Methodenartikel

LepR

9.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52632

⸱

11 mei 2015

 ,  , 
1School of Biomedical Sciences, The University of Queensland

In dit artikel

Samenvatting

We presenteren hier een protocol voor de isolatie van eilandjes uit het muismodel van type 2 diabetes, Leprdb en details van een live-cel assay voor het meten van insulinesecretie uit intacte eilandjes dat gebruikmaakt van 2 foton microscopie.

Samenvatting

Type 2 diabetes is een chronische ziekte die 382 miljoen mensen in 2013, en zal naar verwachting 592 miljoen stijgen met 2035 1. In de afgelopen 2 decennia, de rol van de beta-cel disfunctie bij type 2 diabetes is duidelijk vastgesteld 2. Onderzoek vooruitgang vereist voor de isolering van pancreaseilandjes. Het protocol van het eilandje isolatie gepresenteerde heeft veel gemeen stappen protocollen van andere groepen, met enkele wijzigingen om de opbrengst en kwaliteit van geïsoleerde eilandjes van zowel het wildtype en diabetische db LepR (db / db) muizen. Een levende cel 2-photon beeldvormingsmethode Vervolgens krijgt die gebruikt kan worden om de besturing van insulineafscheiding in eilandjes onderzoeken.

Inleiding

De rol van de beta-cel disfunctie bij de ziekte is algemeen erkend 3,4. Cellijnen zoals MIN6 en INS-1 zijn nuttige hulpmiddelen om de biologie van beta cel gedrag te begrijpen. De fysiologische sturing van insulinesecretie vindt plaats in de eilandjes van Langerhans. Deze eilandjes bevatten duizenden dicht opeengepakte beta-cellen, alsmede bloedvaten en andere endocrine celsoorten. Deze omgeving binnen het eilandje invloed insulinesecretie en kan waarschijnlijk bij diabetes zijn. Daarom, om de fysiologische controle van insulinesecretie en de pathofysiologie van de ziekte te begrijpen, is het essentieel intacte eilandjes bestuderen.

Isolatie Islet

Levende menselijke eilandjes en in het bijzonder menselijke eilandjes aan type 2 diabetes patiënten moeilijk te verkrijgen. Bovendien humane eilandjes hebben beperkte mogelijkheden voor experimentele moleculaire manipulatie. Onderzoekers hebben daarom in dienst istermijn van dieren en dierlijke modellen van type 2 diabetes. Een dergelijke ziekte model is de db / db muis. Dit is een mutatie die spontane modellen Type 2 diabetes met een fenotype progressie die parallel loopt met menselijke ziekten 5,6. De hier gepresenteerde voor eilandje isolatie van diabetische db / db-muizen protocol vele trappen evenals andere groepen met een aantal verfijningen voor betere opbrengst, reiniging en verbeterde eilandje overleving.

2 foton imaging

De live-cell 2-foton assay hier beschreven stelt onderzoekers in staat om het aantal te kwantificeren en evalueren van de kenmerken van de single-insuline met korrels van veel cellen van diabetische 7 en wild type eilandjes 8,9.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

LET OP: Alle huidige experimenten werden uitgevoerd volgens de lokale dierethiek procedures van de Universiteit van Queensland (door de Universiteit van Queensland, Anatomical Biosciences ethische commissie goedgekeurd).

1. Islet Isolatie

  1. Reagens voorbereiding
    1. Mengsel van enzymen
      1. Voor de pancreas spijsvertering, gebruik maken van een mengsel van Liberase en collagenase type IV. Verdunnen Liberase TL (thermolysine laag) 1 flacon van 5 mg met 26 ml DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium).
      2. Bereid collagenase type IV in Hank's buffer bij een concentratie van 0,5 mg / ml, aangevuld met 5 mM HEPES, 0,5 mM CaCl2, 0,1 mg / ml DNase en 1 mg / ml runderserumalbumine.
      3. Meng de Liberase TL en collagenase oplossingen in een verhouding van 4: 1 (volumeverhouding), dwz 4 ml Liberase TL + 1 ml collagenase. Aliquot het mengsel van enzymen aan elke 2,5 ml en bewaar bij -20 ° C.
        LET OP: Het weefsel incubatietijden vari een beetje tussen batches van enzym (30 sec tot 1 min verschil). Daarom kan een ladingsgewijze test vereist.
    2. Isolation RPMI Media
      1. Los één flacon van RPMI 1640 poeder in 1 liter water bij RT en aan te vullen met 2 g NaHCO 3, 4,02 g HEPES.
      2. Combineer de RPMI isolatiemedia in een grote erlenmeyer mengen met een magnetische roerder op pH 7,4 met NaOH, filter steriliseren en bewaren bij 4 ° C.
    3. RPMI Cultuur Media
    4. Met RPMI kweekmedium met 10% foetaal runderserum en 1% antibiotica (bijvoorbeeld, penicilline 100 U / ml, streptomycine 100 ug / ml).
  2. Islet Isolatie en kweken
    1. Animal Sacrifice
      1. Offer muizen door cervicale dislocatie of CO 2 stikken volgens ethische procedures van de lokale instelling. Spray de muis lichaam grondig met 70% ethanol.
    2. Pancreas perfusie
      1. Use 2 langssneden zijdelings door de buikhuid en peritoneum van een V-vormige flap maken. Trek de flap van de huid tot het gehele buikholte ontdekken, opzij zetten de darm en houden de lever in plaats van een gevouwen tissue papier om de galbuis afgeleid (figuren 1 en 2). Zet het dier zodat de kop naar de chirurg en de staart weg van de chirurg.
      2. Breng een vasculaire klem op de ampulla van de twaalfvingerige darm muur om de geïnjecteerde enzymen blokkeren die in de twaalfvingerige darm (Figuur 1).
        NB: Dit is een belangrijke stap omdat het bepaalt of de geïnjecteerde enzymen in de pancreas duct zal gaan en perfuseren de alvleesklier of reflux aan de injectieplaats (meer dan klem) of ga in de twaalfvingerige darm (onder klem).
      3. Canule de galbuis met een 31 G naald vlakbij de kruising van de ductus hepaticus en cystic duct (figuur 1) en laat ruimte voor een tweede injectie of the alvleesklier niet in slaagt om de eerste keer perfuseren. Langzaam (meer dan ~ 10 sec) injecteer ongeveer 2 ml koude enzymmengsel in de muis galbuis.
        OPMERKING: De pancreas wordt snel geperfundeerd wanneer de klem zich in de juiste positie.
      4. Pas de klem positie als de naald is in de galweg, maar kan de alvleesklier niet perfuseren (dwz., Overgaan tot de klem een beetje weg van de lever, indien meer dan geklemd of verplaats het een beetje aan de lever als onder geklemd).
        OPMERKING: De naald gaat soms in het omgevende capsule niet de lumen van de buis. Een nuttige teken om te controleren of de naald zich in de ductus choledochus wordt de uitzetting van de leiding bij het injecteren. Indien de alvleesklier geen perfuseren, alternatief is het enzymmengsel kan worden geïnjecteerd om meerdere sites van de pancreas met lagere opbrengst verwacht. De perfusie van de linkerkant van de pancreas (de milt kwab) van belang voor maximalisatie van het eilandje opbrengst.
      5. Nadat de pancreas perfused, snel te verwijderen van de alvleesklier, zet het in een flesje (~ 20 ml, glas) en incubeer gedurende ~ 19 minuten in een 37 ° C waterbad.
        OPMERKING: De incubatietijd kan iets variëren afhankelijk van de muizenstam en leeftijd.
      6. Na de incubatietijd, stopt het verteringsproces door toevoeging ~ 20 ml koud isolatiemedia. Schud het flesje voorzichtig aan de alvleesklier verstoren en giet het door een normaal theezeef (poriediameter van 1 mm) in een steriele 50 ml buis. Vul de buis met isolatiemedia en centrifugeer bij 400 xg gedurende 1 min bij 4 ° C met de rem uitgeschakeld.
      7. Los het pellet in de isolatiemedia telkens over naar twee 15 ml buisjes, centrifugeer bij 400 xg gedurende 1 min bij 4 ° C met de rem uitgeschakeld. Afzuiging het supernatant, meng de twee pellets goed met 6 ml dichtheidsgradiënt cellen scheidingsmedium (Histopaque 1077 oplossing) per buisje vortexen of en neer te pipetteren. Voeg voorzichtig ~ 6 ml van de isolatiemedia aan de zijkant van de buis bovenopde dichtheidsgradiënt scheidingsmedium en centrifugeer bij 100 xg gedurende 15 min bij 4 ° C met de rem uitgeschakeld.
      8. Verzamel de bovenstaande vloeistof in de bovenste (isolatie media), middelste en onderste (dichtheid gradiënt celscheiding media) laag in 3 afzonderlijke gerechten. Handpick de eilandjes in deze 3 gerechten met een pipet onder een stereomicroscoop.
        OPMERKING: De middelste laag bevat de meeste van de eilandjes. Eilandjes worden als compacte structuren van -50 tot 500 urn in grootte (figuur 3). We krijgen ~ 200 eilandjes in WT-muizen en 300- <100 eilandjes in db / db-muizen.
    3. Islet kweken
      1. Om de eilandjes herstellen van de enzymdigestie cultuur groepen 40 eilandjes in een 25 cm petrischaal met 6 ml RPMI kweekmedium (10 mM glucose) bij 37 ° C, 5% / 95% CO 2 / O 2 gedurende 2 dagen vóór levende 2-cel-foton beeldvorming. Verander dagelijks het kweekmedium.

2. Live Cell 2-Photon Imaging

  1. Reagens Voorbereiding
    1. Extracellulaire Buffer
      1. Bereid de natrium- rijke extracellulaire buffer voor 2-foton assay met 140 mM NaCl, 5 mM KCI, 2,5 mM CaCl2, 1 mM MgCl 2, 5 mM NaHCO 3 en 10 mM HEPES.
    2. Extracellulaire Dye
      1. Voor de 2-photon assay bereiden stock SRB 8 mM in extracellulaire buffer, aliquot in kleine buisjes en bewaar bij -20 ° C. Verdun de voorraad SRB 01:10 in verse extracellulaire buffer om een ​​werkende concentratie van 0,8 mm te krijgen.
  2. foton Imaging
    1. Ten eerste, pre-incubeer 2 dagen gekweekt eilandjes in 3 mM glucose extracellulaire buffer gedurende 30 min.
      NOTA BENE: Wij gebruiken eilandjes tussen de 2 en 5 dagen in de cultuur.
    2. Plaats dan een glasplaatje op de thermo-regelkamer geplaatst op de microscoop podium. Gebruik vet aan het lekken van de oplossing te voorkomen.
    3. Bedek de kamer met 500 ul van extracellular buffer die 0,8 mM SRB met verschillende glucoseconcentraties (3 mM, 6 mM, 15 mM en 20 mM glucose).
    4. Plaats vervolgens de gepre-incubeerd eilandje in het midden van de kamer en zich op 3-4 cellagen in het eilandje waar in knaagdieren eilandjes, immunokleuring insulinebehoefte blijkt dat de meeste cellen beta-cellen.
      LET OP: De SRB zal al het celmembraan van het eilandje snel schetsen en het eilandje is klaar om de afbeelding.
    5. Gebruik een 2-foton microscoop met een 60X olie-immersie objectief (NA 1,42) en imaging software (bijv., Scanimage 11). Figuur 4 illustreert een typisch microscopie regeling. Afbeelding exocytische gebeurtenissen met SRB als een membraan impermeant fluorescerende extracellulaire marker opgewonden door femtoseconde laserpulsen op 880 nm, met fluorescentie gedetecteerd bij 550-650 nm. Noteer het eilandje respons op stimulatie.
    6. Identificeren enkele exocytose gebeurtenissen door de plotselinge verschijning van een kleine fluorescerende spot (resolutie 10 pixels /1; m) en bevestig door de snel stijgende fase van het fluorescerende signaal over een regio van belang (~ 0,78 micrometer 2).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Islet opbrengst en zuivering

Voor een normale wild type muis, worden ongeveer 200 eilandjes verwacht. Gezonde eilandjes kijken helder, ronde en hebben een gladde rand. Een over-gedigereerde isolatie batch is vaak klein en fuzzy eilandjes terwijl een onder gedigereerd batch heeft minder eilandjes en acinaire cellen gevoegd eilandjes (Figuur 3). Bij diabetische db / db muizen, het eilandje opbrengst en uiterlijk afhankelijk van de progressie van de ziekte beter glykemische mui...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De belangrijkste factor bij het eilandje isolement de initiële perfusie van de pancreas; Een onder pancreas perfusie resulteert in een aanzienlijk lagere opbrengst eilandje. Andere factoren beïnvloeden ook de isolatie kwaliteit zoals destructietijd en de mate van schudden die gedeeltelijk kan compenseren voor het niveau van perfusie. Bijvoorbeeld, een volledig pancreas perfusie moeten worden geïncubeerd bij 37 ° C gedurende ~ 18 min 30 sec onder zacht schudden daarentegen een onder gedigereerd pancreas ~ 20 minuten dige...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door een Australian Research Council Grant DP110100642 (aan PT) en National Health and Medical Research Council Grants APP1002520 en APP1059426 (aan PT en HYG).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Liberase TL 5 mgRoche-5401020001
Collagenase type IV-1gGibco-Life Technologies17104-019
Histopaque 1077 500 mlSigma Aldrich10771
RPMI 1640 Medium (10x) 1LSigma AldrichR1383om isolatiemedia voor te bereiden
RPMI 1640 (1x) 500 mlGibco-Life Technologies21870-076om kweekmedia voor te bereiden
Penicillin-Streptomycin 100 mlGibco-Life Technologies15140-122om kweekmedia voor te bereiden 
Fetal bovine serum 500 mlGibco-Life Technologies10099-141om kweekmedia voor te bereiden
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)Gibco-Life Technologies11966-025om de liberase te verdunnen
Metamorph programmaMolecular Devices, USAom de 2-fotonbeelden te analyseren

Referenties

  1. Guariguata, L., et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes Research and Clinical Practice. 103, 137-149 (2014).
  2. Ashcroft, F. M., Rorsman, P. Diabetes mellitus and the beta cell: The last ten years. Cell. 148, 1160-1171 (2012).
  3. Weir, G. C., Bonner-Weir, S. Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes. Diabetes. 53, S16-S21 (2004).
  4. Kjorholt, C., Akerfeldt, M. C., Biden, T. J., Laybutt, D. R. Chronic hyperglycemia, independent of plasma lipid levels, is sufficient for the loss of beta-cell differentiation and secretory function in the db/db mouse model of diabetes. Diabetes. 54, 2755-2763 (2005).
  5. Wang, Y. W., et al. Spontaneous type 2 diabetic rodent models. Journal of Diabetes Research. , (2013).
  6. Hummel, K. P., Dickie, M. M., Coleman, D. L. Diabetes a new mutation in mouse. Science. 153, 1127-1128 (1966).
  7. Do, O. H., Low, J. T., Gaisano, H. Y., Thorn, P. The secretory deficit in islets from db/db mice is mainly due to a loss of responding beta cells. Diabetologia. 57, 1400-1409 (2014).
  8. Low, J. T., et al. Glucose principally regulates insulin secretion in mouse islets by controlling the numbers of granule fusion events per cell. Diabetologia. 56, 2629-2637 (2013).
  9. Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet. Science. 297, 1349-1352 (2002).
  10. Low, J. T., et al. Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature. Diabetologia. 57, 1655-1663 (2014).
  11. Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomedical Engineering Online. 2, 13(2003).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Lepr db muismodelbereiding van enzymmengseldichtheidsgradi ntcentrifugatietweefotonmicroscopieinsulinesecretie assaySRB kleurstoflabelingglucose stimulatierespons

Gerelateerde artikelen