Ontwikkeling van een kwantitatieve Recombinase Polymerase Amplificatie test met een interne positieve controle

Summary

Provided is a protocol for developing a real-time recombinase polymerase amplification assay to quantify initial concentration of DNA samples using either a thermal cycler or a microscope and stage heater. Also described is the development of an internal positive control. Scripts are provided for processing raw real-time fluorescence data.

Abstract

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to quantify DNA sample concentration using a standard curve. In this manuscript, a detailed protocol for developing and implementing a real-time quantitative recombinase polymerase amplification assay (qRPA assay) is provided. Using HIV-1 DNA quantification as an example, the assembly of real-time RPA reactions, the design of an internal positive control (IPC) sequence, and co-amplification of the IPC and target of interest are all described. Instructions and data processing scripts for the construction of a standard curve using data from multiple experiments are provided, which may be used to predict the concentration of unknown samples or assess the performance of the assay. Finally, an alternative method for collecting real-time fluorescence data with a microscope and a stage heater as a step towards developing a point-of-care qRPA assay is described. The protocol and scripts provided may be used for the development of a qRPA assay for any DNA target of interest.

Introduction

Kwantitatieve nucleïnezuur amplificatie is een belangrijke techniek voor detectie van milieu, voedsel overgedragen en water ziekteverwekkers en klinische diagnostiek. Real-time kwantitatieve PCR (qPCR) is de gouden standaard methode voor gevoelige, specifieke en kwantitatieve detectie van nucleïnezuren, bijvoorbeeld, HIV-1 virale lading testen, detectie van bacteriële pathogenen, en screening op vele andere organismen ^{1 - 3.} Gedurende real-time qPCR, primers amplificeren pathogeen DNA in cycli, en een fluorescent signaal gegenereerd dat evenredig is met de hoeveelheid geamplificeerd DNA in het monster bij elke cyclus. Een monster met een onbekende....

Protocol

1. Programmeer de Thermal Cycler voor Real-time qRPA Reacties

1. Maak een nieuw protocol in het PCR-apparaat software.
   1. Plaats een pre-incubatiestap: 39 ° C gedurende 1 min.
   2. Voeg een tweede stap: 39 ° C gedurende 20 seconden, gevolgd door een plaat gelezen.
   3. Tot slot plaatst u een "ga naar" dat de tweede stap wordt herhaald 59 keer.
   4. Sla het protocol.
2. Maak een nieuwe plaat in de "plaat editor" tab van de software. Selecteer wells overeenkomen met de locaties van de RPA reacties (hier gebruik putjes A1, A4-A8, B1 en B4-B8).
   LET OP: Het is niet belangrijk of het type monster van de putten (bijvo....

Results

Voor het selecteren van een sequentie te dienen als de IPC qRPA experimenten met target (HIV-1) DNA interne positieve controle (IPC) kandidaten worden gegenereerd en gescreend op hun vermogen om amplificeren qRPA reacties zonder HIV-1 DNA aanwezig. IPC kandidaten zijn langer dan de doel (HIV-1) DNA voorkomen IPC vorming van niet-concurrerende HIV-1 amplicon formatie. Zoals getoond in figuur 2A, het genereren van twee C. parvum IPC kandidaten werd geverifieerd door de aanwezigheid van 415 en 435.......

Discussion

Om een ​​zinvolle kwantificering van gegevens met behulp van de MATLAB-algoritme te verkrijgen, moet de gebruiker de juiste ingang waarden te selecteren wanneer u wordt gevraagd. Na het starten van elk script in de paragrafen 5 en 6, worden alle variabelen automatisch gevraagd in het commando venster en uitgangen worden automatisch gegenereerd. In paragraaf 5.7 wordt de gebruiker gevraagd om een ​​helling drempel selecteren. De waarde van de helling drempel beïnvloedt het kwadraat van de correlatiecoëfficiënt ^(R2)<.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
qRPA Assay
HIV-1 forward primer	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos	5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3’
HIV-1 reverse primer	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos	5’-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3’
HIV-1 probe	BioSearch Technologies	custom DNA oligos	5’- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3’
IPC probe	BioSearch Technologies	custom DNA oligos	5’-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3’
RPA exo reagents (pellets, rehydration buffer, magnesium acetate	TwistDx	TwistAmp exo
PCR tube strips	BioRad	TLS0801
PCR flat cap tube strips	BioRad	TCS0803
Micro-seal adhesive	BioRad	558/MJ
HIV-1 target (pHIV-IRES- eYFPΔEnvΔVifΔVpr)			custom plasmid, see: Segall, H. I., Yoo, E. & Sutton, R. E. Characterization and detection of artificial replication-competent lentivirus of altered host range. Molecular Therapy 8, 118–129, doi:10.1016/S1525-0016(03)00134-5 (2003).
Human male genomic DNA	Applied Biosystems	360486
96 well cold-block	Cole Parmer	EW-36700-48
Thermal cycler	BioRad	CFX96
MiniFuge	VWR	93000-196
Vortex	VWR	58816-121
Tris buffer 1.0 M, pH 8.0	EMD Millipore	648314
EDTA 0.5 M, pH 8.0	Promega	V4321
Nuclease free water	Ambion	AM9937
IPC Development
Cryptosporidium parvum IPC template	Waterborne Inc	P102C	It is also possible to order a double stranded synthetic target from IDT if the user is unequipped to work with C. parvum (a BSL-2 infectious agent). PCR and RPA primers for C. parvum were designed using GenBank accession number AF115377.1
PCR long forward primer	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos	5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G/ ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3’
PCR long reverse primer	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos	5’- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G/ TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3’
Phusion High-Fidelty DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530S
Qiaquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
TAE 10X buffer	EMD Millipore	574797
Agarose	Sigma Aldrich	A9539
Microscope Experiments
Upright fluorescence microscope	Zeiss	Zeiss Imager.J1
Stage heater	Bioscience Tools	TC-GSH
1-Channel Precision High Stability Temperature Controller	Bioscience Tools	TC-1100S
FAM/GFP filter cube	Zeiss	filter set 38 (000000-1031-346)	excitation BP 470/40 nm, emission BP 520/50 nm
HEX filter cube	Chroma	49014	excitation BP 530/30 nm, emission BP 575/40 nm
Laser cutter	Engraver's Network	VLS3.60
1/8" black acrylic	McMaster Carr	8505K113
1.5 mm clear acrylic	McMaster Carr	PD-72268940
Super glue	Office Depot	Duro super glue
PCR grade mineral oil	Sigma Aldrich	M8662-5VL
Data Analysis
Microsoft Excel	Microsoft
MATLAB	MATLAB
MATLAB script: "JoVE_qRPA_standard_curve.m”	Included in SI
MATLAB script: "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m”	Included in SI
MATLAB script: "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m”	Included in SI
Adobe Illustrator	Adobe
JoVE_qRPA_well.ai	Included in SI
JoVE_qRPA_base.ai	Included in SI
AxioVision software	Zeiss
JoVE_AxioVision_Script.ziscript	Included in SI