Method Article

Ontwikkeling van een kwantitatieve Recombinase Polymerase Amplificatie test met een interne positieve controle

DOI:

10.3791/52620

⸱

March 30th, 2015

 ,  , 
1Department of Bioengineering, Rice University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er is een protocol gegeven voor het ontwikkelen van een real-time recombinase polymerase-amplificatietest om de initiële concentratie van DNA-monsters te kwantificeren met behulp van een thermische cycler of een microscoop en een stage-heater. Ook beschreven is de ontwikkeling van een interne positieve controle. Scripts zijn gegeven voor het verwerken van ruwe real-time fluorescentiegegevens.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het werd onlangs aangetoond dat recombinase polymerase-amplificatie (RPA), een isotherme amplificatieplatform voor het detecteren van pathogenen, kan worden gebruikt om de DNA-monsterconcentratie te kwantificeren met behulp van een standaardcurve. In dit manuscript wordt een gedetailleerd protocol voor het ontwikkelen en implementeren van een real-time kwantitatieve recombinase polymerase-amplificatie-assay (qRPA-assay) gegeven. Met behulp van HIV-1 DNA-kwantificering als voorbeeld, worden de assemblage van real-time RPA-reacties, het ontwerp van een interne positieve controle (IPC) sequentie en co-amplificatie van de IPC en doelwit van belang allemaal beschreven. Er worden instructies en dataverwerkingsscripts gegeven voor de constructie van een standaardcurve met behulp van gegevens van meerdere experimenten, die kunnen worden gebruikt om de concentratie van onbekende monsters te voorspellen of de prestaties van de assay te beoordelen. Ten slotte wordt een alternatieve methode beschreven voor het verzamelen van real-time fluorescentiegegevens met een microscoop en een stagesverwarmer als een stap naar het ontwikkelen van een point-of-care qRPA-assay. Het protocol en de scripts die worden verstrekt, kunnen worden gebruikt voor de ontwikkeling van een qRPA-assay voor elk DNA-doelwit van belang.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kwantitatieve nucleïnezuur amplificatie is een belangrijke techniek voor detectie van milieu, voedsel overgedragen en water ziekteverwekkers en klinische diagnostiek. Real-time kwantitatieve PCR (qPCR) is de gouden standaard methode voor gevoelige, specifieke en kwantitatieve detectie van nucleïnezuren, bijvoorbeeld, HIV-1 virale lading testen, detectie van bacteriële pathogenen, en screening op vele andere organismen 1 - 3. Gedurende real-time qPCR, primers amplificeren pathogeen DNA in cycli, en een fluorescent signaal gegenereerd dat evenredig is met de hoeveelheid geamplificeerd DNA in het monster bij elke cyclus. Een monster met een onbekende concentratie van pathogeen DNA kan worden gekwantificeerd met een standaard kromme die de oorspronkelijke DNA-concentratie van standaardmonsters en het tijdstip waarop het fluorescentiesignaal een bepaalde drempel bereikt (dat wil zeggen, de cyclus drempelwaarde, of CT) betrekking heeft.

Omdat real-time qPCR vereist dure thermische cycli apparatuur en enkele uren resultaten, alternatieve isothermische amplificatie technieken zoals recombinase polymerase amplificatie (RPA) te ontvangen, ontwikkeld 4. Deze platforms algemeen sneller resultaten en amplificeren van nucleïnezuren een lagere, één temperatuur, die kan worden bereikt met minder dure apparatuur eenvoudiger. RPA, die bijzonder aantrekkelijk voor point-of-care toepassingen, versterkt DNA in minuten vereist een lage versterking (37 ° C) en blijft actief in aanwezigheid van onzuiverheden 5,6. RPA-testen zijn ontwikkeld voor een breed scala van toepassingen, met inbegrip van voedsel analyse, detectie van pathogenen, kanker drug screening en detectie van biothreat agenten 7-12. Echter, gebruik van RPA voor het kwantificeren van nucleïnezuren beperkt 13,14.

In eerdere werk, het was shown die real-time kwantitatieve RPA (qRPA) is haalbaar 15. Hier wordt een meer gedetailleerd protocol bedoeld met real-time kwantitatieve RPA onbekende monsters met behulp van een standaardcurve, een methode die analoog is aan kwantificering met qPCR kwantificeren. Dit protocol wordt beschreven hoe een RPA reactie uit te voeren op een thermocycler HIV-1 DNA te detecteren als proof-of-concept, evenals hoe een interne positieve controle (IPC) het systeem correct werkt ontwikkelen. Het verzamelen van gegevens met behulp van een PCR-apparaat of een microscoop en data-analyse voor de bouw van een standaard curve met behulp van training data wordt ook beschreven. Tenslotte wordt de werkwijze voor het kwantificeren van onbekende monsters met de standaardcurve met een douanemanuscript aangetoond. Deze qRPA techniek maakt kwantificering van monsters met onbekende concentraties en heeft vele voordelen boven traditionele real-time qPCR.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Programmeer de Thermal Cycler voor Real-time qRPA Reacties

  1. Maak een nieuw protocol in het PCR-apparaat software.
    1. Plaats een pre-incubatiestap: 39 ° C gedurende 1 min.
    2. Voeg een tweede stap: 39 ° C gedurende 20 seconden, gevolgd door een plaat gelezen.
    3. Tot slot plaatst u een "ga naar" dat de tweede stap wordt herhaald 59 keer.
    4. Sla het protocol.
  2. Maak een nieuwe plaat in de "plaat editor" tab van de software. Selecteer wells overeenkomen met de locaties van de RPA reacties (hier gebruik putjes A1, A4-A8, B1 en B4-B8).
    LET OP: Het is niet belangrijk of het type monster van de putten (bijvoorbeeld "Standaard", "NTC") is opgegeven, zoals data-analyse wordt gedaan met behulp van een aangepast script.
    1. Voor experimenten met alleen HIV-1-DNA, selecteer dan de "HEX" fluorofor voor alle putjes. Voor experimenten met HIV-1-DNA en een interne positieve samenwerkingntrol, selecteert u zowel "HEX" en "FAM" fluoroforen voor alle putjes. Sla de plaat.

2. Bereid je voor HIV-1 qRPA Experimenten

  1. Monteer RPA reacties in een aangewezen voorversterking werkruimte met aangewezen pipetten, pipetpunten, vortexer, en mini-centrifuge, als voor qPCR. Als RPA één kopie van DNA kan amplificeren door zoveel als tien orden van grootte (gegevens niet getoond), verwerken en afvoeren van buizen met post-geamplificeerde DNA-producten in een aangewezen na amplificatie gebied.
    1. Voorkomen dat het contact tussen alle pre-amplificatiereagentia en post-versterking producten. Spray voorversterking werkplekken en apparatuur met 50% bleekmiddel voor en na alle experimenten. Gebruik een papieren handdoek weg te vegen overtollig bleekmiddel.
  2. Aankoop forward primer sequentie 5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3 'en reverse primer sequentie 5'-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT TTT GTT G-3 'van commerciële DNA synthesizers. Koop de probesequentie 5'TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA / HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3 'uit commerciële bronnen. Bewaar alle primers en probes bij 4 ° C in porties in een concentratie van 10 pM voor gebruik.
    OPMERKING: De qRPA amplificeert een unieke HIV-1-reeks. Voor deze proof-of-concept-assay, gebruik maken van de plasmide pHIV-IRES- eYFPΔEnvΔVifΔVpr beschreven door Sutton et al., Die de doelsequentie 16 bevat. Voor qRPA experimenten werd het plasmide opgeslagen bij 4 ° C in porties met 1, 10, 10 2, 10 3, 4 en 10 kopieën per ul in een buffer bevattende 10 mM Tris, 0,1 mM EDTA bij pH 8,0 en 1 ng / ul menselijk genoom DNA-drager (360.486). Deze drager DNA-concentratie gelijk is aan de DNA-concentratie verkregen uit commerciële serum DNA-extractie kits voor HIV-1 diagnose 17. Deze HIV-1verdunningen werden gebruikt als templates in qRPA reacties op een standaardcurve te bouwen.

3. Monteer een HIV-1 qRPA Standard Curve

  1. Vóór montage qRPA reacties, bereid de voorversterking werkruimte zoals beschreven in stap 2.1.1. Plaats een 96-wells koude blok opgeslagen bij 4 ° C.
  2. Bereid reagentia voor 12 reacties:
    1. Verplaats de magnesiumacetaat, de rehydratie buffer en 12 RPA reactie pellets aan de voorversterking werkruimte.
    2. Ontdooi de magnesiumacetaat en rehydratatie buffer bij kamertemperatuur.
    3. Portie 32,5 ul van magnesium acetaat (2,5 pi per reactie) om een ​​microcentrifugebuis.
    4. Bereid een 13x master mix. Voeg 383,5 ul van de rehydratatie buffer (29,5 pi per reactie) om een ​​aparte microcentrifugebuis voor de master mix. Voeg 41,6 ul van nuclease gratis water (3,2 pi per reactie) voor de master mix. Vortex de master mix.
    5. De terugkeer van de magnesium acrylonitte en rehydratatie buffer opslag bij -20 ° C.
    6. Verplaats de primer en probe aliquots van de koelkast om de voorversterking gebied excessieve blootstelling aan licht te minimaliseren fotobleken.
    7. Voeg 27,3 ul elk van de 10 uM voorwaartse en achterwaartse primers (2,1 ul per primer per reactie) voor de master mix.
    8. Voeg 7,8 ul van de 10 uM-HEX gelabelde HIV-1 DNA-probe (0,6 pi per reactie) voor de master mix.
    9. Terugkeer primers en sonde opslag.
  3. Passend bij de plaat lay-out in paragraaf 1.2 beschreven, plaatst 1 enzym pellet in elk van de uiterst links tubes en 1 enzym pellet in elk van de 5 meest rechtse buizen van 2 laagbouw 8-wells PCR-buis strips.
  4. Voeg voorzichtig 37,5 ul van master mix aan elke buis met daarin een enzym pellet, met behulp van een nieuwe pipet tip voor elke buis en voorzichtig roeren van de master mix en pellet met de punt totdat de pellet volledig is opgelost. Roer voorzichtig te borrelen formati voorkomenop, en verwijder de tip zorgvuldig om verlies van de reactie volume te voorkomen.
  5. Immers enzym pellets zijn gehydrateerd met de master mix, halen de 96-well koude blok van 4 ° C bewaren. Plaats de PCR-buis strips in de koude blok naar de master mix relaxen.
  6. Terwijl de master mix is ​​koeling, laadt u het PCR-apparaat-software met het protocol en de plaat in paragraaf 1 beschreven.
  7. Knip 2 stroken van doorzichtig plastic micro-afdichting lijm om iets breder dan de PCR-buisjes zijn, en 2 platte PCR-buis strip deksels op te halen.
  8. Ophalen 6 sjabloon aliquots van opslag (met 0, 1, 10 1, 10 2, 10 3, of 10 4 kopieën van het HIV-1 plasmide per microliter).
  9. Voeg 10 ul van elke sjabloon om de voor dit sjabloon concentratie buizen. Gebruik een nieuwe pipet tip voor elke buis, zachtjes roeren van de oplossing met de tip om de master mix en template mengen. Zorg ervoor dat u de sjabloon toe te voegen naar de juiste locatie te match de plaat lay-out in paragraaf 1.2 beschreven.
  10. Ervoor zorgen dat een PCR-buis strip adapter voor de microcentrifugebuizen is op zijn plaats.
  11. Verdeel 2.5 gl magnesiumacetaat in elke buis deksel die op een buis met een qRPA reactie worden geplaatst.
  12. Plaats voorzichtig het deksel bovenop de PCR buisjes zodat ze niet volledig afgedicht en kunnen worden verwijderd. De magnesiumacetaat zal zich houden aan de deksels en duidelijk zichtbaar zijn van bovenaf.
  13. Plaats elke PCR-buis strip met deksels in elke zijde van de PCR buishouder. Sluit het deksel van de minicentrifuge de magnesiumacetaat spinnen van de deksels en aan de RPA reactie initiëren de RPA reactie. Centrifugeer totdat alle luchtbellen worden verwijderd en alle vloeistof verzameld in de bodem van elke buis (10 sec).
  14. Snel te verwijderen van de PCR-buis strips en ze terug naar de koude blok aan het qRPA reacties te stoppen.
  15. Verwijder voorzichtig de deksels om aërosolvorming te voorkomen en te verzegelen elke PCR-buis strip met de cutstukken van duidelijke micro-afdichting film.
  16. Snel lopen naar de PCR-apparaat en laadt de twee PCR-buis strips in de PCR-apparaat in de locaties die overeenkomen met de plaat lay-out (putten A1-B8). Sluit het deksel van de PCR-apparaat, klikt u op "Start Uitvoeren" en wijst een bestandsnaam voor het experiment.
    OPMERKING: Hoewel de fabrikant adviseert roeren van het monster na 5 min incubatie, deze stap is niet nodig voor deze test en kunnen worden weggelaten.
  17. Na de run is voltooid, selecteer "Instellingen", "Baseline Setting", "Nee Baseline Aftrekken" om de ruwe fluorescentie gegevens weer te geven. De gegevens naar een spreadsheet programma exporteren door te kiezen voor "Export", "Exporteer alle Data Sheets naar Excel." Een bestand met het addendum "Quantification Amplification resultaten" zal worden aangemaakt met daarin de ruwe real-time fluorescentie data.

4. Ontwikkel een interne positieve controle

  1. Selecteer een DNA sequentie van een soort die waarschijnlijk niet in het beoogde monster. De sequentie moet langer zijn dan de doel amplicon zodat generatie van de doelsequentie wordt begunstigd.
    OPMERKING: Bij deze test, Cryptosporidium parvum, een intestinale parasiet, werd gekozen om te dienen als matrijs voor het genereren van de IPC sequentie omdat dit organisme waarschijnlijk niet in het bloed en in het laboratorium van een ander project beschikbaar was. Aan de IPC volgorde te genereren, uit te pakken en te zuiveren DNA van C. parvum oöcysten zoals elders 18 beschreven.
  2. Koop de forward (5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G / ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3 ') en achteruit (5'-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G / TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA-3 ') primers uit commerciële bronnen. De IPC PCR primers die in deze assay worden getoond in Figuur 1 en bevat een gebied dat complementair is aan de IPC template DNA (bijvoorbeeld C. parvum, paars in figuur 1) en een gebied dat complementair is aan het doelorganisme (bijvoorbeeld HIV-1 blauw in figuur 1).
  3. Voer PCR met de primers en IPC matrijs DNA.
    1. Monteer 50 pl PCR-reacties met de Phusion High Fidelity DNA Polymerase kit reagentia volgens de instructies van de fabrikant, behalve het polymerase. Gebruik 2 pl DNA-matrijs en Phusion HF buffer.
    2. Voeg de Phusion polymerase elke reactie na een hete start bij 98 ° C, gevolgd door 60 sec bij 98 ° C, gevolgd door 40 cycli van 15 sec bij 98 ° C, 30 sec bij 62 ° C en 30 sec bij 72 ° C met een laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 5 min. Na thermische fietsen, houd monsters bij 4 ° C.
    3. Analyseer de monsters door gelelektroforese op een 2% TAE agarose gel, en vervolgens extraheren en zuiveren DNA met de QIAquick Gel Extraction Kit volgens het protocol microcentrifuge inbegrepende kit.
  4. Screenen de IPC kandidaten voor hun vermogen om te versterken met behulp van qRPA.
    1. Bereid qRPA reacties zoals beschreven in hoofdstuk 3, met behulp van HIV-1 primers, een-FAM gelabelde probe specifiek voor de IPC (5'-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1 ] GGT TTT GTA ATT GGA A-3 '), en een totaal van 0, 10, 10 2, 10 3, 10 4, of 10 5 exemplaren van elk IPC kandidaat per reactie, het testen van alle concentraties in tweevoud.
    2. Kies de IPC kandidaat die het meest consistent versterkt en heeft de laagste limiet-van-detectie.
  5. Co-amplificeren HIV-1 en de IPC de optimale concentratie van IPC DNA te bepalen.
    1. Vergelijkbare afdeling 3, combineren de volgende in elke 50 ul reactie: 29,5 pi rehydratatie buffer, 2,1 ul van RPA van de forward primer [10 M], 2,1 ul van RPA reverse primer [10 M], 0,6 ul van HIV-1 HEX -gemerkte probe [10 uM], 10 glHIV-1-DNA bij variërende concentraties, 2,5 gl magnesiumacetaat en 1 enzym pellet. In plaats van het toevoegen van 3,2 ul nuclease-vrij water zoals bij stap 3.2.4, voeg 0,6 pl IPC FAM gelabelde probe [10 uM], en 2,6 pl IPC DNA. Gebruik de IPC concentratie die de detectiegrens-van-(LOD) wanneer qRPA wordt uitgevoerd met IPC DNA alleen (LOD gedefinieerd als de laagste concentratie waarbij de hoeveelheid fluorescentie signaal te groter maken dan de fluorescentie gegenereerd door de monsters met geen doelwit-DNA).
    2. Incubeer de monsters met behulp van de in paragraaf 1.1 beschreven protocol.
    3. Als de IPC niet amplificeren in elk monster overwegen het experiment te herhalen met een IPC concentratie een orde van grootte hoger. De optimale concentratie van IPC DNA voor de HIV-1 assay 10.000 kopieën / pl. Terwijl monsters worden als geldig beschouwd indien ofwel IPC of HIV-1 DNA amplificatie, idealiter de IPC vertoont detecteerbare amplificatie vanelke reactie.

5. Het bouwen van een standaard curve van meerdere Experimenten

  1. Zorg ervoor dat de gegevens voor elk experiment is geëxporteerd naar een spreadsheet programma zoals beschreven in paragraaf 3.13.
  2. Open en het script "JoVE_qRPA_standard_curve.m". Alle ingangen worden automatisch gevraagd in het commando venster. Nadat het script wordt geactiveerd, wordt de gebruiker automatisch gevraagd om aan te wijzen "Aantal databestanden" gebruikt om de standaard curve te bouwen.
  3. In het commando venster, typt u het aantal bestanden moeten worden gebruikt om de standaard curve en druk op enter te bouwen.
  4. Typ in het commando venster het aantal monsters en het aantal herhalingen in elke training bestand (op enter te drukken na elke invoer).
    OPMERKING: In de plaat lay-out in paragraaf 1.2 beschreven, waren er 6 monsters met verschillende concentraties en 2 herhalingen van elk monster).
  5. Typ in het commando venster de laagste DNEen concentratie gebruikt voor de opbouw van de standaard curve (in log10 kopieën) en druk op enter (voor de plaat lay-out in paragraaf 1.2 beschreven, de laagste template concentratie is '1' log10 kopieën).
  6. Typ in het commando venster het verschil in concentratie tussen elke standaard (in log10 kopieën) druk op enter (voor de plaat lay-out in paragraaf 1.2 beschreven, de concentratie-interval is '1' log10 kopieën).
  7. Na gevraagd, typt u de "Helling drempel" in het commando venster en druk op enter.
  8. In het commando venster, typt u de "Number (z) standaarddeviaties boven de achtergrond voor positieve drempel," en druk op enter. Typische waarden voor z bereik van 1 tot 5.
  9. Geef aan of de gegevens zijn verzameld met behulp van de PCR-apparaat ('1'), * .tiff microscoop beelden ('2'), of * .jpg microscoop beelden ('3') door het intikken van het nummer '1', '2' of '3', en pRessing voeren.
  10. Kiezen om een ​​nieuwe IPC drempel te stellen of om een ​​standaardwaarde voor de drempel te gebruiken door het intikken van 'Y' of 'n', respectievelijk, als daarom wordt gevraagd.
  11. Selecteer vervolgens elk van de spreadsheet-bestanden gebruikt om de standaard curve te bouwen.
    OPMERKING: Het script zal dan automatisch de HEX en FAM fluorescentie gegevens te importeren; bepalen of elke reactie was geldige (dwz of de fluorescentie signalen boven de drempels voor de HEX of FAM kanalen); bepalen de r 2 coëfficiënt voor een exponentiële, lineair, en tweede-orde polynoom fit; plot "log10 kopieën versus cyclus drempelwaarde" voor ieder monster gebruikt om de standaardkromme te bouwen; en maak een spreadsheet bestand met essentiële variabelen om de standaard curve voor validatie experimenten weer op te bouwen zonder dat de gebruiker opnieuw in te voeren alle van de input parameters weer.

6. Assay Validatie en kwantificering van onbekende monsters met behulp vande Standard Curve

  1. Gebruik het script "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m" in te schatten de precisie en nauwkeurigheid van de test met behulp van monsters met bekende concentraties of het gebruiken om monsters te kwantificeren met onbekende concentraties.
    OPMERKING: Omdat eerder gepubliceerde onderzoek toonde aan dat een exponentiële fit leverde de beste R-kwadraat coëfficiënt 18, dit script maakt gebruik van een exponentiële fit voor de standaard curve. Als een ander type geschikt is gewenst, kan het script dienovereenkomstig gewijzigd.
    1. Open en het script "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m". Nadat het script wordt geactiveerd, wordt de gebruiker automatisch gevraagd om alle ingangen in te voeren in het commando venster.
    2. Voer '1' om een ​​test te valideren met behulp van een standaard curve met bekende concentraties in het monster of voer '2' om onbekende monsters te kwantificeren.
    3. Wanneer u wordt gevraagd, ofwel kies een opgeslagen standaard curve of een nieuwe te bouwen door het invoeren van the informatie die automatisch wordt gevraagd in het commando venster (dezelfde informatie die nodig is voor de "JoVE_qRPA_standard_curve.m" script van hoofdstuk 5).
    4. Typ het aantal experimenten (dwz, spreadsheet-bestanden) te analyseren ter validatie / kwantificering.

7. Voorbereiding voor het verzamelen van gegevens met behulp van een fluorescentie microscoop en een verwarmde Chip

  1. Zorg ervoor dat de fluorescentie microscoop heeft een podium verwarming en 1-kanaals Precision Hoge Stabiliteit temperatuurregelaar op zijn plaats.
  2. Zorg ervoor dat de fluorescentie microscoop heeft een filter kubus op te wekken en het verzamelen van fluorescentie van elke fluorofoor. Prikkelen en het verzamelen van de FAM fluorescentie gegenereerd tijdens IPC DNA-amplificatie door middel van een GFP filter (excitatie BP 470/40 nm, emissie BP 520/50 nm). Prikkelen en het verzamelen van de HEX fluorescentie gegenereerd tijdens de HIV-1 DNA-amplificatie door middel van een HEX-filter (excitatie BP 530/30 nm, emissie BP 575/40 nm).
  3. Gebruik de microscoop script editing software om een ​​geautomatiseerd algoritme om het verzamelen van gegevens te repliceren op het PCR-apparaat te maken.
    1. Plaats eerst een "Instellingen" stap om de sluiter te sluiten. Voeg vervolgens een "Exposure" stap om de belichting in te stellen tot 60 sec. Plaats een "Snap" om de 60 seconden vertraging, waarvan de 1 min pre-incubatieperiode implementeert voeren. Voeg een "instellen" stap om de werkgroep te wijzigen in de GFP-filter. Plaats een andere "Exposure" stap om de blootstelling aan 200 msec passen. Alle vorderingen met behulp van de GFP of de HEX filter blokjes zal worden ingesteld op 200 msec.
    2. Na de "Exposure" stap, voeg een "Snap" en geef de camera waarmee het beeld zal worden genomen. Gebruik een andere "instellen" stap om de sluiter en een "Afbeelding opslaan" stap te sluiten om de afbeelding op te slaan in een tijdelijke map door de gebruiker gedefinieerde.
    3. Volgende schakelaar om de HEX filter kubus met een andere "Setting" stap en then voeg een "Exposure" op 200 msec, een "Snap" en een "Save Image" stap.
    4. Herhaal dit proces 59 keer met een initiële vertraging van 20 seconden in plaats van 60 (vlakbij sluitertijd, wacht 20 seconden, schakel over naar GFP filter kubus, ingesteld blootstelling aan 200 msec, snap, dicht sluiter, sparen, switch naar HEX filter kubus, de belichting 200 msec, snap).
  4. Maak een chip die qRPA reacties zullen houden.
    1. Voor experimenten met behulp van de microscoop, gebruik het bestand JoVE_qRPA_base.ai naar een 40 x 15 mm rechthoekige basis gesneden uit een vel 1/8 "dik zwart acryl met behulp van een laser cutter ingesteld op 100% vermogen, 10% snelheid.
    2. Gebruik het bestand JoVE_qRPA_well.ai de reactie snijden en bestaande uit een 10 x 10 mm vierkant met een 5 mm diameter cirkelvormig gat gesneden uit een plaat van 1,5 mm dik helder acryl.
    3. Hechten maximaal drie putten op een basisstation met behulp van superlijm gel.
    4. Droog 's nachts.

8. Data Collection en Analysis Met behulp van een fluorescentie microscoop

  1. Bereid de microscoop voor het verzamelen van gegevens door het laden van de automatische gegevensverzameling script JoVE_AxioVision_Script.ziscript.
    1. Stel het thermostaatbad 48 ° C en verwarm de reactie chip op het thermostaatbad ongeveer 20 minuten. Een temperatuurinstelling van 48 ° C handhaaft een temperatuur van 39 ° C in het reactieputje (gegevens niet getoond).
    2. Met behulp van een 10X, NA 0,45 doelstelling richten op de bovenkant van de binnenrand van de reactie goed met de GFP filter plaats. De randen van acryl zijn Autofluorescente na lasersnijden en kan gemakkelijk worden gevisualiseerd. Na het scherpstellen, niet de hoogte van de microscoop podium niet aanpassen tot alle gegevens worden verzameld.
  2. Monteer de qRPA master mix in een aangewezen voorversterking werkruimte zoals beschreven in stap 4.5.1. Voor elk monster, meng een enzym pellet, meester mix, en HIV-1 DNA-template in een microcentrifugebuis. Voeg 2,5 gl magnesiumacetaat de eerste keuze reactietijdn en kort vortex.
  3. Snel vervoeren van de microcentrifugebuis met de qRPA monster op de fluorescentie microscoop.
    1. Pipet voorzichtig 30 ul van de RPA reactie in de reactie heel goed zonder het creëren van bubbels. Breng een druppel PCR-grade minerale olie via RPA reactie om verdamping te voorkomen.
    2. Plaats de put direct onder de microscoop objectief, en zorg ervoor dat het alleen het centrum van het goed, geen van de auto-tl acryl randen. Na het goed gepositioneerd is, voert u het geautomatiseerde script 7. ene beeld JPEG Het script genereert met behulp van de ene JPEG-afbeelding met de HEX filter kubus elke 20 seconden FAM filter kubus en.
  4. Nadat het script is voltooid, dragen deze beelden uit de map tijdelijke opslag voordat u extra monsters.
    1. Maak 2 mappen: 1 voor elke fluorofoor (dat wil zeggen, 'HEX' en 'FAM'). Bewaar beide mappen in dezelfde bovenliggende map. In elk fluorofoormap een map met het aantal DNA kopieën aanwezig in het monster (bijvoorbeeld 0, 10, enz.).
    2. Overdracht van alle dossiers met het voorvoegsel 'HEX' in de bijbehorende submap in de 'HEX' map. Overdracht van alle dossiers met het voorvoegsel 'GFP' in de bijbehorende submap in de 'FAM' map.
  5. Herhaal Secties 8,2-8,4 voor qRPA reacties met 0, 10, 10 2, 10 3, 10 4, en 10 5 HIV-1 DNA-kopieën.
  6. Na het verzamelen van de gegevens voor alle qRPA monsters in een experiment, laadt u het script "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m." Wanneer u wordt gevraagd door het script, selecteert u de bovenliggende map met de 2 fluorfoor mappen, die op zijn beurt de beelden voor elke concentratie in submappen bevatten.
    OPMERKING: Het script wordt automatisch een spreadsheet-bestand in de bovenliggende map waarin de HEX fluorescentie data in een blad nam wordt opgeslagen genererened 'HEX', en de FAM fluorescentie gegevens worden opgeslagen in een blad genaamd "FAM". In elk vel, wordt het aantal cycli weergegeven in kolom B en de real-time fluorescentie gegevens toenemende concentraties van matrijs worden in de kolommen C, D, enz. Elk real-time fluorescentie referentiepunt de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van het beeld dat op dat tijdstip.
  7. Gebruik het standaard scatterplot functie in het spreadsheetprogramma cellen B2 plotten: H61 van de "HEX" en "FAM" vellen real time fluorescentie te visualiseren en genereren percelen vergelijkbaar met die in figuren 2A, 2B, 3A en 3B.
    OPMERKING: De spreadsheet gegenereerd in stap 8.6 kan ook worden gebruikt in de scripts "JoVE_qRPA_standard_curve.m" en "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m".

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voor het selecteren van een sequentie te dienen als de IPC qRPA experimenten met target (HIV-1) DNA interne positieve controle (IPC) kandidaten worden gegenereerd en gescreend op hun vermogen om amplificeren qRPA reacties zonder HIV-1 DNA aanwezig. IPC kandidaten zijn langer dan de doel (HIV-1) DNA voorkomen IPC vorming van niet-concurrerende HIV-1 amplicon formatie. Zoals getoond in figuur 2A, het genereren van twee C. parvum IPC kandidaten werd geverifieerd door de aanwezigheid van 415 en 435...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om een ​​zinvolle kwantificering van gegevens met behulp van de MATLAB-algoritme te verkrijgen, moet de gebruiker de juiste ingang waarden te selecteren wanneer u wordt gevraagd. Na het starten van elk script in de paragrafen 5 en 6, worden alle variabelen automatisch gevraagd in het commando venster en uitgangen worden automatisch gegenereerd. In paragraaf 5.7 wordt de gebruiker gevraagd om een ​​helling drempel selecteren. De waarde van de helling drempel beïnvloedt het kwadraat van de correlatiecoëfficiënt (R2)<...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd gefinancierd door een subsidie ​​van de Bill & Melinda Gates Foundation door de Grand Challenges in Global Health Initiative.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
qRPA Assay
HIV-1 voorwaartse primerIntegrated DNA Technologiescustom DNA oligo's5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3’ 
HIV-1 achterwaartse primerIntegrated DNA Technologiescustom DNA oligo's5’-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3’ 
HIV-1 sondeBioSearch Technologies custom DNA oligo's5’- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3’ 
IPC sondeBioSearch Technologies custom DNA oligo's5’-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3’
RPA exo reagentia (pellets, rehydratatiebuffer, magnesiumacetaatTwistDxTwistAmp exo
PCR buisjesstripsBioRadTLS0801
PCR vlakkap buisjesstripsBioRadTCS0803
Micro-seal kleefstofBioRad558/MJ 
HIV-1 doelwit (pHIV-IRES- eYFPΔEnvΔVifΔVpr)custom plasmid, zie: Segall, H. I., Yoo, E. & Sutton, R. E. Karakterisering en detectie van kunstmatig replicatiebekwaam lentivirus met gewijzigd gastheerbereik. Molecular Therapy 8, 118–129, doi:10.1016/S1525-0016(03)00134-5 (2003).
Menselijk mannelijke genomische DNAApplied Biosystems360486
96 wel koude-blokCole ParmerEW-36700-48
Thermische cyclerBioRadCFX96
MiniFugeVWR93000-196
VortexVWR58816-121
Tris buffer 1.0 M, pH 8.0EMD Millipore648314
EDTA 0.5 M, pH 8.0PromegaV4321
Nuclease-vrij waterAmbionAM9937
IPC Ontwikkeling
Cryptosporidium parvum IPC sjabloonWaterborne IncP102CHet is ook mogelijk om een dubbelstrengs synthetisch doelwit te bestellen van IDT als de gebruiker niet in staat is om met C. parvum te werken (een BSL-2 infectieus agens). PCR en RPA primers voor C. parvum werden ontworpen met behulp van GenBank toegangsnummer AF115377.1
PCR lange voorwaartse primerIntegrated DNA Technologiescustom DNA oligo's5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G/ ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3’
PCR lange achterwaartse primerIntegrated DNA Technologiescustom DNA oligo's5’- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G/ TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3’
Phusion High-Fidelity DNA PolymeraseNew England BiolabsM0530S
Qiaquick Gel Extractie KitQiagen28704
TAE 10X bufferEMD Millipore574797
AgaroseSigma AldrichA9539
Microscoop Experimenten
Rechtopstaande fluorescentiemicroscoopZeissZeiss Imager.J1
Stage verwarmerBioscience ToolsTC-GSH
1-kanaals precisie hoge stabiliteit temperatuurregelaarBioscience ToolsTC-1100S
FAM/GFP filter kubusZeissfilter set 38 (000000-1031-346)excitatie BP 470/40 nm, emissie BP 520/50 nm
HEX filter kubusChroma49014excitatie BP 530/30 nm, emissie BP 575/40 nm
Laser snijderEngraver's NetworkVLS3.60
1/8" zwart acrylMcMaster Carr8505K113
1,5 mm helder acrylMcMaster CarrPD-72268940 
Super lijmOffice DepotDuro super lijm 
PCR-kwaliteit mineraal olieSigma AldrichM8662-5VL
Data Analyse
Microsoft ExcelMicrosoft
MATLABMATLAB
MATLAB script: "JoVE_qRPA_standard_curve.m”Opgenomen in SI
MATLAB script: "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m”Opgenomen in SI
MATLAB script: "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m”Opgenomen in SI
Adobe IllustratorAdobe
JoVE_qRPA_well.aiOpgenomen in SI
JoVE_qRPA_base.aiOpgenomen in SI
AxioVision softwareZeiss
JoVE_AxioVision_Script.ziscriptOpgenomen in SI

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yoon, J. -Y., Kim, B. Lab-on-a-Chip Pathogen Sensors for Food Safety. Sensors. 12 (8), 10713-10741 (2012).
  2. Quintero-Betancourt, W., Peele, E. R., Rose, J. B. Cryptosporidium parvum and Cyclospora cayetanensis: A review of laboratory methods for detection of these waterborne parasites. Journal of Microbiological Methods. 49 (3), 209-224 (2002).
  3. Sedlak, R. H., Jerome, K. R. Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 75 (1), 1-4 (2013).
  4. Asiello, P. J., Baeumner, A. J. Miniaturized isothermal nucleic acid amplification, a review. Lab on a Chip. 11 (8), 1420-1430 (2011).
  5. Piepenburg, O., Williams, C. H., Stemple, D. L., Armes, N. A. DNA detection using recombination proteins. PLoS Biology. 4 (7), 1115-1121 (2006).
  6. Krõlov, K., Frolova, J., et al. Sensitive and Rapid Detection of Chlamydia trachomatis by Recombinase Polymerase Amplification Directly from Urine Samples. The Journal of Molecular Diagnostics JMD. 16 (1), 127-135 (2014).
  7. Santiago-Felipe, S., Tortajada-Genaro, L. a, Puchades, R., Maquieira, A. Recombinase polymerase and enzyme-linked immunosorbent assay as a DNA amplification-detection strategy for food analysis. Analytica Chimica Acta. 811 (1), 81-87 (2014).
  8. Kersting, S., Rausch, V., Bier, F. F., von Nickisch-Rosenegk, M. Rapid detection of Plasmodium falciparum with isothermal recombinase polymerase amplification and lateral flow analysis. Malaria Journal. 13 (1), 99(2014).
  9. Crannell, Z. A., et al. Nucleic Acid test to diagnose cryptosporidiosis: lab assessment in animal and patient specimens. Analytical Chemistry. 86 (5), 2565-2571 (2014).
  10. Rohrman, B. A., Richards-Kortum, R. R. A paper and plastic device for performing recombinase polymerase amplification of HIV DNA. Lab on a Chip. 12 (17), 3082(2012).
  11. Loo, J. F. C., Lau, P. M., Ho, H. P., Kong, S. K. An aptamer-based bio-barcode assay with isothermal recombinase polymerase amplification for cytochrome-c detection and anti-cancer drug screening. Talanta. 115 (1), 159-165 (2013).
  12. Euler, M., et al. Development of a panel of recombinase polymerase amplification assays for detection of biothreat agents. Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1110-1117 (2013).
  13. Abd El Wahed, A., et al. A portable reverse transcription recombinase polymerase amplification assay for rapid detection of foot-and-mouth disease virus. PloS One. 8 (8), e71642(2013).
  14. Escadafal, C., et al. Rapid Molecular Assays for the Detection of Yellow Fever Virus in Low-Resource Settings. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (3), e2730(2014).
  15. Hutson, S. L., et al. T. gondii RP Promoters & Knockdown Reveal Molecular Pathways Associated with Proliferation and Cell-Cycle Arrest. PLoS ONE. 5 (11), 15(2010).
  16. Segall, H. I., Yoo, E., Sutton, R. E. Characterization and detection of artificial replication-competent lentivirus of altered host range. Molecular Therapy. 8 (1), 118-129 (2003).
  17. DNA Extraction from Serum. Life Technologies. , Available from: http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/nucleic-acid-purification-and-analysis/dna-extraction-protocols/dna-extraction-from-serum.html (2014).
  18. Crannell, Z. A., Rohrman, B. A., Richards-Kortum, R. Quantification of HIV-1 DNA using Real-Time Recombinase Polymerase Amplification. Analytical Chemistry. 86 (12), (2014).
  19. Sollis, K. a, et al. Systematic review of the performance of HIV viral load technologies on plasma samples. PloS one. 9 (2), e85869(2014).
  20. Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1-infected adults and adolescents. , Department of Health and Human Services. Washington D.C. 1-166 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Quantitative Recombinase Polymerase AmplificationRecombinase Polymerase AmplificationInternal Positive ControlReal time PCR MachineStandard Curve ConstructionHIV 1 DNA QuantificationFluorescence Data AnalysisThermal Cycler ProtocolPoint of care Assay DevelopmentMagnesium Acetate Activation

Related Articles