriftelijke toestemming alle nodige biochemische, bacteriologische en virologische onderzoeken." ¹⁷ (2) "alle monsters in de evaluatie van de DBS testen gebruikt werden verzonden naar de Instituut voor virologie in het proces van routine klinische diagnostiek. Dus, geen van de specimens specifiek voor het doel van de studie was verzameld, niet een enkele extra Venapunctie werd uitgevoerd en geen van de materialen was getest voor elke parameter die niet worden vereist door de artsen in het kader van de normale diagnostische werk-up." ¹⁷ de studie "Drugs en chronische infectieziekten" (DRUCK studie")¹⁸, waarin DBS testen eindelijk gewend was in het Duitse steden van Berlijn en Essen evalueren van mensen die actief het injecteren van drugs, is goedgekeurd door de federale commissaris voor gegevens Bescherming en vrijheid van informatie (Berlijn, Duitsland) en ook door de ethische commissie van de medische universiteit Charité, (Berlijn, Duitsland).

1. verzameling van bloed

1. Venapunctie^{14, 15, 20, 21}
   1. Zet op wegwerp latex rubber handschoenen en reinig het gebied van de site (bij voorkeur de mediane kubusvormige ader in de fossa antecubital) van de beoogde punctie met een geschikt ontsmettingsmiddel, b.v., 70% isopropylalcohol.
   2. Toepassing een tourniquet 4 – 6 inch boven de vermeende punctie site aan het opzwellen van de aderen. Begeleiden van de naald in de ader van de patiënt en, zodra het op zijn plaats, Vul voorzichtig de aangesloten bloed-buis, waarin EDTA als een antistollingsmiddel.
   3. Zodra Venapunctie voltooid is, laat de tourniquet en intrekken van de naald. Druk vervolgens op een droog gaas pad op de site van de punctie, die vervolgens kan worden gehouden in plaats van een pleister.
2. Punctie van de huid (figuur 1A)^{13-15, 20, 22, 23}
   1. Zet op een paar wegwerp latex rubber handschoenen.
   2. Voordat de huid punctie, moet de patiënt zijn/haar handen warm. De vinger wordt gemasseerd anterogradely de enrich het bloed stromen richting naar het doorprikken van de site.
   3. Reinig de huid van de palmair zijde van het distale uiteinde-kootje van de derde of vierde vinger van de hand van de niet-schrijven met een geschikt ontsmettingsmiddel, b.v., 70% isopropylalcohol. Het doorprikken van de huid door een veiligheid voor eenmalig gebruik lancet. De vinger moet plaatsvinden in een positie dat zwaartekracht het verzamelen van bloed op de vingertop vergemakkelijkt.
   4. Wanneer collectie van capillaire bloed door de huid punctie voltooid is, plaatst u een pleister op het puntje van de vinger.

2. voorbereiding van bloed vlekken

1. Bereiding op basis van bloed, verzameld door Venapunctie¹⁵
   1. Spot de verzamelde anti-gecoaguleerd (EDTA) hele veneuze bloed op de filter kaarten zo snel mogelijk. Niet gedroogd bloed vlekken meer dan 24u na Venapunctie bereiden.
   2. Zet alle informatie nodig voor de identificatie van de patiënt op de filterkaart. Één kaart moet gespot worden alleen met het bloed van een enkel individu.
   3. Zet op wegwerp latex rubber handschoenen.
   4. Voorzichtig omkeren de bloed collectie buis 2 tot 4 keer en vervolgens opent de stop zorgvuldig.
   5. Gecombineerd 50 µl van hele veneuze bloed met behulp van een precisiepipet met een disposable tip. Het bloed naar het midden van een cirkel overbrengen zonder aan te raken het koffiefilter rechtstreeks met het uiteinde van de pipet. Wilt u volledig verzadigen de cirkel.
   6. Herhaal deze procedure om alle vereiste cirkels van de kaart te vullen.
2. Bereiding op basis van bloed door de huid verzamelde punctie (cijfers 1B en 1 C)^{13-16, 23}
   1. Veeg de eerste druppel bloed met een gaas-pad omdat het overtollige weefsel vloeistoffen kan bevatten. Massage van de vinger weer te verhogen de doorbloeding op de site van de punctie. Overbrengen in het volgende drop tot de kringen van een filterkaart zonder aan te raken het oppervlak direct met de vingertop. Het bloed worden gedrenkt in de textuur van het filter door capillaire krachten alleen toestaan.
   2. Laat de volgende grote daling van capillaire bloed formulier op de vinger-tip en het verzamelen in de volgende cirkel. Herhaal deze procedure totdat alle nodige cirkels worden gevuld of bloedstroom stopt.
   3. Squeeze niet of "melk" de vinger overdreven als de bloedstroom niet voldoende is om alle de vereiste kringen van de filterkaart vullen. Als de bloedstroom stopt plaats een pleister op de vinger-tip. Een tweede huid lekke band op een andere vinger uitvoeren als meer bloed nodig is voor het onderzoek.

3. het drogen van bloed vlekken

1. Om droog de bloed vlekken, zet het filter kaarten op een schone papieren handdoek in een kast van biohazard veiligheid en laat ze drogen, bij voorkeur O/N (maar voor ten minste 4 uur), op de RT in het ontbreken van een externe bron van warmte. Wanneer het droogproces voltooid is, de bloed vlekken een uniform donker bruinachtige kleur hebben en geen rode gebieden zichtbaar zijn meer (Figuur 1 d)^{13, 15, 16}.

4. bewaring en vervoer van gedroogde bloed vlekken (DBS)

Opmerking: Verwerking van het bloed vlekken kan worden onderbroken na het drogen. De filter-kaarten kunnen nu opgeslagen^{13-16, 23}.

1. Voor opslag, door het filtreerpapier-kaart te zetten in een enkele, gas-ondoordringbare rits zak, met 1 tot 2 dessicant zakjes ter bescherming van de specimens van vocht (figuur 1E). U kunt desgewenst een vochtigheid indicator kaart toevoegen.
2. Deze tas overbrengen in een diepvriezer met een temperatuur van-20 ° C of lager zo spoedig mogelijk. Als diepvriezers niet beschikbaar onder veldomstandigheden zijn, is opslag bij-4 ° C of zelfs bij omgevingstemperatuur haalbaar voor maximaal 14 dagen.
3. Vervoer bevroren exemplaren van de DBS op droog ijs. Gebruik een drievoudige verpakkingssysteem, die uit de rits bag(s) als de binnenste verpakking(en) evenals een binnenste en een buitenste enveloppe bestaat voor filter kaarten in eerste instantie bewaard bij kamertemperatuur. Geen inhoud markeringen zijn vereist op de buitenste enveloppe voor verzending per post maar de internationale biohazard symbool moet worden aangebracht op de primaire container van innerlijke¹⁶.
4. Uitsluiten dat de filter kaarten verdere verwerking als de dessicant packs en/of de extra vochtigheid indicator kaart verandert in een roze kleur.

5. de elutie van gedroogde bloed vlekken^{13, 15, 16, 23}

1. Punch out een plek met een eenmalig gebruik 6 mm apparaat van elke cirkel van bloed doordrenkte van de filterkaart Grade 903 (figuur 1F). Alle geponste gedroogd bloed vlekken van een enkele patiënt overbrengen aan één putje van de plaat 12-well.
2. Vul de put met fosfaat gebufferde zoutoplossing die 0,05% Tween-20 en 0,08% natriumazide (figuur 1G) bevatten. Aanpassen van het volume van de toegevoegde buffer naar de respectieve minimumvereisten voor de test gebruikt voor latere analyse van gedroogde bloed vlekken eluaten.
3. Herhaal deze stappen om een tweede reeks van gedroogde bloed plek eluaten behalen moleculaire analyses uitvoeren.
4. De cel cultuur plaat zetten een laboratorium shaker en laat de geponste gedroogd bloed vlekken voorzichtig Elueer voor een minimum van 4 uur of, bij voorkeur, O/N (Figuur 1 H).
5. De volgende dag, de vlekken zijn bijna vrij van bloed en hemolytische supernatant (figuur 1I) hebben gevormd. Microcentrifuge buizen overbrengen in deze eluaten. Vervolgens onderwerpen aan centrifugeren voor 2 min op 10.500 x g (figuur 1J) te bevrijden van het supernatant van elke puin dat had gevormd tijdens elutie (Figuur 1 K).

6. analyse van eluaten

1. Gecentrifugeerde eluaten zijn nu klaar om te worden gebruikt voor de beoogde analyses. Onderzoeken van de eluaten voor markers van hepatitis B-virus, hepatitis C-virus en HIV-infectie met behulp van commercieel beschikbare kits en de respectieve fabrikanten instructies zorgvuldig (Figuur 1 L).

Figuur 1. Grafische samenvatting van het protocol voorgesteld in deze mededeling voor de voorbereiding en verwerking van gedroogd bloed vlekken om te worden gebruikt door moleculaire technieken en in immunoassay. Hele veneuze bloed en capillaire bloed verkregen door Venapunctie of aanprikken van de huid door een lancet (A) kunnen dienen als exemplaren voor gedroogde plek bloedwaarden. Na overdracht van het bloed aan de kringen van een filterkaart Grade 903 (B, C), moeten de monsters worden gedroogd bij voorkeur O/N bij kamertemperatuur in een veiligheidskast biohazard naar plekken van de vorm van een gelijkmatig bruinachtige kleur zonder enige interspersion van rood gebieden (D). Bij het drogen van de bloed vlekken is voltooid en opslag is nodig, de kaarten van de filter kunnen worden verpakt in zakken van de gas-ondoordringbare rits met 1 – 2 dessicant zakjes (E). Verdere verwerking van het laboratorium voor DBS omvatten de generatie van stoten door een apparaat Eenpersoonsgebruik 6 mm vanaf het middelpunt van de cirkels (F, G), de elutie van de stoten in een PBS-gebaseerde buffer voor een minimum van 4 uur of, bij voorkeur, O/N op een shaker (H ), het herstel van het eluaten (ik), en tenslotte het centrifugeren van de laboratorium-bekers (J) te bevrijden van de DBS eluaten van elke puin dat zou zijn ontstaan tijdens de elutie (K). Vervolgens zijn de DBS eluaten klaar voor analyses, die werden uitgevoerd door een volledig geautomatiseerde platform (L) om op te sporen van serologische markers van HBV, HCV en HIV infecties, respectievelijk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Resultaten

De effectiviteit van het protocol voorgesteld voor de voorbereiding en verwerking van DBS werd eerst geëvalueerd door het analyseren van 1762 gekoppelde serum/DBS paren voor markeringen van HBV, HCV en HIV-infectie. ¹⁷. voor dit doel, DBS waren bereid uit 100 µl hele veneuze bloed (cf. punten 2.1.1 – 2.1.6 van het voorgaande protocol) en werden geëlueerd met 1.000 µl van PBS gebaseerde buffer, elk, (cf. punten 5.1-5.5 van voornoemd protocol) om het proces te voltooien voor alle zeven parameters in twee aparte verrichtingen. Een dergelijke aanpak zonder zorgvuldige optimalisatie van de elution voorwaarden voor elke één analyt leek te zijn onvermijdelijk omdat er nogal veel monsters worden verwerkt werd verwacht in een betrekkelijk korte tijd tijdens de aanstaande veld studie "Drugs en chronische Besmettelijke ziekten"("DRUCK Study").

Alle metingen vastgehouden aan de aanbevelingen van de fabrikant in de loop van DBS analyses maar moest worden gewijzigd ten opzichte van de HBsAg en anti-HBs vaststellingen te compenseren voor het effect van hemolyse of het resultaat van verdunning. Met een cut-off waarde van 0.05 IU/ml, HBsAg testen van DBS eluaten leiden tot een snelheid van vals-positieven van 14,7% (52 van 354) in vergelijking tot het serum monsters (figuur 2A). Ontvanger die karakteristiek (ROC) analyse^{25, 26} of de gegevens aangegeven dat een ideale scheiding van de HBsAg-positieven van HBsAg-negatieven (0.986 [gevoeligheid], 0.000 [1-specificiteit], leiden een verhoging van de drempel tot 0,15 IU/ml tot zou Figuur 2B). Aan de andere kant, met een licht-donkerscheiding van 10 IU/l voor de kwantificering van anti-HBs antilichamen die een tarief van vals-negatieve metingen van 14,2% (47 van 331) werd geregistreerd (figuur 2C). Vandaar, na ROC analyse weer, dit licht-donkerscheiding werd verlaagd naar 1,5 IU/l te bereiken van een optimale discriminatie van waarden (0.917 [gevoeligheid], 0,007 [1-specificiteit], figuur 2D).

Figuur 2. HBsAg en anti-HBs in DBS eluaten (gewijzigd van¹⁷) testen. De ROC-geleide toename van de waarde van de licht-donkerscheiding voor HBsAg kwantificering van 0,05 IU/ml (A) tot 0,15 IU/ml verminderd (B) het aantal vals-positieve resultaten van 14,7% tot 0%. ROC analyse van anti-HBs concentraties voorgesteld ook een daling van de respectieve drempel van 10 IU/l (C) tot 1,5 IU/l (D), daardoor volledig elimineren van vals-negatieven, die eerst administratief wordt verwerkt voor 14,2% van alle bepalingen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. 

De resultaten van de analyses van de gekoppelde serum/DBS worden samengevat in tabel 1¹⁷. Geen niet-specificiteit werd opgenomen in de loop van DBS testen voor elk van de zeven analyten.

Wanneer DBS eluaten werden onderzocht op de aanwezigheid van HBsAg, d. w. z. de serologische belangrijke parameter van zowel acute als chronische infectie met HBV, werd een analytische gevoeligheid van 98,6% vastgesteld. HBsAg concentraties in de sera vals-negatieve twee waren 749 IU/ml en 6 IU/ml, respectievelijk. Anti-HBc antilichamen werden met succes ontdekt in 176 van 204 (i. e 86,3%) DBS eluaten. Tweeëntwintig uit de 28 specimens die niet werden ontdekt door de metingen die afkomstig is van individuen samen met MIV besmet. Dus, als HIV-positieve personen zijn uitgesloten van de berekening, een gevoeligheid van 97,1% werd bereikt voor het ophalen van anti-HBc antistoffen uit gedroogde hele veneuze bloed geëlueerd. Soortgelijke opmerkingen gehouden waar voor de bepaling van anti-HBs antilichamen. Zelfs na aanpassing van de waarde van de licht-donkerscheiding van de bepaling tot 1,5 IU/l kwam negen discrepantie serum DBS resultaten. In de niet samen met HIV besmette patiënten werden serum anti-HBs concentraties van 11 – 26 IU/l gevonden, waren die te laag zijn om voldoende zijn voor detectie na de elutie van de gedroogde bloed.

Anti-HCV-antistoffen zijn indicatief van een acute of chronische of opgelost infectie. Slechts vier (i. e. 2,2%) vals-negatieve anti-HCV resultaten werden bepaald op basis van DBS eluaten en verder serologische en moleculaire analyses duidelijk aangetoond dat de respectieve sera zeer waarschijnlijk waren ontleend aan patiënten, wier infecties allang hadden opgelost.

De opsporing van de anti-HIV antilichamen in DBS eluaten met het volledig geautomatiseerd systeem was een volledig glad proces dat een analytische gevoeligheid van 100 leverde %.

"Gemiddelde HBV-DNA-concentratie van volbloed eluaten werd uitgevoerd op 100 exemplaren (: DNA-concentratie: 1,573,898 IU/ml, bereik: < 357 - > 17,860,000 IU/ml) en een waarde van 93.0% opgeleverd. Aldus, werden zeven monsters met een lage serum HBV-DNA-concentratie tussen 409 en 3,643 IU/ml niet herkend door de DBS testen. Van 100 sera die had bewezen te zijn van HCV-RNA positieve (: HCV-RNA concentratie: 1,415,944 IU/ml, bereik: 2,479 - > 7,692,000 IU/ml), bijbehorende volbloed aliquots beschikbaar waren. Het vergelijkende onderzoek resulteerde in een analytische gevoeligheid van 100% voor HCV-RNA vaststellingen van DBS eluaten." ¹⁷

Om te testen het overzicht protocol voor de voorbereiding en behandeling van DBS onder veldomstandigheden, werd het gebruikt in nauwe samenwerking met het Robert Koch Instituut (Berlijn, Duitsland) tijdens de experimentele fase van de studie "Drugs en chronische infectieziekten", die was uitgevoerd op actieve drugsgebruikers in de Duitse steden van Berlijn en Essen¹⁸. Alle 534 deelnemers ingeschreven (433 mannen en vrouwen van de 101) onderging capillaire bloedmonsters zoals in detail beschreven in secties 2.2.1 – 2.2.3 van het voorgaande protocol, en DBS waren, opnieuw, door toevoeging van 1.000 µl van PBS gebaseerde buffer geëlueerd.

Twee personen werden gediagnosticeerd te worden chronisch geïnfecteerd met HBV, en 39 toonde de serologische patroon van een opgelost HBV-infectie. Bovendien, vijftien deelnemers waren positief voor anti-HBs (status na vaccinatie) en acht bleken te zijn positief voor anti-HBc alleen. De anti-HCV-prevalentie onder de deelnemers was 57,3% (N = 193) in Berlijn en 73.0% (N = 144) in Essen. Van de antilichaam-positieve monsters 65% (N = 125) en 62% (N = 89) waren ook viremic. Vijfentwintig uit de 534 personen getest positief voor anti-HIV. Negentien van de infecties was al bekend en 24 van deze personen waren mede geïnfecteerd zijn met HCV.

De resultaten verkregen door het testen van de DBS werden zorgvuldig vergeleken met de studiedeelnemers anamnestische gegevens met betrekking tot de zelf-gerapporteerde status van HBV en HCV. Deze vergelijking in combinatie met de resultaten van tests gekoppeld serum/DBS paren leidde tot kleine wijzigingen van het testen algoritme voor de belangrijkste fase van de "DRUCK studie", die actieve drugsgebruikers in zes extra grote Duitse steden schrijven zal: "individuen geïnfecteerd met HIV zal altijd worden getest op de aanwezigheid van HBV DNA. Deelnemers waarvan DBS eluaten positief voor anti-HBc of anti-HBs zijn moeten worden onderworpen aan een Venapunctie tijdens een tweede raadpleging teneinde te verduidelijken zeker hun anti-HBc/anti-HBs-status en, tot slot, alle DBS eluaten zal worden gescreend voor HCV-RNA ongeacht de resultaten van het anti-HCV testen." ¹⁷

Parameters	Gekoppelde sera/DBS eluaten (N)	Discrepante resultaten (N)	Reden voor verschillen tussen testen serum en DBS eluaten
HBV
HBsAg	299	2	Twee patiënten met chronische HBV-infectie. Beiden waren onder antivirale behandeling en een van hen was mede geïnfecteerd met HIV. HBsAg concentraties in serum: 749 IU/ml en 6 IU/ml, respectievelijk.
Anti-HBc	305	28	In serum hadden tweeëntwintig patiënten een opgelost HBV-infectie. Zes personen toonde de serologische vinden "anti-HBc alleen". Tweeëntwintig van de patiënten werden mede geïnfecteerd met HIV. Van de "HBV resolvers", werden twintig beoordeeld als "Anti-HBs positieve alleen" door het testen van de DBS en, dus, ten onrechte werden geclassificeerd als "voorwaarde na vaccinatie".
Anti-HBs	310	9	De vier niet samen met HIV besmette patiënten had serum anti-HBs concentraties van 11 ‑ 26 IU/l, die te laag waren te voorzien in de opsporing van antilichamen na de elutie van de gedroogde bloed vlekken.
HBV-DNA	150	7	De respectieve sera had verkregen van zeven patiënten met lage serum HBV DNA concentraties variërend van 409 IU/ml tot 3,643 IU/ml.
HCV
Anti-HCV	339	4	Deze vier sera had overgenomen uit patiënten, met lange sinds opgelost HCV-infecties.
HCV-RNA	150	0	–
HIV
HIV 1-p24/anti-HIV 1/2	209	0	–

Tabel 1: Resultaten verkregen uit 1762 DBS, dat waren opgesteld en verwerkte op basis van hele veneuze bloed na het protocol in deze mededeling voorgestelde, vergeleken met de bevindingen in gekoppelde serummonsters als referentie.

Discussie

DBS voor 100 jaar² zijn gebruikt, maar verrassend, is er nog geen algemene consensus over de voorbereiding en de verwerking. Tot op heden, een voldoende standaardisatie van deze belangrijke pre analytische fase alleen geboekt op het gebied van pasgeboren screening¹⁴, overwegende dat een verscheidenheid van verschillende protocollen bestaat voor alle andere toepassingen voor DBS testen^{5, 16, 23}. Om te overwinnen deze opmerkelijke heterogeniteit, een uitgebreide stapsgewijze instructie voor de voorbereiding en verwerking van DBS te worden gebruikt in immunoassay en door moleculaire technieken gepresenteerd in deze mededeling en geëvalueerd met betrekking tot de doeltreffendheid ervan voor het detecteren van merkers van HBV, HCV en HIV-infecties. De focus van de volgende discussie wordt voornamelijk gelegd op de verschillende stappen van het voorgestelde protocol.

In de geschiedenis van DBS testen van vele verschillende filtreerpapier kaarten geweest gebruikte² maar vandaag slechts twee commerciële bronnen zijn goedgekeurd door de FDA als klasse II medische hulpmiddelen voor bloed collectie^{5, 16}. Deze filter kaartsystemen zijn zeer uniform en hebben zeer vergelijkbaar absorptie-eigenschappen zodat de analytische resultaten van capillaire bloed bereid op een van hen niet van elkaar verschillen door meer dan 4%-5%²⁸. Niet verrassend, Masciotra en collega's²⁹ daarom gedetecteerd HIV-1 RNA evengoed met een kwalitatieve test na de elutie van bloed collectie kaarten van verschillende bronnen. Gelet op deze gegevens, kan het worden vrijwel uitgesloten dat een van de verschillen waargenomen bij het testen van combinatie serum/DBS paren voor markeringen van HBV, HCV en HIV infecties¹⁷ werd veroorzaakt door de keuze van de filterkaart alleen. Echter wanneer nauwkeurige kwantificering van een analyt onmisbaar is, bron-naar-bronvariatie kan niet langer te verwaarlozen en meer geavanceerde technieken, bijvoorbeeld, geperforeerd DBS (PDBS) als een methode voor microsampling³⁰ of de voorbereiding van gedroogde serum vlekken wellicht (DSS)³¹ moeten worden toegepast in plaats van conventionele DBS¹⁰testen.

Aangezien alleen kleine hoeveelheden bloed worden gebruikt voor DBS testen (een druppel van capillaire bloed bestaat uit ongeveer 50 µl)^{5, 16}, variaties in het monstervolume zijn van cruciaal belang en, toegegeven, althans een aantal van de verschillen tussen de resultaten van de serologische en de deelnemer zelf-gerapporteerde status van het HBV en HCV opgenomen tijdens de loodsen van de "DRUCK studie" te wijten zijn aan deze variabele. De belangrijkste factor voor het minimaliseren van "schommelingen" van het monstervolume is ongetwijfeld een juiste techniek van capillaire bloed collectie, die alleen kan worden bereikt door zorgvuldige en voortdurende opleiding van het technisch personeel-²². Bovendien, als een maatregel van kwaliteitscontrole, moeten alle laboratoria die werken met DBS reeds ingeleid procedures voor het identificeren en vervolgens met uitzondering van DBS specimens die moeten worden beschouwd als onbevredigend of ongeldige¹⁶.

Studies uitgevoerd voornamelijk in het kader van HIV³² en pasgeboren screening³³ hebben aangetoond dat hoge luchtvochtigheid kan leiden tot een aantasting van de analyten, maar tot nu toe heeft geen consensus is bereikt wat betreft de vraag hoe lang de DBS moet aan . Een interval van ten minste 4 uur of bij voorkeur O/N wordt voorgesteld in deze mededeling, die derhalve aangenomen voorwaarden die werden gebruikt in de overgrote meerderheid van alle relevante publicaties^{32, 34} gegevens over opslag van DBS worden vervolgens gebruikt voor HBV en HCV testen zijn tegenstrijdig. In 1981, Villa en collega's³⁵, die hedendaagse analytische technieken toegepast, gemeld dat opslag bij RT niet de resultaten van analyses van de HBV tijdens de volledige observatieperiode van 180 dagen beïnvloedde als antilichamen titers > 1/1.000, maar dat DBS borderline-positieve of zelfs negatief werd na 15 dagen wanneer de titers in het serum slechts 1/100 werden. Opslag bij-20 ° C of 4 ° C niet leiden tot een aanzienlijke verbetering. In tegenstelling, een studie uitgevoerd dertig jaar later³⁶ getest worden gerepliceerd van een HBV-positief monster, en de auteurs gevonden die anti-HBc net zo goed als anti-HBs antilichamen waren stabiel voor maximaal 183 dagen op RT, terwijl HBsAg onder dezelfde voorwaarden werd vals-negatieve al na 63 dagen. Ten aanzien van HBV DNA detectie van DBS eluaten, de concentratie van de virale nucleïnezuur was stabiel gedurende ten minste zeven dagen bij 37 ° C³⁷ of bleek te zijn "resistente" naar opslag op RT voor maximaal drie weken³⁸. Testen voor anti-HCV antilichamen met behulp van twee verkrijgbare derde generatie immunoassay³⁹ nauwkeurige resultaten opgeleverd voor een periode van 117 dagen met behulp van DBS monsters opgeslagen bij-20 ° C, 2-8 ° C en 20-25 ° C, respectievelijk. Opslag bij-20 ° C, echter, resulteerde in de laagste variatie van optische dichtheden. Toepassing van een vierde generatie anti-HCV ELISA, dat wil zeggen, Monolisa HCV-Ag-Ab-ULTRA, in het kader van de DBS testen, Larrat et al. ⁴⁰ waargenomen een scherpe afname van de analytische specificiteit na het opslaan van de DBS-exemplaren voor meer dan drie dagen op RT. Aan de andere kant, werden precieze testende resultaten bekomen met dezelfde kit met gebruikmaking van monsters afgezet gedurende 60 dagen onder verschillende omstandigheden (-20 ° C, 2-8 ° C en 22-26 ° C) door Brandao en medewerkers⁴¹. Opmerkingen over de daling van de concentraties van de HCV-RNA in DBS onder verschillende opslagcondities variëren van geen aanzienlijke wijziging op RT voor maximaal één jaar⁴² tot een tienvoudige verandering na vier weken bij omgevingstemperatuur⁴³. Deze nogal tegenstrijdige gegevens op de stabiliteit van HBV en HCV-antigenen, nucleïnezuren en antilichamen in aanmerking nemen, leek het redelijk te trekken in het voorgestelde protocol tot een consensus, die eerder was gedefinieerd voor de opslag van DBS specimens worden gebruikt voor HIV-tests^{15, 30}: voor korte termijn afzetting (maximaal twee weken) antigenen, virale nucleic zuur, en antilichamen worden beschouwd als stabiel op RT, overwegende dat optimale opslag voor langere perioden bevroren voorwaarden.

Als een regel, drie parameters moeten worden overwogen bij het ontwerpen van een elutie protocol: (1) de elutie buffer; (2) de duur en de temperatuur van de elutie; en (3) het elution volume²³. In de overgrote meerderheid van alle relevante publicaties-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) werd gebruikt voor eluerende DBS, en de meeste auteurs toegevoegd een eiwit, bijvoorbeeld, bovien serumalbumine (BSA) of tween-20, een oppervlakteactieve stof, teneinde het assay-signaal door te stabiliseren eiwitten, zoals ze gaan in de oplossing, en tegelijkertijd blokkeren aspecifieke bindende sites²³. Alleen een paar verslagen, die direct verschillende elutie buffers in het kader van de DBS testen vergelijken, zijn beschikbaar. Villar et al. ³⁶, bijvoorbeeldopgenomen bijna gelijkwaardig elutie capaciteiten voor alle buffers gebruikt, maar PBS/BSA 0,5% resulteerde in het laagste niveau van aspecifieke reactiviteit. Een zeer soortgelijke constatering werd gemaakt door Croom en collega's⁴⁴ bij de toepassing van het specimen verdunningsmiddel van de genetica systemen rLAV Mer voor de elutie van anti-HCV-antistoffen van DBS. Aangezien het risico van aantasting van het monster is buitengewoon laag in de eerste uren na voorbereiding van DBS (zie hierboven), was het besloten om de vlekken O/N bij kamertemperatuur incuberen en de elutie om proces te ondersteunen door het zacht mengen van eind over. Deze aanpak heeft het voordeel dat de specimens de vorige uitgestanst dag kan worden rechtstreeks overgedragen aan routine diagnostiek vroeg de volgende ochtend²³. Het volume van de elutie buffer moet worden aangepast aan de respectievelijke minimale eisen van de tests gebruikt voor latere analyses om de verdunningsfactor zo laag mogelijk te houden. Een zorgvuldige optimalisatie van de elution voorwaarden voor elke één analyt was echter niet mogelijk bij de voorafgaande evaluatie omdat veel monsters worden verwerkt moest worden gegarandeerd in een relatief korte tijd tijdens de "DRUCK Study"¹⁷. Bijgevolg werd het nogal ongunstige volume van 1.000 µl van PBS gebaseerde buffer gebruikt om de hele elutie proces voor alle parameters in twee aparte verrichtingen te voltooien.

Deze aanpak een enerzijds mislukt "volledig in het systeem van de anti-HBc/anti-HBs voor die individuen die besmet zijn met HIV als gevolg van de lage antilichaam concentraties; ... en het moleculaire biologische procedures vereist met optimale analytische gevoeligheid ten aanzien van HBV-DNA en HCV-RNA tests. " ¹⁷ aan de andere kant, het hoge elutievolume bleek te zijn op geen enkele wijze nadelig zijn voor de bepaling van HBsAg, anti-HCV en anti-HIV door de kits gebruikt tijdens de evaluatie. "De detectie van HBsAg positieve materialen van volbloed eluaten opgevolgd met een gevoeligheid van 98,6% tot een zo hoge mate zoals in eerdere studies, die had een veel kleinere elutievolume van 100 µL, 250 µl, 600 µl of 500 µl gedeeltelijk gebruikt"^{17 ,36, 45, 46}. De gevoeligheid van 97.8% bepaald in het onderzoek van 179 serum/DBS paren voor anti-HCV-antistoffen overeenkwam met de resultaten van het reeds bestaande rapporten^{24, 44, 47, 48, 49}, die had gewerkt met een elutievolume die lager met een factor 5 tot en met 10 was. "Bovendien, de protocollen voor anti-HCV detectie had op de juiste wijze geoptimaliseerd... door hun eigen licht-donkerscheiding punten"^{17, 24, 48, 49} "of door het verhogen van de volumes van de steekproef van 20 µl tot 100 µl." ^{17, 49} tot slot de analytische specificiteit en de gevoeligheid (100% elk) vastgesteld voor de detectie van de anti-HIV waren superieur aan de prestatiekenmerken van andere immunoassay specifiek aangepast aan DBS testen van^{50, 51} of gelijk "of van een stapsgewijze procedure met het gecombineerd gebruik van verschillende anti-HIV-tests"^17,52. "Zij, inderdaad, ook overschreden de record van de prestaties van een bepaling die had speciaal ontwikkeld en geoptimaliseerd voor de detectie van de anti-HIV antilichamen in DBS eluaten (Q-voorkomen van HIV-1 + 2 DBS kit)." ^{17, 53}  

Tezamen, het uitgebreide stapsgewijze protocol gepresenteerd in deze mededeling een haalbaar en gebruiksvriendelijk instrument voor de voorbereiding en verwerking van DBS gebleken en kan dus, op een betrouwbare manier gebruikt worden in Diagnostische Virologie. Het staat met behulp van automatisering ⁵⁴ benaderingen en vanwege haar uitstekende prestatiekenmerken heeft het potentieel om te dienen als een soort van fundament voor een toekomstige algemeen aanvaarde consensus-protocol op het algemene gebied van DBS testen in het laboratorium geneeskunde.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Latex rubber gloves	Hartmann	#4049500041515
70% isopropyl alcohol	Bode Chemie	#9768050
Mulifly safety cannula	Sarstedt	#85.1638
EDTA blood collection tube	Sarstedt	#02.1066.001
Adhesive bandage	Hartmann	#2994163
Dry gauze pad	Hartmann	#143213
Singel-use safety lancet	Owen Mumford	#3802421
Filter paper card	Whatman/sigmaaldrich	#10534612	Filter paper card Grade 903
Disposable pipette tips	Starlab	#S1126-7810, #S1120-8810
Zipper bag	Flexico	#20219
Mini desiccant bag	Tropack	#-
Disposable Punch	pfmmedical	#48601	6.0 mm Disposable Biopsy Punch
Disposable Forceps	Servoprax	#H7301
12 Well Cell Culture Plate	Greiner	#665180
PBS Buffer	Gibco	#14190-136
Tween 20	Applichem	#A1389.0500
Sodium Azide	Merck	#66880250
Safe-Lock Tubes, 1.5 ml	Eppendorf	#30120086
ARCHITECT HBsAg (Quantitative)	Abbott	#6C3642
ARCHITECT anti-HBc II	Abbott	#8L4425
ARCHITECT anti-HBs	Abbott	#7C1825
ARCHITECT anti-HCV	Abbott	#6C3725
ARCHITECT HIV Ag/Ab Combo	Abbott	#4J2727
MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit	Roche	#6374891001
artus HBV LC PCR Kit	Qiagen	#4506063 (24 tests), #4506065 (96 tests)
VERSANT HCV TMA Assay IVD	Siemens Healthcare	#2554311