Eenvoudige-Polyacrylamide gebaseerde Multiwell Stiffness Assay voor de Studie van stijfheid-afhankelijke cel responsen

Summary

Hier wordt een methode beschreven die snelle, efficiënte en goedkope bereiding van polyacrylamide gels in een multiwell plate formaat mogelijk maakt. De methode vereist geen gespecialiseerde apparatuur en kan gemakkelijk worden overgenomen door elk onderzoekslaboratorium. Het zou bijzonder nuttig zijn in onderzoek gericht op het begrijpen van stijfheidsafhankelijke celreacties.

Abstract

Momenteel wordt het merendeel van het in vitro celonderzoek uitgevoerd op stijf weefselkweekpolystyreen (~1 GPa), terwijl de meeste cellen in het lichaam vastzitten aan een matrix die elastisch en veel zachter is (0,1 – 100 kPa). Aangezien een dergelijke stijfheidsdiscrepantie de celreacties sterk beïnvloedt, is er een grote belangstelling voor het ontwikkelen van hydrogelmaterialen die een breed scala aan stijfheden omvatten om als celsubstraat te dienen. Polyacrylamidegels, die goedkoop zijn en het stijfheidsbereik van alle zachte weefsels in het lichaam beslaan, zijn de hydrogel van keuze voor veel onderzoeksgroepen. De bereiding van polyacrylamidegel is echter lang, vervelend en alleen geschikt voor kleine batches. Hier beschrijven we een test die, door gebruik te maken van een permanente flexibele plastic film als structurele ondersteuning voor de gels, de bereiding van polyacrylamidegels in een multiwell plate-formaat mogelijk maakt. De techniek is sneller, efficiënter en goedkoper dan de huidige methoden en maakt de bereiding van gels van aangepaste maten mogelijk die anders niet beschikbaar zijn. Aangezien er geen gespecialiseerde apparatuur voor nodig is, kan de methode gemakkelijk worden overgenomen door elk onderzoekslaboratorium en zou het bijzonder nuttig zijn in onderzoek gericht op het begrijpen van stijfheidsafhankelijke celreacties.

Introduction

De meeste lichaamsweefsels zijn zacht visco-elastisch materiaal met een elasticiteitsmodulus van 0,1 kPa hersenen 100 kPa zachte kraakbeen, maar de meeste in vitro-onderzoek verricht naar weefselkweek polystyreen (TCP) dat een modulus van ~ 1 GPa heeft . ¹ Deze stijfheid mismatch grote invloed op de manier waarop cellen reageren op hun omgeving. Een groeiende hoeveelheid onderzoek is dus gewijd aan het ophelderen van het effect van substraat stijfheid over het lot van verscheidene celtypen, waaronder ^2,3 stamcellen. ⁴ Daardoor zijn verschillende hydrogels ontwikkeld om te helpen bij het ​​begrijpen van stijfheid-afhankelijke cellijn biologie waaronder polyacrylamide (PA), ^5-7 polyethyleenglycol (PEG), ^8,9 polydimethylsiloxaan (PDMS), ¹⁰ en alginaat. ¹¹ Hoewel het bewijs dat substraat stijfheid heeft een aanzienlijke impact op de lot van de cel groeit, de meeste studies zijn uitgevoerd op kleine schaal met een klein aantal jarenamples. Systematische, multidimensionale studies naar het effect van substraat stijfheid voor een serie van celtypen of milieuomstandigheden zijn zeldzaam. ¹²

Verscheidene veelbelovende high-throughput hydrogel technieken ontwikkeld, zoals PEG-gebaseerde microarrays, ¹³ microfluïdische inrichtingen voor de productie van agarose hydrogel microbolletjes, ¹⁴ of micro- en nano-stangen waar stijfheid wordt gemoduleerd door de diameter en hoogte van de microrods. ¹⁵ Nochtans , de technologieën voor te bereiden dergelijke substraten zijn verfijnde en beschikbaar voor een beperkt aantal laboratoria. Veel onderzoek met stijfheid gemoduleerd celresponsen gebruik polyacrylamide (PA) gels die niet alleen goedkoop en eenvoudig te implementeren, maar vertonen ook een fysiologisch relevant bereik van Young's modulus, namelijk 0,3 -. 300 kPa ^16-22 De bestaande werkwijzen te vervaardigen PA gels voor celcultuur zijn arbeidsintensief en dus prepared in kleine batches. Enkele moeilijkheden bij de bereiding van PA gels celsubstraten voort uit het vereiste dat de gels worden bereid: 1) in afwezigheid van zuurstof om volledige polymerisatie mogelijk, 2) met een vlakke oppervlakte uniforme cel toe hechting en verspreiding, en 3) vast aan de onderkant van de celkweekschaal te voorkomen drijven.

Verschillende groepen hebben geprobeerd om PA gels voor celcultuur te produceren in grote batches. Semler et al. Bereide dikke vellen PA gels waarvan vervolgens "cut" met een perforator en geplaatst in 96-well platen. ²³ Deze methode is beperkt tot stijver gels, namelijk> 1 kPa in Young's modulus, want zachter gels zijn "sticky", moeilijk te snijden en gemakkelijk beschadigd. Mih et al. Ontwikkelden een meer geavanceerde techniek waardoor de gels rechtstreeks worden gepolymeriseerd glazen bodem multi- putjesplaat. ^{6 Dit werd bereikt door het gieten van de gel-oplossingen in gefunctionaliseerde glas-bodemplaten en de vorming van gels door "sandwichen" ze met een aangepaste dekglaasje array. 6 Hoewel veelbelovend, lichte voorsprong effecten werden nog waargenomen met deze techniek. Daarnaast is de techniek vereist een speciaal ontworpen matrix niet onmiddellijk door veel laboratoria en kostbare glazen bodem putjes.}

Dit artikel beschrijft een eenvoudige en goedkope manier om PA gels monteren in een plaat met meerdere putjes die door elk laboratorium gemakkelijk kunnen worden vastgesteld. Hier wordt een flexibele kunststof gebruikte drager, die twee kanten heeft - een hydrofoob is, dat afweermiddel voor PA gels, en een hydrofiele, die covalent bindt PA gel op afzetting. Zodra PA gel platen worden gedeponeerd en permanent aangebracht op de flexibele kunststof steun, maakt het hanteren van gels van elke dikte of stijfheid en snij ze in elke gewenste vorm. Dit ca.oach produceert niet alleen de aangepaste plastic 'coverslips' in de maten anders niet in de handel verkrijgbaar, maar voorkomt ook de noodzaak om glasoppervlakken-treat pre, ofwel dekglaasjes of de putten van dure glazen bodem putjes, met een PA binding oplossing, dat is een vervelende en tijdrovende stap. Tenslotte kan uniform PA gels platen worden bereid in grote series en opgeslagen de gehydrateerde enkele maanden.

Kortom, de assay hier gepresenteerde is een verbetering over bestaande werkwijzen in verschillende aspecten. Ten eerste, het proces van multi-putjesplaat samenstel efficiënt, en de totale kosten van de benodigde materialen is laag. Ten tweede worden de hydrogelen in grote batches in een homogene gel film. Tenslotte uitsluitend materialen die commercieel verkrijgbaar zijn vereist. De bruikbaarheid van de test wordt geïllustreerd door onderzoeken van het effect van substraat stijfheid op celmorfologie en verspreidingsgebied.

Protocol

1. Bereiding van Hydrogel-geassocieerde oplossingen en Aliquots

1. Bereiding van polyacrylamide gel precursor oplossing.
   1. Bereid polyacrylamide gel precursor oplossing door mengen acrylamide (A) (40% w / v, M _r 71,08 g / mol), de crosslinker bisacrylamide (B) (2% w / v, M _r 154,17 g / mol), en de- geïoniseerd water in het volume percentages in tabel 1.
      Opmerking: Deze oplossingen kunnen worden bereid in grote hoeveelheden en bij 4 ° C gedurende enkele maanden.
      1. WAARSCHUWING: Acrylamide toxisch bij inhalatie of inname, vooral wanneer in poedervorm dus gebruik bij voorkeur 40% w / v oplossing toxiciteit risico's. Behandelen alleen tijdens het dragen van beschermende kleding, zoals handschoenen, een veiligheidsbril en een laboratoriumjas. Bewaren in een licht-bestendig, goed gesloten verpakking in de koelkast (<23 ° C, goed geventileerde ruimte).
      2. LET OP: Bis-acrylamide is giftig bij inademing of inname, in het bijzonder,wanneer in poedervorm dus gebruik bij voorkeur 2% w / v oplossing toxiciteit risico's. Behandelen alleen tijdens het dragen van beschermende kleding, zoals handschoenen, een veiligheidsbril en een laboratoriumjas. Bewaren in een licht-bestendig, goed gesloten verpakking in de koelkast (<4 ° C, goed geventileerde ruimte).
2. Voorbereiding en het gebruik van N -Sulfosuccinimidyl-6- (4'-azido-2'-nitrofenylamino) hexanoaat (Sulfo-SANPAH, M _r 492,40 g / mol) porties. LET OP: Sulfo-SANPAH veroorzaakt ernstige oogirritatie; handvat met handschoenen en een goede oog- of gelaatsbescherming. Bewaren bij -20 ° C na ontvangst en voor aliquoteren.
   1. Om sulfo-SANPAH opslaan: los sulfo-SANPAH in dimethylsulfoxane (DMSO) bij 50 mg / ml. Aliquot de stockoplossing in 50 micro centrifuge buizen van 20 ui per buis. Flash bevriezing op droog ijs of vloeibare stikstof (optioneel maar voorkeursstap maximale verknopingsmiddel efficiëntie behouden) en bewaar bij -80 ° C.
      OPMERKING: De porties can worden opgeslagen voor enkele maanden.
   2. Om sulfo-SANPAH gebruiken: ontdooien de hoeveelheid kort en verdund in 480 ul van gedeïoniseerd water. Onmiddellijk gebruiken. Sulfo-SANPAH hydrolyseert snel in water: dus voorzichtigheid te nemen om al het bovenstaande stappen snel uit te voeren.
3. Bereiding van ammoniumpersulfaat _(Mr 228,18 g / mol) hoeveelheden.
   OPMERKING: Ammoniumpersulfaat veroorzaakt ogen, huid en irritatie van de luchtwegen. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen bij het hanteren. Handvat ammoniumpersulfaat poeder in een zuurkast. Bewaren poeder in een droge, goed geventileerde plaats. Eenmaal porties verdeeld, kan de verdunde oplossing worden gebruikt op de werkbank.
   1. Los ammoniumpersulfaat in gedeïoniseerd water tot een uiteindelijke ammoniumpersulfaat concentratie van 10% g / v te bereiken. Aliquot en bewaar bij -20 ° C. Ontdooi onmiddellijk voor gebruik.
4. Bereiding van collageen type I oplossing.
   1. Bereid 0,2 mg / ml collageen oplossing door verdunning van de voorraad, zodatlutie in 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) pH 7,4. Slaan op ijs kort of onmiddellijk gebruik na verdunning.

2. Hydrogel Voorbereiding (zie Figuur 1)

1. Bereiding van hydrofobe glasplaatjes.
   1. Plaats een paar druppels van een hydrofobe oplossing op een glasplaat en gebruik tissue verspreid over het oppervlak. Laat aan de lucht drogen en veeg met een papieren zakdoekje weer om zelfs uit de hydrofobe coating.
      OPMERKING: Bewaren hydrofobe oplossing in een brandbare kast bij RT. Draag persoonlijke beschermingsmiddelen bij het hanteren. Werk in een goed geventileerde ruimte.
2. Voorbereiding van flexibele kunststof steun.
   1. Snij de flexibele plastic steun aan de grootte van de hydrofobe beklede glasplaat passen.
   2. Markeren de hydrofobe kant van de flexibele plastic steun door licht krassen op het oppervlak met een scherp voorwerp, zoals een scalpel.
      OPMERKING: Zodra de gel - en dat is volledig transparant - Dries, De krassen zal helpen onderscheiden welke flexibele kunststof steun kant bevat de gel.
      OPMERKING: De flexibele plastic drager een hydrofoob en een hydrofiel kant. Eenmaal afgezet, polyacrylamide permanent houdt zich aan de hydrofiele kant van de plastic steun die gemakkelijk daaropvolgende hydrogel hantering vergemakkelijkt.
3. Gel Bereiding (bijvoorbeeld volumes gegeven 5 ml gel precursor toegevoegd).
   OPMERKING: 5 ml voldoende is om ~ 40 gels zou zijn wanneer de gel oorspronkelijke dikte is 0,5 mm. Meer gels kunnen ontstaan ​​indien de gel dikte wordt verminderd.
   1. Plaats 4972,5 ui polyacrylamide precursor oplossing gewenste eindconcentratie (tabel 1) in een 50 ml conische buis. Plaats in een ontgassingskamer gedurende 30 min met de dop geopend.
      OPMERKING: Zuurstof fungeert als een vrije radicalen vanger en, indien aanwezig, het remt polymerisatie.
   2. Voeg 25 ul van 10% w / v ammoniumpersulfaat (zie punt 1.3) tot een uiteindelijke bereikenammoniumpersulfaat concentratie van 0,05%.
   3. Voeg 2,5 gl N, N, N ', N'-tetramethylethyleendiamine (TEMED, M _r 116,24 g / mol) aan de ontgaste gel oplossing tot een uiteindelijke TEMED concentratie van 0,5% te bereiken.
      OPMERKING: Bewaren TEMED in een brandbare kast bij RT. Hanteer in een zuurkast bij het dragen van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen. Goed gesloten houden onder inert gas, want het is zeer lucht en vocht gevoelig.
   4. Meng de oplossing voorzichtig door en neer te pipetteren 3-5 keer. Niet vortex diffusie van zuurstof in de gel precursor oplossing voorkomen.
   5. Pipetteer de gel oplossing op de hydrofiele kant van de flexibele plastic steun en sandwich met hydrofobe coating glasplaatje. Scheid de twee dia met siliconen afstandhouders van gewenste dikte (bijvoorbeeld 0,5 mm). Laat een kleine hoeveelheid (-100 pl) polymeer precursor oplossing in de 50 ml conische buis te gebruiken als een indicator van gelering.
      OPMERKING:Elke spacer worden gebruikt. Bijvoorbeeld, een enkele strook van Parafilm geeft een definitieve gezwollen gel dikte van 100-120 urn.
   6. Plaats een andere glasplaat boven op de flexibele plastic support / gel-sandwich tot een nog hydrogel oppervlak nagaan bij polymerisatie.
   7. Laat de gel polymeriseren gedurende 45 min, hoewel minder tijd kan worden gebruikt voor gels hoger% gew indien gewenst. Ervan te vergewissen dat de gel is gepolymeriseerd, observeert de resterende oplossing in de 50 ml conische buis; indien de resterende oplossing gegeleerd, dan is het waarschijnlijk dat gelering op de glasplaat is ook geïnitieerd. Merk echter op dat voortijdige opening van de mal wordt voorkomen dat volledige polymerisatie.
   8. Zodra de gel wordt gevormd, schil van de flexibele plastic ondersteuning met het covalent gebonden polyacrylamidegel- op de top, en stel gel-side-up aan de lucht drogen.
      OPMERKING: Convectie of warmte drogen kan ook worden gebruikt om deze stap te versnellen. Eenmaal gedroogd op de flexibele kunststof steun, kan de gel winkelonbepaalde tijd d.
      1. Markeert geen kale plekken van de flexibele plastic steun, waar polyacrylamidegelen vormden geen gevolg van bubbels. Mark, terwijl de gel wordt nog steeds gehydrateerd, omdat dit zal in combinatie met de flexibele kunststof voor ondersteuning zodra de gel droog is.

3. Multiwell Plate Assembly, Collageen Coating, en Sterilisatie

1. Multiwell plaat montage.
   1. Eenmaal gedroogd, gesneden PA gels in de gewenste vorm.
      1. Voor een 96-well plaat, gebruik maken van een heavy-duty perforator met een diameter van ~ 6 mm. Gebruik een heavy-duty papiersnijder te gels gesneden in vierkante of rechthoekige vormen. U kunt ook gebruik maken van een schaar.
   2. Bereid ongeveer 500 pl PDMS per plaat met 96 putjes volgens de instructies van de fabrikant. Om de gels aan de bodem van een multi-putjesplaat lijm, plaats een kleine druppel (~ 5 pl) van polydimethylsiloxaan (PDMS) in het midden van elk putje. Met behulp van een tang, plaats een polyacrylamidee gel in elk putje, flexibele plastic steun naar beneden. Toestaan ​​PDMS uitharden, laat de gemonteerde plaat bij 37 ° C gedurende minimaal 4 uur.
2. Collageen coating van polyacrylamide gels.
   1. Met een transfer pipet, plaats een kleine hoeveelheid (7-8 pl) van sulfo-SANPAH (zie punt 1.2.2) goed en werveling in elk van links naar rechts om de vacht van de gel oppervlak gelijkmatig. Werken prompt sinds sulfo-SANPAH is niet stabiel in het water.
   2. Plaats de wells plaat onder een UV-lamp met hoge intensiteit (intensiteit = 37 mW, λ = 302-365 nm) gedurende 5 min. Spoel de gels met PBS om overtollig sulfo-SANPAH verwijderen.
   3. Pipetteer 50 ul van 0,2 mg / ml collageen type I oplossing (zie punt 1.4) in elk putje. Laat de plaat afgedekt bij kamertemperatuur gedurende ten minste 2 uur of O / N bij 4 ° C.
      OPMERKING: Om het proces te versnellen van collageen coating, kan een transfer pipet worden gebruikt om de collageen-oplossing toe te voegen. Typisch, 1 - 2 druppels dient oplossing genoeg voltooienly bedekken de gel oppervlak.
   4. Laat de put plaat bij kamertemperatuur gedurende ten minste 2 uur aan collageen binding staan.
   5. Spoelen met PBS om het teveel aan collageen oplossing te verwijderen en te steriliseren onder UV (λ = 200 nm) in een weefselkweek kap voor 2 uur.
   6. Week de gels in compleet medium (zie paragraaf 4.1 voor de samenstelling van het medium) O / N om te hydrateren en evenwicht. Gebruiken voor cell onmiddellijk of op te slaan zaaien in de koelkast tot 2 dagen.

4. Cell Zaaien op PA Stijfheid Assay

Opmerking Hoewel typisch voor zachte zoogdiercellijnen, het protocol beschreven in dit gedeelte wordt specifiek gebruikt met borstkanker MDA-MB-231 cellijn (zie figuren 4 en 5).

1. Verzamel cellen van weefselkweek kolf blootstelling aan 5% trypsine / EDTA gedurende 5 minuten bij 37 ° C. Gebruik ~ 80 ul van trypsine / EDTA per elke cm ² van de kolf gebied; bijvoorbeeld, gebruik 2 ml trypsine / EDTA fora T25 celkweekkolf. Resuspendeer verzamelde cellen in compleet medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine bij een gewenste uiteindelijke celconcentratie. Gezien cel verdubbelingstijd en de tijd de cellen worden gezaaid op de assay Kies een geschikte sub-confluente celconcentratie. Ervoor zorgen dat de toegevoegde medium is genoeg om helemaal onder te dompelen de hydrogels.
   OPMERKING: Aangezien hydrogelen werden vooraf geëquilibreerd in media (zie 3.2.6 stap) 100 pl volume voldoende zijn. Typische medium volumes voor putjes moeten toereikend, omdat de gels werden vooraf geëquilibreerd in media in de vorige stap.
   OPMERKING: De test geschikt voor elke attachment-afhankelijke celtype zou zijn.
   1. Telling aantal cellen onder een omgekeerde microscoop met behulp van een hemacytometer. Load 10 ul van celsuspensie in elk hemacytometer poort en het gemiddelde van het aantal cellen van ten minste 8 kwadranten. Om het te krijgeneindcelconcentratie, vermenigvuldig het aantal cellen met 10 ^4.
      OPMERKING: Beste celgetal resultaten worden verkregen als het aantal cellen in elke hemacytometer kwadrant is 20-50.
2. Kweek van de cellen op de PA stijfheid assay in een bevochtigde incubator bij 37 ° C en 5% _CO2. Veranderen media elke 2-3 dagen. Verzamel cellen indien nodig door blootstelling aan 5% trypsine / EDTA bij 37 ° C gedurende 5 min. Gebruik ~ 80 ul van trypsine / EDTA per ^cm2 van weefselkweek kolf. Tijdens alle cel manipulatie stappen te nemen speciale zorg van de hydrogel oppervlak niet te verstoren: aspireren of pipet medium door lichtjes kantelen van de multi- plaat zijwaarts en aanraken van de pipet op de zijwand van elk putje, in tegenstelling tot het aanraken van de hydrogel.
   OPMERKING: Behalve lettend de hydrogel oppervlak tijdens standaard weefselkweek behandeling niet te beschadigen, de cellen gezaaid op de stijfheid test kan worden gemanipuleerd op dezelfde wijze als wanneer zij werden geënt opnaar een reguliere meerdere putjes plaat.

5. Beeldvorming van cellen gezaaid op PA Stijfheid Assay

1. Afbeelding cellen direct aan de PA stijfheid test.
   OPMERKING: microscoop - omgekeerd, fluorescent, of confocale kunnen worden gebruikt cell imaging.
   OPMERKING: De flexibele kunststof steun gebruikt om de stijfheid test te construeren is volledig transparant en niet autofluoresce of interfereren met cell imaging. Echter, hoewel de flexibele kunststof drager zelf transparant, grafische mogelijkheden beperkt door de werkafstand van de doelstelling. De flexibele kunststof drager heeft een dikte van 0,23 mm en een typische werkafstand van een 10X objectief is ~ 4 mm, sterk dalende hogere vergrotingen.
   1. Voor live cell imaging, positie PA stijfheid test in microscoop plaathouder en imago. Houd beeldvorming sessies onder de 2 uur, of gebruik een microscoop voorzien van een milieu-kamer voor langere belichtingstijden.
   2. Wanneer levende cellen imaging is niet het doel, te repareren cellen in 4% formaldehyde-oplossing aangevuld met 0,1% wasmiddel. Geniet cellen in fixeermiddel bij kamertemperatuur gedurende minimaal 2 uur. Spoelen met PBS twee keer. Gooi fixatief afval in een aangewezen afvalcontainer.
      OPMERKING: Cellen kunnen direct worden afgebeeld of opgeslagen ondergedompeld in PBS bij 4 ° C gedurende maximaal 2 weken. LET OP: Formaldehyde is giftig bij inademing en contact. Handvat met handschoenen in een zuurkast.
      OPMERKING: Cel fixatie protocol worden gekozen op basis van de volgende cel kleuring en behandeling protocollen, omdat sommige fixeermiddelen beschadigen enkele cel eiwitten.
   3. Voor fluorescerende beeldvorming, vlek vaste cellen met gewenste cel vlek direct in de multi- plaat. Afbeelding onmiddellijk.

Results

Polyacrylamide (PA) hydrogels worden wijd gebruikt om stijfheid afhankelijke cel responsen testen. ^17,24 Door het mengen verschillende concentraties van acrylamide (A) en bis-acrylamide (B) kan PA gels die de stijfheidsgebied meeste zachte weefsels omvatten maken het lichaam - 0,3 -.. 300 kPa Young's modulus ¹ evenwel bereiding van polyacrylamidegels is vervelend en tijdrovend, vaak beperkt hun bruikbaarheid in "high-throughput" toepassingen zoals bijvoorbeeld drug discovery ¹²

Discussion

Polyacrylamide gels, oorspronkelijk ontwikkeld voor elektroforese, ²⁸ worden nu routinematig gebruikt als celkweek substraten om de effecten van substraat stijfheid op celmorfologie, beweeglijkheid en communicatie ^3,24,29 onder celeigenschappen bestuderen. Polyacrylamide staat manipulatie substraat stijfheid om de stijfheid van alle zachte weefsels in het lichaam omvatten (0,3-300 kPa) ¹ met een eenvoudige verandering in polymeervoorloper concentratie (Figuur 2, Tabel 1,...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
40% Acrylamide	Bio-Rad	161-0140
2% Bis-acrylamide	Bio-Rad	161-0142
Ammonium Persulfate	Bio-Rad	161-07000
TEMED	Sigma Aldrich	T9281
Sulfo-SANPAH	Thermo Scientific	22589
Collagen Type 1, from Rat tail, 3.68 mg/ml	BD Biosciences	354236
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	BP231-100
Hydrophobic solution — Repel Silane	GE Healthcare Bio-Sciences	17-1332-01
PBS (1x), pH 7.4	HyClone	SH30256.01
Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit]	Elsworth Adhesives	3097358-1004
Tyrpsin/EDTA (10x)	Sigma Aldrich	44174
RPMI-1640 Medium (1x)	HyClone	SH30027-02
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH30073-03
Penicillin Streptomycin	MP Biomedicals	1670046
Detergent: Triton-X	Sigma Aldrich	T8787
Formaldehyde 37% Solution	Sigma Aldrich	F1635
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A2153
BSA-based cell adhesion blocking kit — ECM Cell Adhesion Array Kit	Chemicon International	ECM540
Disposable lab equipment
flexible plastic support — GelBond PAG Film for Polyacrylamide Gels	GE Healthcare Bio-Sciences	309819
Glass Plates	Slumpys	GBS4100SFSL
50 ml conical tubes	Fisher Scientific	3181345107
15 ml conicals tubes	FALCON	352097
Micro centrifuge tubes	Fisher Scientific	2 ml: 02681258
96-well plate (flat bottom)	Fisher Scientific	12565501
Disposable Pipettes (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml)	Fisher Scientific	1 ml: 13-678-11B, 2 ml: 05214038, 5 ml (FALCON): 357529, 10 ml: 13-678-11E, 25 ml: 13-678-11, 50 ml: 13-678-11F
Glass Transfer Pipettes	Fisher Scientific	5 3/4": 1367820A, 9":136786B
Pipette Tips (1-200 μl, 101-1000 μl)	Fisher Scientific	2707509
Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes	Fisher Scientific	13-711-9D
Parafilm	PARAFILM	PM992
Powder Free Examination Gloves	Quest	92897
Silicone spacers — Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm	Grace Bio-Labs	JTR-S-0.5
Large/non-disposable lab equipment
Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M)	Zeiss	3820005619
Microscope Software	Zeiss	AxioVision Rel. 4.8.2
UV oven	UVITRON	UV1080
Vacuum chamber/degasser	BelArt	999320237
Vacuum pump for degasser	KNF Lab	5097482
Tissue Culture Hood	NUAIRE	NU-425-600
Chemical Fume Hood	KEWAUNEE	99151
Inverted Microscope (Axiovert 25)	Zeiss	663526
Incubator	NUAIRE	NU-8500
Pipette Aid	Drummond Scientific Co.	P-76864
Hemacytometer	Bright-Line	383684