Methodenartikel

Protocollen voor het verkrijgen Zygotic en somatische embryo's voor het bestuderen van de verordening van de vroege embryo ontwikkeling in de Model Legume Medicago truncatula

DOI:

10.3791/52635

⸱

9 juni 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Environmental and Life Sciences, University of Newcastle, Callaghan, New South Wales, Australia

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het doel is om te illustreren dat het model-legume Medicago truncatula gemakkelijk kan worden gebruikt om de regulatie van vroege plantenembryogenese te onderzoeken als aanvulling op het niet-legume Arabidopsis-model. De morfologie van peulen is gekoppeld aan stadia van zygotische embryogenese en er wordt ook een protocol gegeven om embryo's te verzamelen met behulp van weefselkweek.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vroege embryogenese uitgaande van een enkele cel zygote doorloopt snelle celdeling en morfogenese, en wordt morfologisch gekenmerkt door pre-bolvormige, bolvormig, hart, torpedo en cotyledon fasen. Deze geleidelijke ontwikkeling is onder de strakke regulering van een complexe moleculaire netwerk. Oogsten voldoende vroege embryo's in een soortgelijk stadium van de ontwikkeling is van essentieel belang voor het onderzoek naar de cellulaire en moleculaire regulatie van de vroege embryogenese. Dit is niet eenvoudig omdat de vroege embryogenese ondergaat snelle morfogenese in korte tijd bijvoorbeeld 8 dagen voor Medicago truncatula aan het begin van de zaadlob stadium te bereiken. Hier pakken we het probleem op door twee benaderingen. De eerste wordt een koppeling tussen embryonale ontwikkeling en pod morfologie helpen geven de fase van de zygotische embryo. Dit is met name gebaseerd op het aantal pod spiralen en de ontwikkeling van de stekels. Een alternatieve manier om een aanvulling op de in vivo studies is via kweken bladexplantaten somatische embryo's. Het medium omvat een ongewone combinatie hormoon - Een auxine (1-naftaleenazijnzuur), een cytokinine (6-benzylaminopurine), abscisinezuur en gibberellinezuur. De verschillende stadia te onderscheiden groeien uit de eelt zonder dissectie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Peulvruchten zijn de derde grootste familie van hogere planten met ongeveer 20.000 soorten en de vlinderbloemigen (of Fabaceae) familie zijn tweede granen in geoogste oppervlakte en de totale productie 1. Soja is de derde grootste gecultiveerde gewas. Peulvruchten geven ongeveer een derde van eiwitten en een derde van plantaardige spijsolie 2. Peulvruchten met hun N 2 vaststellen capaciteit ook bijdragen aan duurzame landbouwsystemen. Medicago truncatula, zoals soja, winkels eiwit en olie in de zaadlobben van de zaden en het is een genetische en genomische peulvruchten model met een aanzienlijke genetische en genomische hulpbronnen 3,4. Terwijl M. truncatula heeft vooruitgang mogelijk in het begrijpen van de peulvruchten-Rhizobium symbiose 4 het is in toenemende mate gebruikt om zaad van vlinderbloemigen biologie 5-7 en embryogenese 8,9 bestuderen. Arabidopsis embryogenese is uitgebreid bestudeerd 10,11 maar iksa niet-vlinderbloemige en de details van de embryogenese niet identiek zijn aan Medicago 8,10. Zygotische embryogenese in M. truncatula heeft interessante functies, met een onderscheidend meercellige hypofyse, een endoployploid suspensor en basale overdracht cel 8.

Somatische embryogenese (SE) wordt vaak gebruikt voor het regenereren van planten 12. In de peulvruchten model M. truncatula, het zaad lijn Jemalong 2HA (2HA) is ontwikkeld vanuit de ouder Jemalong om hoge tarieven van somatische embryogenese 13 hebben. Het aantal embryo's is onlangs inhoudelijk verhoogd waarbij zowel gibberellinezuur (GA) en abscisinezuur (ABA) op de lang bestaande medium 14. In dit geval GA en ABA daad synergetisch, wat ongebruikelijk is gezien het feit dat Georgië en ABA meestal antagonistisch 14 treden. De hoeveelheid uit callus embryo ontwikkeld op het oppervlak waarmee het stadium van embryogenese gemakkelijk te bepalen Visually en snel geoogst. Met buurt isogene lijnen die embryogene (2HA) en niet-embryogene (Jemalong) zijn vergemakkelijkt het onderzoek naar somatische embryogenese en met zowel in vivo als in vitro systemen biedt verschillende experimentele mogelijkheden.

Het begrijpen van de cellulaire en moleculaire mechanismen van embryonale ontwikkeling is essentieel voor het begrijpen zaden en ontwikkeling van de plant. In peulvruchten, zoals in andere dicotylen is de zaadlobben van het embryo dat de producten die worden gebruikt voor menselijke voeding slaan. Vroege embryogenese impliceert snelle celdeling, en de juiste embryo patroonvorming. Ongeveer 8 dagen na de bevruchting, de m truncatula embryo bereikt zaadlob vroeg stadium. De morfologische karakterisering is niet precies aangegeven dagen na de bevruchting in de kas omstandigheden. Aldus wordt een efficiënte standaardbenadering het stadium van ontwikkeling van embryo geven waardevol in het bestuderen van de genetische Regulatie van de vroege zygotische embryogenese.

In dit artikel geven we twee gestandaardiseerde protocollen voor de ontwikkeling van embryo's voor biologische studies van embryogenese te verzamelen in de peulvruchten model M. truncatula. De eerste is om zygotische embryo's te verzamelen door het te associëren embryogenese en pod morfologie, terwijl de tweede is somatische embryogenese via kweken bladexplantaten te gemakkelijk bereikbaar grote aantallen embryo te bieden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Zygotic Embryo Development

  1. Plant Materiaal
    1. Grow de Medicago truncatula wild type Jemalong of haar buurt isogene, zeer re-generable genotype Jemalong 2HA 13 (bekend als 2HA) in een kas met een 14 uur fotoperiode en 23 ° C / 19 ° C dag / nacht temperatuur.
      1. Pierce het oppervlak van de zaadhuid (met een 23 G naald) vóór het zaaien zodat water mag het zaad voeren en weken in water gedurende de nacht. Voeg genoeg water om volledig te dekken het zaad.
      2. Zaai 3 zaden in elke 15 cm pot diameter (in totaal 10 potten) in potgrond (grof zand, perliet, kokos-turf (1: 1: 1) plus 5 g van Osmocote Exact Standaard: slow release meststof) en transfer naar het kas. Bewaar de gezondste zaailing na het ontkiemen, dus er is 1 plant per pot en omgeven door een hekwerk voor de plant stengels te klimmen.
  2. Oogsten Pods
    1. Verzamel peulen van de wild soort Jemalong of 2HA naar de juiste vroege embryo stadia te verkrijgen zoals eerst beschreven 9.
      Opmerking: De verschillende stadia pod worden getoond in figuur 1 en de bijbehorende embryo fasen zijn weergegeven in figuur 2.
    2. Controleer de verschillende stadia bij de oogst pod volgens de criteria zoals in Tabel 1. Meet de verstreken tijd van stap 6 tot afzonderlijke fasen 6 en 7 (Tabel 2) te helpen.
  3. Ontleden eitjes van peulen en het controleren van het embryonale stadium
    1. Isoleer eitjes van peulen met behulp van fijne tang alleen of een stereo dissectiemicroscoop en een tang nodig. Indien nodig kan de embryonale stadium kan snel worden gecontroleerd met behulp van een standaard samengestelde microscoop (Figuur 3B).
    2. Bereid gewijzigd Hoyer's oplossing met 7,5 g Arabische gom, 100 g chloralhydraat, 5 ml glycerol, 60 ml gedeïoniseerd gedestilleerd water. Ontbinden door roeren gedurende 3-5 uur of 's nachts.
    3. Voor meer verfijnend microscopie duidelijk de ontleed eitjes in gewijzigde Hoyer's oplossing 15,16. Pick voorzichtig de intacte zaadknoppen en in een klein volume Hoyer-oplossing (genoeg om de eicel te dekken) bij kamertemperatuur tot helder.
    4. Bekijk de monsters met differentiële interferentie contrast (DIC) optiek. Vastleggen van de beelden iwth een digitale camera 9 (figuur 2).
    5. Verkrijgen van de meest gelijkmatige zaadknoppen uit het centrale gebied van de pod en accumuleren van het gewenste aantal. Een voorbeeld is getoond in figuur 3A. Verzamel de zaadknoppen op ijs en bewaar bij vereiste temperatuur (-80 ° C nucleïnezuren) voor verdere analyse.
      LET OP: Voor meer informatie over de analyse van histologische secties, transmissie-elektronenmicroscopie en in situ hybridisatie zie papers 8,9.

2. Somatische Embryo Development In Vitro

  1. Gebruik een M. truncatula cultivar thoed is in staat om gemakkelijk embryo's in de cultuur te vormen. Voor dit protocol voor bladexplantaten gebruiken 2HA planten 13,17 die 2-4 maanden oud zijn.
  2. Neem folders uit de laatste bijna volledig uitgebreid trifoliate blad van een stam verlengen.
  3. Houd de trifoliate bladeren op vochtig papier badstof in een cultuur pot om uitdroging te voorkomen.
    OPMERKING: Zodra de trifoliate bladeren worden geoogst die ze nodig hebben om te worden gebruikt met een minimale vertraging.
  4. Bereiding van het cultuurmedium
    1. Met de P4 10: 4: 1: 5 medium agar (0,8% w: v) in 9 cm petrischalen.
      OPMERKING: De P4 10: 4: 1: 5 medium uit de P4 basismedium 18 plus 10 uM 1-naftaleenazijnzuur (NAA), 4 uM 6-benzylaminopurine (BAP), 1 uM abscisinezuur (ABA) en 5 uM gibberellinezuur acid (GA). Het gebruik van GA + ABA versnelt embryovorming en veroorzaakt substantiële toename embryo nummer 14.
    2. Maak de de P4 basale medium in 1 L; bestaande uit grote zouten (maak Calcium up afzonderlijk), minder belangrijke zouten en vitamines (tabel 3), gecheleerd ijzer (make-up los), casaminozuren (caseïnehydrolysaat), 30 g sucrose, 8 g agar.
    3. WINKEL voorraadoplossingen van belangrijke zouten, calcium, casaminozuren, kleine zouten en vitamines bij -20 ° C in geschikte hoeveelheden. Bewaar gechelateerd ijzer bij 4 ° C.
    4. Maak de gechelateerde ijzer (200x) door het oplossen van 7,44 g Na 2 EDTA • 2 H 2 O in ongeveer 900 ml gedeïoniseerd gedestilleerd water al roerend, breng dan de oplossing voor 98-99 ° C, terwijl het toevoegen van 1,853 g FeSO 4 • 7H 2 O. Eindelijk tot 1 L wanneer de ingrediënten worden opgelost. Bewaren in amberkleurige flesjes bij 4 ° C.
    5. Vul de P4 basismedium de voorraadoplossingen zoals in tabel 4. De hormonen in het medium zijn 10 uM NAA, 4 BAP uM, 1 uM ABA, 5 uM GA (zie Tabel 4 en Tabel Specific Materials). Voeg de NAAen BAP voorafgaand aan autoclaveren toevoegen ABA en GA na autoclaveren en afkoelen tot ongeveer 55 ° C, met behulp filtersterilisatie met een 0,22 urn filter bevestigd aan een injectiespuit. Meng goed door voorzichtig zwenken.
    6. Stel de media op pH 5,8 met 1 M KOH voorafgaand aan autoclaveren. Autoclaaf bij 121 ° C gedurende 20 min.
    7. Na autoclaveren voeg de filter gesteriliseerd ABA en GA, en giet ongeveer 25 ml van de media in steriele 9 cm petrischalen in een laminaire stroming kap of biohazard kast. Cool en laat de agar ingesteld met de deksel. Dan zet op het deksel en zorg ervoor dat er geen condens op het deksel. Label wens in en bewaar bij 4 ° C (in een kartonnen doos met deksel condensaat).
  5. Sterilisatie van Leaf Tissue
    1. Werk in een UV-gesteriliseerde laminaire stroming kap of biohazard kast.
    2. Plaats verlaat in de maas bal van een eerder geautoclaveerd voorjaar thee-ei.
    3. Dompel thee-ei met de bladeren in de 70% (v: v) ethanol in een culture pot gedurende 30 sec.
      NB: Voor alle stappen in deze procedure 250 ml schroefdop polycarbonaat cultuur potten die worden geautoclaveerd.
    4. Uitlekken en vervolgens over te dragen en dompel het blad weefsel in 1: 8 (v: v) verdund bleekwater (0,5% chloor) gedurende 10 min. Roer voorzichtig van tijd tot tijd.
    5. Giet het bleekmiddel en breng de thee-ei in een cultuur pot met steriel gedemineraliseerd gedestilleerd water. Zwenk en afvoer overtollig water. Herhaal dit nog een keer met een verse cultuur pot van steriel gedemineraliseerd gedestilleerd water.
    6. Verwijder de bladeren van de thee-ei met een steriel pincet om een ​​nieuwe cultuur pot van steriel gedemineraliseerd gedestilleerd water. Schroef de steriele dop en spoel door het omkeren en wervelende. Laat bladeren drijvend op het steriel water totdat klaar om explantaten bereiden.
  6. Voorbereiden en Plating Explantaten
    1. Met behulp van steriele technieken, trim individuele gesteriliseerde folders van de rand met een scalpel, en snijd de resterende rechthoek in twee of THRee rechthoekige explantaten (8-10 x 3-5 mm) bij het ​​midden van de ader in het midden van elk explantaat (figuur 5A).
      LET OP: De grootte van de explant is heel belangrijk in de inleiding van de eerste callusing. Voer de snijden op steriele deksels van take-away voedsel containers.
    2. Plaat 6 explantaten on-agar gestold kweekmedium in 9 cm diameter petrischalen (Figuur 5B). Plate de explantaten abaxiale beneden de gebruikelijke blad oriëntatie te behouden.
    3. Sluit de Petri gerechten met Parafilm (figuur 5C) gespannen rond het gerecht. Het weefsel is nu klaar voor incubatie.
  7. Tissue Incubation
    1. Incubeer de platen in het donker bij 28 ° C in een gecontroleerde temperatuur ruimte of groeikast gedurende de kweekperiode.
      OPMERKING: De explantaten zal dedifferentiation initiëren, ondergaan celdeling, proliferatie (eeltvorming) en embryogenese (differentiatie).
    2. Subcultuur de differentiërende TOELICHTInts na 3 weken op vers medium. Op dit subcultuur breng de gehele explantaat met een steriele roestvrijstalen spatel en pincet, in een laminaire stroming kap of biologisch kast. Als callusing optreedt en het callus de grootte van de grootste in figuur 5C overschrijdt overdracht 50% van de afzonderlijke callus bij doorkweken op vers medium.
    3. Let op de eerste embryo's in ongeveer 4 weken. Hoewel er een zekere mate van synchroon, het verzamelen van verschillende embryo stadia over een 4-8 week incubatieperiode (Figuur 6A, B). Verzamel onder een dissectie microscoop Werkwijze volgens experimentele doeleinden.
    4. Subcultuur elke 3 weken en verwijder embryo periodiek zodat de explantaten blijven embryo's gedurende 3 maanden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voor zygotische embryogenese verschillende pod structuren die overeenkomen met de verschillende embryonale stadia worden getoond in Figuur 1A - F terwijl de verschillende embryonale stadia worden getoond in Figuur 2A - F. Door het selecteren pods in hetzelfde stadium monsters eicellen die vrij uniform kan worden verkregen (figuur 3A). Door het gebruik van RT-qPCR embryo specifieke genen gemakkelijk kan worden gedetecteerd en tijdsverloo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De beschreven protocollen zijn relatief ongecompliceerd en laat onderzoek van peulvruchten embryogenese met alle hedendaagse cel en moleculaire technieken. We erkennen dat er voordelen en nadelen van zowel in vivo en in vitro methoden. Beide kunnen meer nadruk op de vroege embryogenese in vergelijking met de cultuur van onrijpe zaden 19.

Voor in vivo studies wat beschreven is hoofdzakelijk het isoleren van de eicel van de huls die geschikt is voor veel e...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd ondersteund door de Australian Research Council-subsidie CEO348212 en de Universiteit van Newcastle. De assistentie van Dr. Sam Zhang wordt op prijs gesteld.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
P4 mediumSigma-AldrichGebruik Sigma-Aldrich Chemicals of andere leverancier van analytische kwaliteit
Major salts
Minor salts
Vitamins
AgarBacto Laboratories214010Bacto agar
Plant hormones
1-Naphthaleneacetic acidSigma-AldrichN0640Los op in een kleine hoeveelheid 1 M NaOH
Abscisic acidSigma-AldrichA1049Los op in een kleine hoeveelheid 1 M NaOH
6-BenzylaminopurineSigma-AldrichB3274Los op in MQ-water met verwarming en enkele druppels 1N HCl
Gibberellic AcidSigma-AldrichG7645Los op in een kleine hoeveelheid ethanol
Equipment
Stereo dissecting microscopeLeicaMZFLIIIOf vergelijkbaar
Light microscopeZeissAxiophotOf vergelijkbaar, met geschikte optica
Digital cameraZeissAxioCam HRcOf vergelijkbaar
Sterilising leaves
250 mL screw cap polycarbonate container with polypropylene lidSARSTEDT75.9922.519Autoklaveerbaar

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gepts, P., et al. Legumes as a model plant family. Genomics for food and feed report of the cross-legume advances through genomics conference. Plant Physiol. 137 (4), 1228-1235 (2005).
  2. Graham, P. H., Vance, C. P. Legumes: importance and constraints to greater use. Plant Physiol. 131 (3), 872-877 (2003).
  3. Young, N. D., Udvardi, M. Translating Medicago truncatula genomics to crop legumes. Curr. Opin. Plant Biol. 12 (2), 193-201 (2009).
  4. Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insights into the evolution of rhizobial symbioses. Nature. 480 (7378), 520-524 (2011).
  5. Gallardo, K., Le Signor, C., Vandekerckhove, J., Thompson, R. D., Burstin, J. Proteomics of Medicago truncatula seed development establishes the time frame of diverse metabolic processes related to reserve accumulation. Plant Physiol. 133 (2), 664-682 (2003).
  6. Verdier, J., et al. Gene expression profiling of M. truncatula transcription factors identifies putative regulators of grain legume seed filling. Plant Mol. Biol. 67 (6), 567-580 (2008).
  7. Thompson, R., Burstin, J., Gallardo, K. Post-genomic studies of developmental processes in legume seeds. Plant Physiol. 151 (3), 1023-1029 (2009).
  8. Wang, X. -D., Song, Y., Sheahan, M. B., Garg, M. L., Rose, R. J. From embryo sac to oil and protein bodies: embryo development in the model legume Medicago truncatula. New Phytol. 193 (2), 327-338 (2012).
  9. Kurdyukov, S., Song, Y., Sheahan, M. B., Rose, R. J. Transcriptional regulation of early embryo development in the model legume Medicago truncatula. Plant Cell Rep. 33 (2), 349-362 (2014).
  10. Mansfield, S. G., Briarty, L. G. Early embryogenesis in Arabidopsis thaliana. 2. The developing embryo. Can. J. Botany. 69 (3), 461-476 (1991).
  11. Seefried, W. F., Willman, M. R., Clausen, R. L., Jenik, P. D. Global regulation of embryonic patterning in Arabidopsis by microRNAs. Plant Physiol. 165 (2), 670-687 (2014).
  12. Birnbaum, K. D., Sánchez Alvarado, A. Slicing across kingdoms: regeneration in plants and animals. Cell. 132 (4), 697-710 (2008).
  13. Rose, R. J., Nolan, K. E., Bicego, L. The development of the highly regenerable seed line Jemalong 2HA for transformation of Medicagotruncatula - implications for regenerability via somatic embryogenesis. J. Plant Physiol. 155 (6), 788-791 (1999).
  14. Nolan, K. E., Song, Y., Liao, S., Saeed, N., Zhang, X., Rose, R. J. An unusual ABA and GA synergism increases somatic embryogenesis, facilitates its genetic analysis and improves transformation in Medicago truncatula. PloS ONE. 9 (6), e99908(2014).
  15. Liu, C. M., Meinke, D. W. The titan mutants of Arabidopsis are disrupted in mitosis and cell cycle control during seed development. Plant J. 16 (1), 21-31 (1998).
  16. Nolan, K. E., Kurdyukov, S., Rose, R. J. Expression of the SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE 1 (SERK1) gene is associated with developmental change in the life cycle of the model legume Medicago truncatula. J. Exp. Bot. 60 (6), 1759-1771 (2009).
  17. Iantcheva, A., Vlahova, M., Atanassov, A., et al. Somatic embryogenesis from leaf explants. The Medicago truncatula handbook. Mathesius, U. , Available from: http://www.noble.org/MedicagoHandbook (2006).
  18. Thomas, M. R., Johnson, L. B., White, F. F. Selection of interspecific somatic hybrids of Medicago by using Agrobacterium transformed tissues. Plant Sci. 69 (2), 189-198 (1990).
  19. Ochatt, S. J. Immature seeds and embryos of Medicago truncatula cultured in vitro. Plant Embryo Culture: Methodsand Protocols, Methods in Molecular Biology. Thorpe, T. A., Yeung, E. C. 710, Springer protocols, Humana press. 39-52 (2011).
  20. Mantiri, F. R., Kurdyukov, S., Lohar, D. P., Sharopova, N., Saeed, N. A., Wang, X. D., VandenBosch, K. A., Rose, R. J. The transcription factor MtSERF1 of the ERF subfamily identified by transcriptional profiling is required for somatic embryogenesis induced by auxin plus cytokinin in Medicago truncatula. Plant Physiol. 146 (4), 1622-1636 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

zygotisch embryosomatisch embryopeulmorfologiebladexplantcultuurhormonencombinatiekwantitatieve PCRb taglucuronidasesteriele techniekembryonale stadia

Gerelateerde artikelen