Biofunctionalized Pruisisch blauw nanopartikels voor Multimodaal Molecular Imaging Toepassingen

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de synthese van biofunctionele Pruisisch blauwe nanodeeltjes en hun gebruik als multimodale, moleculaire beeldvormingsmiddelen. De nanodeeltjes hebben een kern-schaal ontwerp waarbij gadolinium- of mangaanionen in de nanodeeltjekern MRI-contrast genereren. De biofunctionele schaal bevat fluoroforen voor fluorescentiebeeldvorming en targeting liganden voor moleculaire targeting.

Samenvatting

Multimodale, moleculaire beeldvorming kan de visualisatie van biologische processen op cellulair, subcellulaire en moleculaire niveau resoluties met behulp van meerdere, complementaire beeldvormende technieken. Deze beeldvormende middelen vergemakkelijken het real-time evaluatie van trajecten en mechanismen in vivo, waarbij zowel diagnostische en therapeutische werking versterken. Dit artikel presenteert het protocol voor de synthese van biofunctionalized Pruisisch blauw nanodeeltjes (PB NP) - een nieuwe klasse van middelen voor gebruik in multimodale, moleculaire beeldvorming toepassingen. De beeldvormende modaliteiten opgenomen in de nanodeeltjes, fluorescentie beeldvorming en magnetische resonantie imaging (MRI), complementaire functies. De PB NP's beschikken over een kern-schil design waarbij gadolinium en mangaan ionen opgenomen in de interstitiële ruimten van de PB rooster genereren MRI contrast, zowel in _T1 en _T2-gewogen sequenties. De PB NP zijn gecoat met fluorescerende avidine middels elektrostatische zichzelf alstage, die fluorescentie beeldvorming mogelijk maakt. Het avidine gecoate nanodeeltjes gemodificeerd met gebiotinyleerde liganden die moleculaire gebied en de nanodeeltjes verlenen. De stabiliteit en de toxiciteit van de nanodeeltjes gemeten, evenals hun MRI relaxiviteiten. De multimodale, moleculaire beeldvorming mogelijkheden van deze biofunctionalized PB NP's worden vervolgens aangetoond door ze te gebruiken voor fluorescentie beeldvorming en moleculaire MRI in vitro.

Inleiding

Moleculaire beeldvorming is de niet-invasieve en gerichte visualisatie van biologische processen op cellulair, subcellulaire en moleculaire niveau ^1. Moleculaire beeldvorming maakt een model in zijn inheemse micro blijven terwijl de endogene wegen en mechanismen worden beoordeeld in real-time. Typisch moleculaire beeldvorming omvat de toediening van een exogene beeldvormingsmiddel in de vorm van een klein molecuul, macromolecuul, of nanodeeltjes te visualiseren, doel en sporenelementen relevante fysiologische processen bestudeerd ^2. De verschillende beeldvormende modaliteiten die zijn onderzocht in de moleculaire beeldvorming onder MRI, CT, PET, SPECT, echografie Fotoakoestiek, Raman spectroscopie, bioluminescentie, fluorescentie, en opklaren ^3. Multimodale beeldvorming is de combinatie van twee of meer beeldvormende modaliteiten waarbij de combinatie vergroot het vermogen te visualiseren en karakteriseren verschillende biologische processen en gebeurtenissen ^4. Multimodal beeldvorming maakt gebruik van de sterke punten van de individuele beeldvormende technieken, terwijl compenseren hun individuele beperkingen ^3.

Dit artikel presenteert het protocol voor de synthese van biofunctionalized Pruisisch blauw nanodeeltjes (PB NP) - een nieuwe klasse van multimodale, moleculaire beeldvorming agenten. De PB NP worden gebruikt voor fluorescentie beeldvorming en moleculaire MRI. PB is een pigment dat bestaat uit afwisselende ijzer (II) en ijzer (III) atomen in een face-centered cubic netwerk (figuur 1). De PB rooster bestaat uit lineaire cyanide liganden in een Fe ^II - CN - Fe ^III verbinding die kationen bevat om belastingen in het driedimensionale netwerk ⁵ evenwicht. Het vermogen van PB om kationen te integreren in haar rooster wordt uitgebuit door afzonderlijk laden gadolinium en mangaan ionen in de PB NP voor MRI contrast.

De reden voor het nastreven van een nanodeeltje ontwerp voor MRI contrast is vanwegede voordelen van dit ontwerp biedt ten opzichte van de huidige MRI-contrastmiddelen. De overgrote meerderheid van de Amerikaanse FDA goedgekeurde MRI contrastmiddelen gadolinium chelaten die paramagnetisch van aard en geven positieve contrast door de spin-rooster relaxatie mechanisme ^6,7,8. In vergelijking met een gadolinium-chelaat dat lage signaalintensiteit verschaft op zichzelf biedt de inbouw van meerdere gadolinium-ionen in het rooster PB van de nanodeeltjes verhoogde signaalintensiteit (positief contrast) ^3,9. Verder is de aanwezigheid van meerdere gadolinium-ionen in het rooster PB verhoogt de algehele spindichtheid en de omvang van paramagnetisme van de nanodeeltjes, die het lokale magnetische veld in de nabijheid ervan verstoort, en zo werden negatief contrast door de spin-spin relaxatietijd mechanisme. Dus de gadoliniumbevattende nanodeeltjes functioneren zowel als T ₁ (positief) en T ₂ (negatief) contrastmiddelen ^10,11.

In een subgroep van patiënten met een verminderde nierfunctie, is de toediening van gadolinium gebaseerde contrastmiddelen in verband gebracht met de ontwikkeling van nefrogene systemische fibrose ^{8,12, 13.} Deze observatie heeft een onderzoek gevraagd naar het gebruik van alternatieve paramagnetische ionen als contrastmiddelen voor MRI. Daarom wordt de veelzijdige ontwerp van de nanodeeltjes aangepast aan mangaanionen integreren in de PB rooster. Vergelijkbaar met gadoliniumchelaten, mangaan-chelaten ook paramagnetisch en worden typisch gebruikt om positieve signaalintensiteit verstrekken MRI ^7,14. Zoals gadoliniumbevattende PB NP, de op mangaan bevattende PB NP tevens fungeren als _T1 (positief) en _T2 (negatief) contrastmiddelen.

Om fluorescentie beeldvorming capaciteiten omvatten, worden de nanodeeltjes "kernen" bekleed met een "biofunctionele" schil bestaande uit de fluorescentie-gemerkt glycoproteïne avidine (Figuur 1). Avidine niet alleen mogelijk fluorescentie beeldvorming, maar dient ook als een docking platform gebiotinyleerde liganden die specifieke cellen en weefsels richten. Het avidine-biotine binding is een van de sterkste bekende niet-covalente bindingen gekenmerkt door zeer sterke bindingsaffiniteit tussen avidine en biotine ^15. De binding van gebiotinyleerde liganden aan de met avidine beklede PB NPs verleent moleculaire gebied en de PB NPs.

De motivatie voor het nastreven van fluorescentie en MR beeldvorming met behulp PB NP is omdat deze beeldvormende modaliteiten beschikken over complementaire functies. Fluorescentie beeldvorming is een van de meest gebruikte optische moleculaire beeldvorming, en voorziet in de gelijktijdige weergave van meerdere objecten hoge gevoeligheden ^1,16,17. Fluorescentie beeldvorming is een veilige, niet-invasieve modaliteit, maar gaat gepaard met lage diepte van penetratie en ruimtelijke resoluties ^1,3,16. Anderzijds, MRI genereert hoge temporele eend ruimtelijke resolutie niet-invasief en zonder het vereiste van ioniserende straling ^1,3,16. Maar MRI kampen met een lage gevoeligheid. Daarom fluorescentiebeeldvorming en MRI werden geselecteerd als moleculaire beeldvormingstechnieken vanwege hun complementariteit van penetratiediepte, gevoeligheid en ruimtelijke resolutie.

Dit artikel presenteert het protocol voor de synthese en biofunctionalization van de PB NP, gadoliniumbevattende PB NP (GDPB), en mangaanbevattende PB NP (MnPB) ^10,11. De volgende werkwijzen zijn: 1) van grootte, lading en temporele stabiliteit van de nanodeeltjes, 2) beoordeling van de cytotoxiciteit van de nanopartikels, 3) het meten van MRI relaxiviteiten, en 4) het gebruik van de nanodeeltjes fluorescentie en moleculaire MR beeldvorming van een populatie van doelcellen in vitro. Deze resultaten tonen het potentieel van de NP voor gebruik als multimodale moleculaire beeldvormende middelen in vivo.

Protocol

1. Synthese van PB NP, GDPB en MnPB

Synthese van de nanodeeltjes (PB NP, GDPB, of MnPB) wordt bereikt met behulp van een éénpotssynthese regeling door het uitvoeren van de stappen die hieronder beschreven:

1. Bereid oplossing A met 5 ml van 5 mM kaliumhexacyanoferraat (II) in gedeïoniseerd (DI) water. Afhankelijk van het type nanodeeltjes gesynthetiseerd - PB NP, GDPB of MnPB bereiden oplossing 'B' als volgt:
   1. Voor PB NP: bereid 10 ml van een oplossing bevattende 2,5 mM ijzer (III) chloride in DI water.
   2. Voor GDPB NP: bereiden 10 ml van een oplossing bevattende 2,5 mM elk van gadolinium (III) nitraat en ijzer (III) chloride in DI water
   3. Voor MnPB NP: bereiden 10 ml van een oplossing bevattende 2,5 mM elk van mangaan (II) chloride en ijzer (III) chloride in DI water.
2. Voeg oplossing 'B' een rondbodemkolf, en roer de inhoud van de kolf bij kamertemperatuur (RT) en1,000 rpm. Voeg oplossing A druppelsgewijs in de rondbodemkolf bevattende oplossing 'B'. Controleer de stroomsnelheid voor de toevoeging van oplossing "A" tot "B" door een peristaltische pomp op ongeveer 10 ml / uur afgeven.
3. Blijf roeren bij 1000 opm bij kamertemperatuur gedurende nog 30 minuten na toevoeging van oplossing "A" tot "B" is voltooid. Stop met roeren en het verzamelen van het mengsel.
4. Breng porties van het mengsel in microcentrifugebuizen de nanodeeltjes vrij van ongereageerde componenten spoelen. Voeg 5 M NaCl (0,2 ml NaCl / ml reactiemengsel) aan elk aliquot te helpen deeltjes verzameling door centrifugatie.
5. Centrifuge elk aliquot van nanodeeltjes gedurende ten minste 10 minuten bij 20.000 x g. Na het centrifugeren, verwijder voorzichtig het supernatant.
6. Resuspendeer elke nanodeeltjes pellet in 1 ml DI water via geluidsgolven met een microtip (sonicatie puls aan / uit = 1/1 sec, amplitude = 50%, duur =5 sec, sonicator vermogen = 125 W) te breken van de pellet.
7. Herhaal stap 1,4-1,6 minstens 3 × zodat de nanodeeltjes vrij van componenten van de eerste reactie en reactiebijproducten. Na de laatste centrifugeren, opnieuw in suspensie deeltjes in 1 ml DI water.

2. Biofunctionalization van PB NP, GDPB en MnPB

Biofunctionalization van de nanodeeltjes omvat bekleding van het nanodeeltje "kernen" met avidine en het toevoegen van gebiotinyleerd liganden zoals hieronder beschreven:

1. Coating van de Nanodeeltjes met TL Avidine
   Coating van de nanodeeltjes met fluorescerende avidine wordt bereikt door elektrostatisch zelfassemblage waarbij positief geladen avidine (pI ~ 10.5) wordt bedekt op de volgende ¹⁸ negatief geladen nanodeeltjes:
   1. Bereid schorsingen van de PB NP, GDPB, of MnPB in 1 ml DI water. Filter Alexa Fluor 488-gelabeld avidine (A488; gereconstitueerd in DI-water)door een 0,2 pm nylon filter microcentrifuge bij 14.000 xg gedurende 10 min. Voeg ≤0.2 mg avidine / mg nanodeeltjes. Voeg elke gefilterde hoeveelheid van A488 afzonderlijk aan de fracties van PB NP, GDPB of MnPB.
   2. Neem contact op met de nanodeeltjes met A488 voor 2-4 uur onder voorzichtig schudden of rotatie bij 4 ° C. Bescherm de monsters van licht met behulp van aluminiumfolie.
      OPMERKING: Deze stap levert A488 gecoat PB NP (PB-A488), GDPB (GDPB-A488), en MnPB (MnPB-A488).
2. Bevestiging van Gebiotinyleerde Antilichamen
   Bevestiging van gebiotinyleerde antilichamen gericht op de met avidine gecoate nanodeeltjes wordt als volgt bereikt middels avidine-biotine interacties:
   1. Bereid schorsingen van de avidine gecoate nanodeeltjes - PB-A488, GDPB-A488, en MnPB-A488 in 1 ml DI water. Filter gebiotinyleerd antilichaam (zoals geleverd door de fabrikant) door een 0,2 pm nylon filter microcentrifuge bij 14.000 xg gedurende 10 min.
      OPMERKING: Hier, de huidige studie maakt gebruik van Biotinylated anti-neuron-glia antigen 2 (ANG2) dat gericht NG2 overexpressie gebracht in cellen en weefsels van het centrale zenuwstelsel en gebiotinyleerd anti-humaan eotaxine-3 (Eot3) die receptoren overexpressie van eosinofielen of eosinofiel cellijnen richt.
   2. Voeg elk gefilterde hoeveelheid gebiotinyleerd antilichaam afzonderlijk de hoeveelheden van de met avidine gecoate nanodeeltjes. Voeg ≤0.05 mg gebiotinyleerd antilichaam / mg avidine-gecoate nanodeeltjes. Contact met avidine gecoate nanodeeltjes met gebiotinyleerde antilichamen (ANG2 of Eot3) gedurende 2-4 uur onder zacht schudden of roteren bij 4 ° C. Bescherm de monsters van licht met behulp van aluminiumfolie.
      OPMERKING: Deze stap levert antilichaam gecoate nanodeeltjes (bijv GDPB-A488-Eot3 en MnPB-A488-ANG2).

3. Sizing, Zeta-Potentiaal, en temporele stabiliteit van de Nanodeeltjes

De grootteverdeling, lading en stabiliteit van de nanodeeltjes gemeten met dynamischelichtverstrooiing (DLS) methode zoals hieronder beschreven:

1. Dimensionering van de Nanodeeltjes
   Dimensionering van de nanodeeltjes wordt bereikt met behulp van dynamische lichtverstrooiing als volgt:
   1. Voeg 10 ul van het nanodeeltje monster (1 mg / ml) en 990 gl DI water in een plastic wegwerp cuvet.
      LET OP: Dit is representatieve waarde voor een goede DLS signaal.
   2. Cap de cuvet en vortex goed te mengen. Plaats de cuvette in een systeem om deeltjesgrootte analyseren om de grootte van de nanodeeltjes te meten. Uit te voeren analyse van de deeltjesgrootte op een meting hoek van 173 °.
2. Zeta Potentieel van de Nanodeeltjes
   Zeta potentiaal van de nanodeeltjes wordt als volgt gemeten met fase analyse lichtverstrooiing:
   1. Voeg 100 ul van het nanodeeltje monster (1 mg / ml) aan 900 gl DI water in een wegwerp plastic capillaire cel. Deze waarde is representatief voor een goede zetapotentiaal meting.
   2. Plaats de capillairey cel in een systeem om zetapotentiaal analyseren om het zeta potentieel van de nanodeeltjes met standaardparameters bij 25 ° C gemeten.
3. Temporele stabiliteit van de Nanodeeltjes
   Temporele stabiliteit van de nanodeeltjes wordt gemeten met behulp van dynamische lichtverstrooiing als volgt:
   1. Beoordeel de stabiliteit van nanodeeltjes door meting van de grootte van de nanodeeltjes in DI water en Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) zoals in paragraaf 3.1 beschreven.
   2. Herhaal de grootte metingen in DI water en DMEM keer / dag gedurende 5 dagen.

4. De cytotoxiciteit van de Nanodeeltjes

De cytotoxiciteit van de nanodeeltjes wordt als volgt gemeten met een XTT celproliferatie assay:

1. Seed 10.000-15.000 cellen / putje van elk celtype onderzocht (Neuro2a, BSG D10, EoL-1 en OE21) in een 96-well plaat. Zorg ervoor dat de totale omvang van de gezaaide cellen niet eXceed 0,2 ml / putje. Incubeer gezaaide cellen overnacht bij 37 ° C en 5% _CO2.
2. Contact opnemen met nanodeeltjes met de cellen:
   1. Incubeer de cellen met variërende concentraties van nanodeeltjes (0,01-0,5 mg / ml). Zie tabel 1, als vertegenwoordiger tabel die de hoeveelheden van de nanodeeltjes beschreven (in 50 ui) toegevoegd aan de cellen na verwijdering van 50 gl medium / putje.
      1. Om eventuele storende absorptie van de nanodeeltjes in de assay, voeg een blanco, de juiste concentratie van nanodeeltjes (0-0,5 mg / ml, in overeenstemmen met de toegevoegde hoeveelheden aan de cellen) tot medium zonder cellen.
   2. Incubeer de cellen met nanodeeltjes nacht bij 37 ° C en 5% _CO2. Zuig medium uit elk putje en afspoelen met vlekken buffer bestaande uit 5% foetaal runderserum (FBS) in met fosfaat gebufferde oplossing (PBS). Voeg 100 ul van medium zonder fenol rood en incubeer bij 37 ° C en 5% _CO216-18 uur.
3. Bereid de XTT Cell Proliferation Assay werkoplossing door mengen van de kit componenten (XTT reagens en XTT Activator) volgens de specificaties van de fabrikant. Zuig het medium van de putten en voeg 100 ul RPMI (RPMI w / o fenol rood + 10% FBS + 1 × Pen-Strep) of een geschikt medium voor het celtype bestudeerd. Voeg 50 pl XTT werkoplossing aan elk putje en incubeer bij 37 ° C en 5% _CO2 gedurende 2-2.5 uur.
4. Meet de absorptie bij 490 nm, met een verwijzing golflengte van 630 nm te corrigeren voor vingerafdrukken of vlekken. Bereken de gecorrigeerde absorptie van elk putje (A -A _{490 630)} en het gemiddelde van de metingen van duplo's.
5. Trek de blanco lezingen uit elk putje waarde voor de uiteindelijke gecorrigeerde absorptiewaarden berekenen. Bereken het percentage overleving voor elk monster door het normaliseren van de uiteindelijke gecorrigeerde absorptie met die van onbehandelde cellen zonder nanodeeltjes. Perceel survival percentage als functie van nanodeeltjes concentratie.

5. MRI relaxiviteiten van de PB NP, GDPB en MnPB

MRI relaxiviteit wordt gemeten met _T1 - en _T2-gewogen sequenties door bereiden van een MRI "fantoom" met een 96-wells plaat met nanodeeltjes zoals hieronder beschreven:

1. Phantom Voorbereiding
   1. Bereid een 96-wells plaat met elk putje 100 gl nanodeeltjes (PB NP, GDPB of MnPB) met de juiste concentratie. Beginnend met een concentratie van 0,4 mM voor elk type nanodeeltje, serieel verdunnen nanodeeltjes 2 × met DI-water tot een concentratie van 2,4 x 10 ^-5 M is bereikt (dit vereist 14 verdunningen en 15 wells).
   2. Voeg 100 ul van gesmolten 1% agarose-oplossing in DI water in elk putje en meng. Laat de gel stollen bij 4 ° C gedurende 12 uur.
      LET OP: Dit levert een fantoom met seriële verdunningen vande nanodeeltjes in gestolde agarose.
   3. Plaats de fantoom in een horizontale 3 T klinische magneet onder een massief blok van 2% agar (150 ^cm3). Zet het fantoom en blokkeren van agar in het centrum van een 8-kanaals HD hersenen spoel. Meet ontspanning keer met behulp van 0,5 mm dikke coronale plakjes op het midden van de hoogte van de 96-well plaat ^11.
2. _T1 - en _T2-gewogen sequenties
   Gebruik de volgende representatieve instellingen voor het verkrijgen van sequenties in de klinische magneet.
   Opmerking: Deze waarden worden geoptimaliseerd voor de nanodeeltjes die in deze studie:
   1. Verwerven T ₁ -gewogen (T1W) MR-beelden met behulp van de volgende vloeistof verzwakte inversie recovery (FLAIR) volgorde: Echo trein (ET) = 8, Herhaling tijd (TR) = 2.300 msec, Echo tijd (TE) = 24,4 msec, Matrixgrootte = 512 x 224, Field of view (FOV) = 16 x 16 cm ^2.
   2. Verwerven _T2-gewogen (T2W) MR-beelden met behulp van de volgende snelle relaxatie snel spinecho (FRFSE) volgorde: ET = 21; TR = 3500 msec; TE = 104 msec; Matrix size = 512 x 224; FOV = 16 x 16 cm ^2.
   3. Verwerven T1W en T2W MR-beelden op 127 MHz (3 T) op de volgende omkering tijden: 50, 177, 432, 942, 1961, en 4000 msec.
3. Het meten van de MRI relaxiviteiten
   1. Na het verwerven van T1W en T2W beelden met behulp van de in paragraaf 5.2 beschreven sequenties, het meten van de intensiteit van het signaal voor elk putje met behulp van ImageJ, voortaan aangewezen als de regio van belang (ROI) door het selecteren van elke ROI met behulp van de ovale gewas knop op de werkbalk, dan selecteren Analyseren> Meet.
      OPMERKING: Er verschijnt een pop-up moet de gemiddelde intensiteit van het signaal van elke ROI weer onder de kolom "Mean".
   2. Voor elke ROI, plot de gemeten intensiteit van het signaal tegen haar specifieke inversietijd. Indien nodig, invertsuiker punten (waarden) dat een eerste "bubble" of uitschieters aan het begin van de grafiek te genereren (lager inversiemaal).
      Opmerking: Deze metingen ontstaan ​​aan lage inversie keren omdat MRI meet de grootte of absolute waarde van beelden dan de feitelijke (negatieve) waarde, die moet worden opgenomen / gecorrigeerd ^19.
   3. Bereid een exponentiële fit voor elk perceel van de intensiteit van het signaal voor de ROI (SI) vs. inversie keer (T _I), zoals beschreven in paragraaf 5.2. Plot T _I op de x-as, SI op de y-as; ɑ en Δ constanten bepaald door regressie en _T1 of _T2 de variabele op te lossen:
      
      waarin t = _{T1, T2.}
   4. Isoleer _T1 of _T2 met de bovenstaande vergelijking en plot de inverse van de berekende waarden (1 / T ₁ en 1 / _T2) tegen de concentratie van de nanodeeltjes in elk ROI.
   5. Bereken de helling van de lineaire grafiek dielevert de relaxiviteiten r ₁ en r _2.
      OPMERKING: De volgende sectie van het protocol beschrijft de toepassing van de nanodeeltjes voor tl-etikettering en het genereren van MRI contrast in gerichte cellen.

6. Fluorescerende Labeling van Gerichte cellen met behulp van de Nanodeeltjes - confocale microscopie

OPMERKING: De nanodeeltjes (PB NP, GDPB en MnPB) kan worden gebruikt om fluorescent label een populatie van doelcellen (gevolgd door confocale microscopie) als volgt:

1. Synthese van de TL-Nanodeeltjes
   1. Synthetiseren GDPB-A488, GDPB-A488-Eot3, MnPB-A488, MnPB-A488-ANG2 voor tl-etikettering van een populatie van gerichte cellen door de stappen beschreven in de punten 1 en 2.
2. Bereiding van Cellen voor fluorescentie Targeting
   1. Jas niet. 1.5 micro dekglaasjes door ze onder te dompelen in een oplossing van 0,002% poly (L-lysine) hydrobromide gedurende 90 min. Verwijder het deksel glazen uit de oplossing en laat ze drogen gedurende 24 uur.
   2. Zaden van de cellen (bijv EoL-1, BSG D10, SUDIPG1) op de beklede dekglaasjes geplaatst in een 6-well plaat en incubeer bij 37 ° C en 5% _CO2 gedurende ten minste 16 uur. Spoel de cellen met een 1 × PBS-oplossing en (optioneel) te repareren met 10% formaldehyde in neutrale bufferoplossing gedurende 15 min. Stain cellen met 5 uM rood-oranje cel permeant kleurstof in PBS bij 37 ° C gedurende 30 min. Vervolgens spoel cellen met PBS.
3. > Fluorescerende Labeling van Gerichte Cellen
   1. Voeg 1% bovine serum albumine (BSA, in DI water) om de cellen om niet-specifieke binding te minimaliseren op de cellen en incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur.
   2. Incubeer cellen met de nanodeeltjes in 1% BSA gedurende 1 uur. Voor EoL-1: incubeer met 0,2 mg / ml GDPB-A488 of GDPB-A488-Eot3; Voor BSG D10 en SUDIPG1: incubeer met 0,2 mg / ml MnPB-A488 of MnPB-A488-ANG2. Spoel de cellen met PBS 3 × tot unbou verwijderennd nanodeeltjes.
   3. Omkeren zorgvuldig de dekking van glas (met cellen en nanodeeltjes) op een microscoop dia, ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen. Verzegelen de rand tussen het deksel glas en microscoopplaatje door het zorgvuldig aanbrengen van duidelijke nagellak. Afbeelding de cellen met een confocale laser scanning microscoop.

7. Fluorescerende Labeling van Gerichte cellen met behulp van de Nanodeeltjes - flowcytometrie

De nanodeeltjes (PB NP, GDPB en MnPB) kan worden gebruikt om fluorescent label een populatie van doelcellen (gecontroleerd door flowcytometrie) als volgt:

1. Suspensies bereid van de cellen het doelwit in PBS. Voor zuivere cultuur studies, de schorsingen bestaan ​​uit een enkele cel type (bijv BSG D10); resuspendeer een celpellet van BSG D10 cellen in PBS bij 100.000 cellen / ml (10 ml totaal). Voor mengcultuur studies, de suspensies uit ten minste twee celtypen (bijv EoL-1 en OE21); Soortgelijke BSG D10, resuspendeer celpellets van EoL-1 en OE21 in PBS bij 100.000 cellen / ml elk (totaal 10 ml).
   1. Bereid variërende verhoudingen van EoL-1: OE21 1: 0 (2 ml EoL-1), 3: 1 (1,5 ml EoL-1, 0,5 ml OE21), 1: 1 (1 ml elk van EoL-1 en OE21), 1: 3 (0,5 ml EoL-1, 1,5 ml OE21), 0: 1 (2 ml OE21).
2. Blokkeer de cellen (zuivere en gemengde suspensies) het doelwit van de nanodeeltjes met 2 ml 5% BSA om niet-specifieke binding te minimaliseren.
3. Voeg 1 ml (1 mg / ml) nanodeeltjes aan de cellen en incubeer gedurende 1 uur. Voor BSG D10, incubeer cellen met MnPB-A488, MnPB-A488-ABC (controle antilichaam), of MnPB-A488-ANG2). Voor mengsels van EoL-1 en OE21, incubeer de mengsels met een vast bedrag van GDPB-A488-Eot3.
4. Spoel de cellen vrij van ongebonden nanodeeltjes door te stoppen met draaien de monsters bij 1000 x g gedurende 5 min minstens 3 × om ongebonden deeltjes te verwijderen. Resuspendeer de cellen in 1 ml PBS en bevestig met 10% formaldehyde in PBS. Stain cellen door incubatie met 10 ug / ml7-Aminoactinomytcin D in PBS op ijs gedurende 30 min. Spoelen met PBS, vervolgens analyseren 10.000 gated cellen van elk monster met behulp van een flowcytometer.

8. Het genereren van MRI contrast op Gerichte cellen met behulp van de Nanodeeltjes

: Als volgt in een populatie van doelcellen - De nanodeeltjes (PB NP, GDPB en MnPB) kan worden gebruikt om MRI contrast (en _T2-gewogen sequenties in zowel _T1) genereren

1. Phantom Voorbereiding
   1. Kweek cellen (bijv BSG D10) in T75 kolven tot -80% confluentie. Gebruik geschikte groeimedium en voorwaarden. Voor BSG D10, groeien de cellen in DMEM + 10% FBS + 1 × Pen-Strep bij 37 ° C en 5% _CO2.
   2. Spoel cellen vrij medium met 5 ml PBS en blokkeren de cellen met 5 ml 1% BSA in PBS gedurende 1 uur om niet-specifieke binding te minimaliseren. Voeg 5 ml (0,5 mg / ml) nanodeeltjes aan de cellen. Voor BSG D10, incubeer de cellen met MnPB-A488, MnPB-A488-ABC (controle antilichaam), en MNPB-A488-ANG2 1 uur.
   3. Spoel cellen 3 x met 5 ml PBS om ongebonden nanodeeltjes te verwijderen. Trypsinize de cellen door de cellen te incuberen met 2 ml trypsine EDTA 0,25% oplossing 1 x gedurende 5 min bij 37 ° C en 5% _CO2 om ze los te maken van de kolf voor fantoom bereiding. Voeg 8 ml DMEM de trypsine cellen doven.
   4. Verzamel de cellen door te centrifugeren bij 1000 x g gedurende 5 min; Zuig het supernatant. Resuspendeer de cellen in 1 ml PBS en voeg 1 ml 10% formaldehyde in PBS aan de cellen vast. Voeg 100 ul van elk monster op een afzonderlijk putje van een 96-wells plaat.
   5. Voeg 100 ul van gesmolten 1% agarose-oplossing in DI water in elk putje en meng goed door en neer te pipetteren. Laat de gel stollen bij 4 ° C gedurende 12 uur.
      LET OP: Dit levert een fantoom bevattende cellen met aangehechte nanodeeltjes in gestolde agarose.
   6. Plaats de fantoom in een horizontale 3 T klinische magneet naast een massief blok van 2% agar (150 cm ^{3). Zet het fantoom en blokkeren van agar in het centrum van een 8-kanaals HD hersenen spoel. Meet ontspanning keer met behulp van 0,5 mm dik coronale plakjes op halve hoogte van de 96-well plaat 11.}
2. _T1 - en _T2-gewogen sequenties
   Gebruik de volgende instellingen voor het verwerven van de sequenties in de klinische MRI-magneet:
   1. Verwerven T1W MR-beelden met behulp van de volgende spin-echo sequentie: Echo trein (ET) = 1, Herhaling tijd (TR) = 650 msec, Echo tijd (TE) = 11 msec, Matrix size = 320 x 256, Field of view (FOV) = 10 x 10 ^cm2.
   2. Verwerven T2W MR-beelden met behulp van de volgende FRFSE volgorde: ET = 28; TR = 3000 msec; TE = 101 msec; Matrix size = 384 x 288; FOV = 10 x 10 cm ^2.
3. Na overname Processing
   1. Voor de overzichtelijkheid, zetten de oorspronkelijke grijstinten kleuren schaal beeld met behulp van ImageJ naar: Kies Afbeelding> type> 8-Bit, om de afbeelding te converteren naar grijstinten.
   2. Bereken de genormaliseerde intensiteit voor elk monster na aftrek van de bijdrage signaal van de agaroseoplossing.

Resultaten

Met behulp van de éénpotssynthese regeling, nanodeeltjes van PB NP (gemiddelde diameter van 78,8 nm, polydispersiteitsindex (PDI) = 0,230; berekend door het dynamische lichtverstrooiing instrument), GDPB (gemiddelde diameter van 164,2 nm, PDI = 0,102), of MnPB ( gemiddelde diameter 122.4 nm, PDI = 0,124) dat monodisperse (zoals gemeten door DLS zijn) kan consistent worden gesynthetiseerd (Figuur 2A). De gemeten zeta potentialen van de gesynthetiseerde nanodeeltjes minder dan -30 mV (Figuur 2B)

Discussie

Dit artikel geeft de werkwijzen voor de synthese van een nieuwe klasse van multimodale moleculaire beeldvormende stoffen gebaseerd op biofunctionalized Pruisisch blauw nanodeeltjes. De moleculaire beeldvormende modaliteiten opgenomen in de nanodeeltjes fluorescentie beeldvorming en moleculaire MRI vanwege hun complementariteit. De biofunctionalized Pruisisch blauw nanodeeltjes een kern-schil design. De belangrijkste stappen in de synthese van deze nanodeeltjes zijn: 1) éénpotssynthese waarin de kernen die bestaan ​​uit ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate (K4Fe(CN)6·3H2O)	Sigma-Aldrich	P9387
Manganese (II) chloride tetrahydrate (MnCl2·4H2O)	Sigma-Aldrich	221279
Gadolinium (III) nitrate hexahydrate (Gd(NO3)3·6H2O)	Sigma-Aldrich	211591
Iron (III) chloride hexahydrate (FeCl3·6H2O)	Sigma-Aldrich	236489
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888
Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan, Biotin Conjugate Antibody	Millipore	AB5320
Biotinylated Anti-Human Eotaxin-3	Peprotech	500-P156GBT
Neuro-2a Cell Line	ATCC	CCL-131
BSG D10 Cell Line	Lab stock	---
OE21 Cell Line	Sigma-Aldrich	96062201
SUDIPG1 Neurospheres	Lab stock	---
Eol-1 Cell Line	Sigma-Aldrich	94042252
Poly(L-lysine) hydrobromide	Sigma-Aldrich	P1399
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A2153
Aminoactinomycin D	Sigma-Aldrich	A9400
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
CellTrace Calcein Red-Orange, AM	Life Technologies	C34851
Avidin-Alexa Fluor 488	Life Technologies	A21370
Centrifuge	Eppendorf	5424
Peristaltic Pump	Instech	P270
Zetasizer Nano ZS	Malvern	ZEN3600
Sonicator	QSonica	Q125
Hot Plate/Magnetic Stirrer	VWR	97042-642
Ultra Clean Aluminum Foil	VWR	89107-732
Vortex Mixer	VWR	58816-121
1.7 ml conical microcentrifuge tubes	VWR	87003-295
15 ml conical centrifuge tubes	VWR	21008-918
Tube holders	VWR	82024-342
Disposable plastic cuvettes	VWR	7000-590 (/586)
Zetasizer capillary cell	VWR	DTS1070
Centrifugal Filters, 0.2 micrometer spin column	VWR	82031-356
96-well cell culture tray	VWR	29442-056
Trypsin EDTA 0.25% solution 1x	JR Scientific	82702
Cell Culture Grade PBS (1x)	Life Technologies	10010023
XTT Cell Proliferation Assay Kit	Trevigen	4891-025-K
T75 Flask	89092-700	VWR
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Biowhitaker	12-604Q
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	10437-010
Pen-Strep 1x	Life Technologies	15070063
Fluoview FV1200 Confocal Laser Scanning Microscope	Olympus	FV1200
Chambered Microscope Slides	Thermo Scientific	154534
Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5	VWR	48366-227
Microscope Slides	VWR	16004-368
RPMI	Sigma-Aldrich	R8758
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
FACSCalibur Flow Cytometer	BD Biosciences
3 T Clinical MRI Magnet	GE Healthcare
100 ml round-bottom flask