Protocollen voor het verkrijgen Zygotic en somatische embryo's voor het bestuderen van de verordening van de vroege embryo ontwikkeling in de Model Legume Medicago truncatula

Summary

The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided.

Abstract

Vroege embryogenese uitgaande van een enkele cel zygote doorloopt snelle celdeling en morfogenese, en wordt morfologisch gekenmerkt door pre-bolvormige, bolvormig, hart, torpedo en cotyledon fasen. Deze geleidelijke ontwikkeling is onder de strakke regulering van een complexe moleculaire netwerk. Oogsten voldoende vroege embryo's in een soortgelijk stadium van de ontwikkeling is van essentieel belang voor het onderzoek naar de cellulaire en moleculaire regulatie van de vroege embryogenese. Dit is niet eenvoudig omdat de vroege embryogenese ondergaat snelle morfogenese in korte tijd bijvoorbeeld 8 dagen voor Medicago truncatula aan het begin van de zaadlob stadium te bereiken. Hier pakken we het probleem op door twee benaderingen. De eerste wordt een koppeling tussen embryonale ontwikkeling en pod morfologie helpen geven de fase van de zygotische embryo. Dit is met name gebaseerd op het aantal pod spiralen en de ontwikkeling van de stekels. Een alternatieve manier om een aanvulling op de in vivo studies is via kweken bladexplantaten somatische embryo's. Het medium omvat een ongewone combinatie hormoon - Een auxine (1-naftaleenazijnzuur), een cytokinine (6-benzylaminopurine), abscisinezuur en gibberellinezuur. De verschillende stadia te onderscheiden groeien uit de eelt zonder dissectie.

Introduction

Peulvruchten zijn de derde grootste familie van hogere planten met ongeveer 20.000 soorten en de vlinderbloemigen (of Fabaceae) familie zijn tweede granen in geoogste oppervlakte en de totale productie ^1. Soja is de derde grootste gecultiveerde gewas. Peulvruchten geven ongeveer een derde van eiwitten en een derde van plantaardige spijsolie ^2. Peulvruchten met hun N ₂ vaststellen capaciteit ook bijdragen aan duurzame landbouwsystemen. Medicago truncatula, zoals soja, winkels eiwit en olie in de zaadlobben van de zaden en het is een genetische en genomische peulvruchten model met een aanzienlijke genetische en genomische hulpb....

Protocol

1. Zygotic Embryo Development

1. Plant Materiaal
   1. Grow de Medicago truncatula wild type Jemalong of haar buurt isogene, zeer re-generable genotype Jemalong 2HA ¹³ (bekend als 2HA) in een kas met een 14 uur fotoperiode en 23 ° C / 19 ° C dag / nacht temperatuur.
      1. Pierce het oppervlak van de zaadhuid (met een 23 G naald) vóór het zaaien zodat water mag het zaad voeren en weken in water gedurende de nacht. Voeg genoeg water om volledig te dekken het zaad.
      2. Zaai 3 zaden in elke 15 cm pot diameter (in totaal 10 potten) in potgrond (grof zand, perliet, kokos-turf (1: 1: 1) plus 5 g van Osmocote Exact Standaard: slow rele....

Results

Voor zygotische embryogenese verschillende pod structuren die overeenkomen met de verschillende embryonale stadia worden getoond in Figuur 1A - F terwijl de verschillende embryonale stadia worden getoond in Figuur 2A - F. Door het selecteren pods in hetzelfde stadium monsters eicellen die vrij uniform kan worden verkregen (figuur 3A). Door het gebruik van RT-qPCR embryo specifieke genen gemakkelijk kan worden gedetecteerd en tijdsverloo.......

Discussion

De beschreven protocollen zijn relatief ongecompliceerd en laat onderzoek van peulvruchten embryogenese met alle hedendaagse cel en moleculaire technieken. We erkennen dat er voordelen en nadelen van zowel in vivo en in vitro methoden. Beide kunnen meer nadruk op de vroege embryogenese in vergelijking met de cultuur van onrijpe zaden ^19.

Voor in vivo studies wat beschreven is hoofdzakelijk het isoleren van de eicel van de huls die geschikt is voor veel e.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
P4 medium	Sigma-Aldrich		Use Sigma-Aldrich Chemicals or other analytical grade supplier
Major salts
Minor salts
Vitamins
Agar	Bacto Laboratories	214010	Bacto agar
Plant hormones
1-Naphthaleneacetic acid	Sigma-Aldrich	N0640	Dissolve in small amount of 1 M NaOH
Abscisic acid	Sigma-Aldrich	A1049	Dissolve in small amount of 1 M NaOH
6-Benzylaminopurine	Sigma-Aldrich	B3274	Dissolve in MQ water with heating and few drops 1N HCl
Gibberellic Acid	Sigma-Aldrich	G7645	Dissolve in small amount of ethanol
Equipment
Stereo dissecting microscope	Leica	MZFLIII	Or similar
Light microscope	Zeiss	Axiophot	Or similar, with suitable optics
Digital camera	Zeiss	AxioCam HRc	Or similar
Sterilising leaves
250 mL screw cap polycarbonate container with polypropylene lid	SARSTEDT	75.9922.519	Autoclavable