Analyse van Cardiomyocyte Development behulp Immuunfluorescentie in Embryonale Muis Hart

Summary

Mutations that lead to congenital heart defects benefit from in vivo investigation of cardiac structure during development, but high-resolution structural studies in the mouse embryonic heart are technically challenging. Here we present a robust immunofluorescence and image analysis method to assess cardiomyocyte-specific structures in the developing mouse heart.

Abstract

Tijdens de ontwikkeling van het hart, de generatie van myocardiale specifieke structurele en functionele eenheden zoals sarcomeres, contractiele myofibrils, tussengevoegde schijven en costameres vereist de gecoördineerde assemblage van meerdere componenten in tijd en ruimte. Verstoring in het installeren van deze componenten leidt tot ontwikkelingsstoornissen hartafwijkingen. Immunofluorescentiekleuring technieken worden algemeen gebruikt in gekweekte cardiomyocyten te myofibril rijping sonde, maar ex vivo benadering wordt beperkt door de mate waarin myocyten volledig differentiëren in cultuur ontbreken van normale in vivo mechanische input, en afwezigheid van endocardiale signalen. Toepassing van immunofluorescentie technieken voor de studie van ontwikkeling muizenhart is wenselijk maar technisch uitdagend en methoden vaak niet voldoende gevoeligheid en resolutie te sarcomeren zichtbaar in de vroege stadia van ontwikkeling van het hart. Hier beschrijven we een robuuste en reproduceerbare methode samen immunostain multiple eiwitten of om samen te visualiseren een fluorescerend eiwit met immunofluorescentiekleuring in de embryonale muis hart en gebruiken deze methode te ontwikkelen myofibrils, geïntercaleerd schijven, en costameres analyseren. Deze werkwijze kan verder worden toegepast cardiomyocyten structurele veranderingen veroorzaakt door mutaties die leiden tot ontwikkelingsstoornissen hartafwijkingen beoordelen.

Introduction

Tijdens de ontwikkeling, hart weeën beginnen kort na hartspiercellen migreren naar de middellijn en vormen de lineaire hart buis ^1,2. De sarcomeer is de fundamentele contractiele eenheid binnen de cardiomyocyte; deze zeer georganiseerde cytoskeletstructuur bevat actine filamenten verankerd aan de Z-disc sarcomeer α-actinine (s-α-actinine) en myosine vezels verankerd aan de M-lijn (figuur 1). Zoals de cardiomyocyte rijpt, sarcomeres assembleren in serie te myofibrils die zich uitstrekken over de cel te vormen. Myofibrillen zijn verankerd aan de einden van de cardiomyocyten van de geïntercaleerde schijf, de cel-cel junctional structuur die een over- kruising met een deelverzameling van Z schijfvormige elementen zoals s-α-actinine ^3, adherens bevat junction eiwitten zoals N-cadherine en β catenine, gap junction eiwitten en desmosomen (figuur 1) ^4. Langs de lengterichting membraan, de Z-schijven van perifere myofibrillen ookhechten aan het celmembraan via costameres; deze gespecialiseerde focale adhesies vormen een anker tussen de myofibril, plasmamembraan en extracellulaire matrix aanvullende structurele steun aan de cardiomyocyten voorzien (figuur 1) ^4. Vroeg in de ontwikkeling van het hart, zijn hartspiercellen gerangschikt in vinger-achtige projecties bekend als trabeculae die uitsteken in de ventriculaire ruimte en bevatten relatief volwassen myofibrils ^5. Zoals ontwikkeling van het hart opbrengst, de hartspiercellen in de sub-epicardial regio woekeren met de compacte myocard dat de ventriculaire muren bestaat, maar sarcomeer en myofibril assemblage zijn vertraagd in vergelijking met trabeculair myocard ^5,6 te vormen.

Modellen van sarcomeer en myofibril samenstel zijn grotendeels het gevolg immunofluorescentie studies op gekweekte cardiomyocyten ^7-10, die eenvoudig zijn maar missen een driedimensionale omgeving, de bloedstroom, en contacten met andere hartcels aanwezig in vivo. Hoge-resolutie structurele studies met behulp van immunofluorescentie in de muis embryonale hart zijn technisch uitdagend, en weinig studies hebben de opkomst van geïntercaleerd schijven en costameres tijdens muis ontwikkeling van het hart onderzocht. De adherens junction eiwit β catenine lijkt te lokaliseren om geintercaleerde schijven van embryonale dag (E) 17,5 ^11, N-cadherine lokaliseert om lineaire structuren die geïntercaleerd schijven door E18.5 ¹² versus postnatale dag 0 ¹³ kan vertegenwoordigen, en costameres zijn geconstateerd E18.5 ^14, maar deze eiwitten weer te diffuus en meer continue membraan distributie in eerdere ontwikkelingstijd punten ^11-13.

We beschrijven hier een eenvoudige en reproduceerbare werkwijze voor immunokleuring en fluorescentie microscopie van doorsnede muis embryonale hart dat zorgt voor gedetailleerde analyse van myofibril en cardiomyocyten ontwikkeling, waaronder de opkomst van intercalated discs zo vroeg E12.5 en ontluikende costameres op E16.5. Dit protocol kan nuttig zijn voor het sonderen van de effecten van de mutaties op de sarcomeer vorming evenals myofibril en cardiomyocyte rijping zijn.

Protocol

OPMERKING: Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door de UCSF Institutional Animal Care en gebruik Comite.

1. cryopreservatie en fixatie van de embryonale Mouse Hearts.

1.1) Snap-bevriezing embryonale harten

1. Vul een 3,5 cm petrischaal en 7 mm cryomolds met Optimal Cutting Temperatuur (oktober) medium (zie ook Materiaal tabel). In een chemische afzuigkap, koel 2-methylbutaan in vloeibare stikstof.
2. Breng 30 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) in 10 cm petrischalen, 10 ml PBS in 3,5 cm petrischalen, en plaats alle petrischaaltjes op ijs. Bereid een 10 cm schotel en diverse 3,5 cm gerechten per zwanger muis.
3. Isoleer embryo's zoals eerder beschreven ¹⁵ uitvoeren van de dissectie in ijskoude PBS.
4. In het kort, euthanaseren de zwangere vrouw met behulp van CO ₂ narcose en cervicale dislocatie.
   1. Maak een insnijding in de buik, ontleden uit de baarmoeder door alo het snijden van de schepenng de binnenbocht van de baarmoeder, en breng de baarmoeder 10 cm petrischaaltje met ijskoude PBS.
   2. Snijd de baarmoeder tussen elke embryo transfer naar een individuele 3,5 cm petrischaal met ijskoude PBS. Isoleer elk embryo zoals beschreven ^15.
   3. Open de pericardiale holte met fijne tang, verwijder het hart afstand van de longen en bloedvaten door te snijden in de aorta, vena cava, en pulmonaire aders en overdracht naar de 3,5 cm petrischaaltje met oktober
   4. Laat het hart in evenwicht in oktober voor een paar seconden, dan dragen het hart in de 7 mm mal met oktober Richt de voorste wand van het hart naar de bodem van de vorm.
5. Plaats voorzichtig de mal in vloeibare stikstof gekoelde 2-methylbutaan. Let er dan op toe 2-methylbutaan vloeistof aan de LGO of hart te raken. Bevriezen totdat de LGO is effen wit, dan is de overdracht van de mal om een ​​ijsemmer met droogijs. Ga verder met de volgende embryo.
6. Wrap cryomolds in folie en bewaar bij -80 ° C tot klaar voor cryosectioning.

1.2) Alternatief: Paraformaldehyde (PFA) vaststellen, cryoprotecting en oktober inbedding embryonale harten

1. Vul de putjes van een 12-well weefselkweek plaat met 4% PFA in 1x PBS.
2. Ontleden de embryonale harten zoals beschreven in 1.1.3. Plaats elk hart in een putje met 4% PFA en vast te stellen op 4 ° CO / N.
3. Cryoprotection: met een plastic overdracht pipet, verplaatsen elk hart van een 1,5 ml microcentrifugebuis met 1,5 ml 15% sucrose in PBS en voorzichtig roeren bij 4 ° C totdat het hart zinkt naar de bodem van de buis (enkele uren tot O / N ). Transfer elk hart om een ​​1,5 ml microcentrifugebuis met 1,5 ml 30% sucrose in PBS en voorzichtig roeren bij 4 ° C totdat de hart zinkt naar de bodem van de buis (enkele uren tot O / N).
4. Met behulp van een plastic transferpipet, plaats de cryobeschermd hart in oktober en laat het evenwichtgedurende enkele minuten om overtollig sucrose te verwijderen, vervolgens over het hart in de 7 mm mal met oktober Richt de voorste wand van het hart naar de bodem van de vorm.
5. Bevries het hart in oktober door het plaatsen van de mal in vloeibare stikstof gekoelde 2-methylbutaan of droogijs.
6. Wikkel cryomolds in folie en bewaar bij -80 ° C tot klaar voor cryosectioning.

2. cryosectioning

1. Stel cryostaat temperatuur tot -17 ° C.
2. Plaats cryomolds in de cryostaatkamer en equilibreren temperatuur gedurende 15-20 minuten.
3. Keer de cryomold en gebruik zachte druk op het hart blok te verdrijven uit de mal. Richt de voorste wand van het hart naar de top van de gevormde weefsel blok.
4. Zet een grote daling van oktober op de boorkop, en monteer het hart blok op de oktober daling te bevriezen op de boorkop. Houd de oriëntatie zodanig dat de voorste wand van het hart het verst van de boorkop.
5. Laad de boorkop en gemonteerd hijart blok op de houder cryostaat object. Stel zodat de hoek van het blad 3-5 ° ten opzichte van het monster.
6. Verzamel 10 micrometer secties op objectglaasjes die zijn voorbehandeld met een positief geladen coating (zie Materialen tabel). Laat volledig drogen voordat het opslaan bij -80 ° C.

3. Immuunfluorescentie

1. Voor snap-ingevroren secties, te repareren en permeabilize weefsel in aceton gedurende 10 min in een zuurkast bij RT.
2. Voor ingevroren en PFA gefixeerde secties incuberen in PBS-0,1% Triton X-100 gedurende 20 min oktober verwijderen en PFA gefixeerde secties permeabilize.
3. Block 45 min in 1x blokkerende buffer, verdund in PBS.
4. Bij gebruik van een primair antilichaam opgewekt in muizen, incubeer in ezel of geit anti-muis IgG (H + L) monovalent Fab fragment 1: 100 verdund in PBS-0,1% Tween 20 gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur (zie bespreking).
5. Incubeer in primair antilichaam of antilichamen verdund in 1 x blokkeerbuffer gedurende 2 uur bij KT ofO / N bij 4 ° C (zie tabel van Materialen / Apparatuur voor specifieke verdunningen).
6. Was secties in 1x PBS driemaal gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
7. Incubeer in Alexa Fluor-geconjugeerd secundair antilichaam 1: 500 verdund in blokkerende buffer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht.
8. Was secties in 1x PBS driemaal gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht.
9. Optioneel: Incubate in Hoechst kleurstof verdund 1: 2000 in PBS bij RT (beschermd tegen licht) tot kernen labelen, daarna spoelen met PBS.
10. Post-fix gemerkte secties 1% PFA gedurende 1 min bij kamertemperatuur.
11. Mount schuift anti-fade medium (met DAPI als kernen niet reeds gemerkt) door twee druppels drager aan elk uiteinde van de schuif en die vervolgens met een dekglaasje. Afdichting coverslips met nagellak. Store beschermd tegen licht bij 4 ° C tot klaar om de afbeelding.

4. confocale beeldvorming en beeldanalyse

1. Zet de juiste lasergolflengten, camera, en confocale microscoop incLuding podium mover en z motor. Start de imaging software programma. Gebruik de 405, 488, en 561 lasergolflengten voor beeldvorming Hoechst-, Alexa 488- en Alexa 568-gekleurde coupes, respectievelijk.
   OPMERKING: Zie Materialen Tafel voor onze hardware en software specificaties.
2. Monteer de regelschuif (dekglaasje naar beneden voor een omgekeerde microscoop) op de dia podium.
3. Met behulp van de 4X doelstelling (zie Materialen tabel), vind het monster en interessegebied. Leg het beeld om te gebruiken als een kaart weergegeven wanneer de beeldvorming bij een hoge vergrotingsfactor.
4. Verwijder de glijbaan, waardoor minimale aanpassingen aan de dia podium. Wijziging van de 60x olie-immersie objectief (zie Materialen tabel), plaats een kleine druppel olie op het doel, en vervang de dia (dekglaasje naar beneden) op de dia podium.
5. Weer vinden monster. Stel het laservermogen, belichtingstijd en binning op de gewenste niveaus voor elk kanaal.
   LET OP: Wij gebruiken over het algemeen laservermogen van 0,8, blootstelling camera tijd van 100 msec en binning van 2 (see Materialen Tabel hardware en software specificaties); optimale instellingen moeten empirisch worden bepaald voor elk experiment.
   1. Zodra de optimale instellingen worden bepaald, gebruik dan dezelfde instellingen voor alle coupes binnen het experiment. Gebruik het histogram aan de optimale intensiteit bereik mee voor elk kanaal (deze informatie wordt gebruikt voor analyse).
6. Genereer az stack met de overname functie: kies de juiste laser kanalen, kies dan de bovenste en onderste grenzen van de z-stack. Kies az stack stapgrootte die de helft van de waarde van de optische plakdikte door de software. Klik op "run" om de beelden te verzamelen.
7. Gebruik Fiji ¹⁶ of een vergelijkbaar programma voor beeldanalyse. Binnen Fiji, opent de z-stack-bestand met aangepaste kleur optiemodus en de kanalen te splitsen in aparte vensters. Open de "Helderheid / Contrast" tool van de Image pulldown-menu; binnen elk kanaal, set de optimale histogram intensiteitsbereik bepaald in 4.5.1. Deze kanaal reeksen van toepassing op alle z stapels wordt geanalyseerd.
8. Samenvoegen van de afzonderlijke kanalen in één foto samengesteld met behulp van Beeld-> Kleur pulldown menu.
9. Maak een afgeplat z stapel uit de samengestelde afbeelding met behulp van de Beeld-> Stacks-> menu z project. Dit beeld zal aanzienlijk helderder het 3D-beeld dan zijn; pas de histogram intensiteit bereik voor de steekproef voor controles oververzadiging te voorkomen, en dezelfde instellingen toepassen om de experimentele afgevlakt z stack.
10. Om een 3D-beeld te genereren, gebruikt u eerst de Beeld-> Stacks-> menu 3D-project ^17. Kies voor de x-as of Y-as van rotatie. Stel de slice afstand als hetzelfde aantal micron z stack stapgrootte. Kies de gewenste totale rotatie en stel de draaihoek increment op 1. Open vervolgens de Image J 3D Viewer uit de Plugins pulldown menu. Kies de samengestelde afbeelding gegenereerd in 4.8, display, volume, en zet de Resampling factor 1 of 2.

Results

De figuren 2 tot en met 6 tonen typische resultaten voor co-kleuring van verschillende eiwitten in een snap-bevroren en aceton gefixeerde hart. Het antilichaam tegen B-α-actinine reproduceerbaar gemerkte Z-schijven en geïntercaleerde schijven met hoge specificiteit en minimale achtergrond (Figuren 2A, 3A, 4A, 5A, 6A en 6C) Figuur 6 toont dat de anti-muis IgG (H + L) monovalente Fab fragment blokkeert effectief de endogene muis IgG binding van anti-muis secundaire antilichamen. Het antilichaam tegen adherens junction eiwit β catenine gebonden het membraan zowel cardiomyocyten als niet-cardiomyocyt cellen en co-lokalisatie met s-α-actinine opgetreden bij veronderstelde tussengevoegde schijven op E16.5 (figuur 2C en D), zoals verwacht van de β catenine kleuringspatroon in het volwassen hart ^18. β1 integrine immunofluorescentie in het embryonale hart is bijzonder uitdagend en vaak niet in slaagt om focale adhesies ¹⁴ te identificeren, maar β1 integrine kleuring in deze studies is gebleken signaal met dezelfde frequentie als s-α-actinine label Z-schijven, mogelijk als gevolg van ontluikende costameres vormen op E16.5 (Figuur 3D).

Bij E12.5, s-α-actinine en tropomyosine (sarcomeer dunne filament eiwit) immunofluorescentie bleek een kleuringspatroon met regelmatige periodiciteit in trabeculaire hartspiercellen consistent met volwassen myofibrils in deze cellen (Figuren 4A en 5A voor s-α-actinine; Figuur 4B voor tropomyosine). N-cadherine kleuring trabeculaire cardiomyocyten op E12.5 harten verzorgen colocaliseren met gebieden van intense s-α-actinine kleuring (figuur 5B - D en figuur 6A - C) eventueel voor tussengevoegde schijven. Incontrast aan trabeculair myocytes, s-α-actinine in de compacte zone was meer punctate dan lineair, en tropomyosine kleuring was diffuus plaats van lineair (Figuur 4A en 4B). Aldus kan sarcomeer assemblage later in compact voorkomen opzichte trabeculaire myocardium. Bovendien differentiële patronen van s-α-actinine en tropomyosine in de compacte zone suggereren dat s-α-actinine organiseert in puncta en onvolwassen Z-discs vroeg, terwijl tropomyosine opname in de dunne gloeidraad een later gebeurtenis myofibril samenstel kan zijn.

Figuur 7, Film 1 en Film 2 tonen typische resultaten van een PFA-vaste E12.5 embryonale hart. In deze voorbeelden werd een LifeAct-RFPruby transgeen embryo voor beeldvorming; de LifeAct-RFPruby transgen ¹⁹ etiketten draadvormige actine maar vereist PFA fixatie. Z-schijven gelabeld met s-α-actinine waren gemakkelijk te visualiseren in de meeste gebieden, maar de signaal-ruisverhouding Decre ased vergelijking met ingevroren hart secties (figuur 7A); Dit signaal was typerend voor s-α-actinine immunofluorescentie in PFA-gefixeerd weefsel, waarin epitopen kunnen worden gemaskeerd door eiwit cross-links. Figuur 7B toont co-visualisatie van draadvormige actine en immunolabeled s-α-actinine binnen myofibrils (pijlpunten) en filamenteuze actine binnen endocardiale cellen naast trabeculaire myocyten (pijlen). Drie-dimensionale beeldreconstructie onthulde aanvullende gegevens: individuele cardiomyocyten werden gemakkelijker onderscheiden, myofibrils binnen cardiomyocyten werden ongeveer parallel aan elkaar, maar individuele cardiomyocyten werden georiënteerd onder verschillende hoeken met elkaar (Figuur 7C en D, film 1 en film 2 ). De dichte benadering tussen endocardiale cellen cardiomyocyten werd beter gewaardeerd in de driedimensionale uitzichten.

">
Figuur 1. Cardiomyocyte sarcomeres, geïntercaleerd schijven, en costameres. De Z-disc verankert actine filamenten, terwijl de M-lijn verankert myosine vezels, die de actine filamenten overlappen. De sarcomeer bestaat uit een Z-disc - M lijn - Z-schijf unit. Meerdere sarcomeren in serie maken een myofibril. Het laterale uiteinde van het myofibril voegt in de transversale rand van de cardiomyocyten in een gespecialiseerde cel-cel junctionele structuur die de geïntercaleerde schijf. Perifere myofibrils aansluiten op de longitudinale cardiomyocyte plasmamembraan via costameres, die focale adhesies met de extracellulaire matrix tussen hartspiercellen vormen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

= Upload / 52644 / 52644fig2.jpg "/>
Figuur 2. s- α -actinin en β catenine immunofluorescentie op embryonale dag 16,5. Het hart werd uitgesneden, snap bevroren, cryosectioned, aceton gefixeerde, en immunostained behulp van (A) muis monoklonaal kloon EA53 antilichaam tegen s-α-actinine, die gelabeld cardiomyocyte Z-schijf en geïntercaleerd schijven, en (B) konijnen polycloncal antilichaam tegen de adherens knooppunt eiwit β-catenine. (C) Samengevoegd beelden tonen s-α-actinine en β catenine vlekken. (D) vergroot gebied van interesse van paneel C ; sterretjes merk veronderstelde geïntercaleerd schijven met co-lokalisatie van s-α-actinine en β catenine. Beelden werden verkregen uit het perifere linker ventriculaire wand of compact myocardium, de epicardiale laag linksboven panelen AC. Intensiteit histogramscherm range 460-1600 (uit of mogelijke 0-65535) voor zowel de s-α-actinine / 488 nm en β catenine / 561 nm laser kanalen. Schaalbalk 10 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3. s- α -actinin en β 1 integrine immunofluorescentie op embryonale dag 16,5. Het hart werd uitgesneden, snap bevroren, cryosectioned, aceton-vaste en immunostained behulp van (A) muis monoklonaal kloon EA53 antilichaam tegen s-α-actinine en (B) geiten polyklonaal antilichaam tegen het focale adhesie eiwit β1 integrine. (C) Samengevoegd beelden tonen β1 integrine in cardiomyocyten als niet-cardiomyocyt cellen. Opmerking zowel diffuse enpunctata β1 integrine-signaal in cardiomyocyten (D) vergroot gebied van interesse van paneel C. Opmerking punctate, periodieke β1 integrine kleuring (pijlen) met een frequentie zoals nabijgelegen s-α-actinine-kleuring in Z-schijven.; deze structuren kunnen costameres vertegenwoordigen. Beelden werden verkregen van de linker ventrikel compacte myocardium. Intensiteit histogramscherm range 460-1200 (van de mogelijke 0-65535) voor de s-α-actinine / 488 nm laser kanaal en 460-600 voor de β1 integrine / 561 nm laser kanaal. Schaalbalk 10 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4. s- α -actinin en tropomyosine immunofluorescentie op embryonale dag 12.5: myofibril organisatie in trabeculaire en compacte myocardium. Harten van littermate embryo's werden uitgesneden, snel bevroren, cryosectioned, aceton gefixeerd en immuungekleurd met (A) muizen monoklonaal antilichaam tegen kloon EA53 s-α-actinine en (B) muizen monoklonaal antilichaam tegen het myofibril dunne gloeidraad eiwit tropomyosine (Developmental Studies Hybridoma Bank CH1). Trabeculaire (pijlen) en compacte myocard (pijlpunten) zijn aangegeven. Opmerking lineaire s-α-actinine kleuring regelmatig periodiciteit in het trabeculaire myocardium, tegenover een reeks kleurpatronen waaronder puncta en lineaire kleuring in de compacte laag (A). Merk ook op lineaire tropomyosine kleuring met regelmatige periodiciteit in het trabeculaire myocard, maar meer diffuse kleuring in compacte myocard. Intensiteit histogramscherm range 460-1,400 (van de mogelijke 0-65535) voor de s-α-actinine kanaal en 460-1,000 voor de tropomyosine kanaal. Schaalbalk 10 micrometer."Https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/52644fig4large.jpg" target = "_ blank"> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 5. s- α -actinin en N-cadherine immunofluorescentie op embryonale dag 12.5:. Myofibrils en geïntercaleerd schijven in trabeculaire hartspiercellen Het hart werd uitgesneden, snap bevroren, cryosectioned, aceton-vaste en immunostained behulp van (A) muis monoklonaal kloon EA53 antilichaam tegen B-α-actinine en (B) konijnen polyklonaal antilichaam tegen het focale adhesie eiwit N-cadherin. 0,2 micrometer optische schijfjes werden verzameld als az stack, en z stapels werden afgevlakt om de beelden te genereren. (C) Samengevoegd afgevlakt stapels tonen zowel N-cadherine en s-α-actinine kleuring binnen trabeculaire hartspiercellen als well als kernen gelabeld met Hoechst kleurstof (D) vergroot gebied van interesse van paneel C.; sterretjes markeren geintercaleerde schijven met co-lokalisatie van s-α-actinine en N-cadherine. Intensiteit histogramscherm range 470-1,200 (van de mogelijke 0-65535) voor de Hoechst / 405 nm laser kanaal en 470-2,000 voor zowel de s-α-actinine / 488 nm en N-cadherine / 561 nm laser kanalen. Schaalbalk 10 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 6. Anti-muis IgG (H + L) monovalent Fab fragment blokkeert effectief de endogene muis IgG binding van anti-muis secundaire antilichamen. De E12.5 embryonale hart werd uitgesneden, snel ingevroren, cryosectioned, aceton gefixeerd en immunogekleurd. (AC) Secties werden geblokkeerd met 1x blokkerende buffer gevolgd door anti-muis IgG monovalente Fab fragment, blootgesteld aan monoklonaal kloon EA53 primair antilichaam tegen B-α-actinine en konijnen polyklonaal primair antilichaam tegen N-cadherin, gewassen en blootgesteld Alexa Fluor 488 anti-muis en Alexa Fluor 586 anti-konijn secundaire antilichamen. (A) Samengevoegd beeld met behulp van intensiteit histogramscherm range 480-2500 (van de mogelijke 0-65535). Sterretjes nota gebieden waar N-cadherine-signaal is beperkt tot het dwarse einde van trabeculair cardiomyocyten, die waarschijnlijk vertegenwoordigt ontluikende tussengevoegde schijven. (B) N-alleen-cadherine kanaal met histogram weergavebereik 480-2,500. (C) s-α -actinin-only kanaal met intensiteit histogramscherm range 480-2,500. (DG) Secties werden geblokkeerd met 1x blokkeringsbuffer alleen (geen anti-muis IgG monovalente Fab fragment blokkeren stap), blootgesteld aan konijnenpolyklonaalprimair antilichaam tegen N-cadherine (alleen niet monoklonaal primair antilichaam), gewassen en blootgesteld aan Alexa Fluor 488 anti-muis Alexa Fluor 586 anti-konijn secundaire antilichamen. (D) Samengevoegd beeld die histogram weergavebereik 480-2500. (E) N-only-cadherine kanaal met intensiteit histogramscherm range 480-2500. (F) kanaal met intensiteit histogramscherm range 480-2,500 s-α-alleen-actinine. (G) kanaal met behulp van s-α-alleen-actinine hooggevoelige histogram weergavebereik 480-530, die achtergrond detectie van endogene muis IgG toont in de afwezigheid van anti-muis IgG monovalente Fab fragment blokkeringsstap. (HK) Secties werden geblokkeerd met 1x blokkerende buffer gevolgd door anti-muis IgG eenwaardig Fab fragment, blootgesteld aan konijnen polyklonaal primair antilichaam tegen N-cadherine (geen monoklonaal primair antilichaam), gewassen en blootgesteld aan Alexa Fluor 488 anti-muis en Alexa Fluor 586 anti-konijn secundaire antilichamen. (H) Samengevoegd beeld met behulp van intensiteit histogramscherm range 480-2,500. (I) N-only-cadherine kanaal met intensiteit histogramscherm range 480-2,500. (J) s-α-actinin- alleen kanaal met behulp van de intensiteit histogramscherm range 480-2,500. (K) s-α-alleen-actinine kanaal met een hoge gevoeligheid intensiteit histogram range 480-530, die het gebrek aan achtergrond endogene muis IgG detectie toont wanneer de anti-muis IgG monovalente Fab fragment blokkeren stap wordt gebruikt. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 7. s- α -actinin en actine organisatie in trabeculaire cardiomyocytes op embryonale dag 12.5. De LifeAct-RFPruby transgene muis lijn werd gebruikt om draadvormige actine ¹⁹ visualiseren, terwijl de muis monoklonaal kloon EA53 antilichaam tegen s-α-actinine werd gebruikt om de Z-schijven en geïntercaleerd schijven te labelen. Embryo's werden PFA gefixeerd. 0,2 micrometer optische schijfjes werden verzameld als az stack (A) De afgevlakte z stack blijkt dat s-α-actinine kleuring was meer diffuus in PFA-gefixeerd weefsel dan in de snap-bevroren en aceton vaste rubrieken (figuren 2-5).. (B ) Flattened z stapel toont zowel draadvormige actine en s-α-actinine. Draadvormige actine fluorescentie gelokaliseerde tussen Z-schijven binnen myofibrils (pijlpunten). Filamenteuze actine fluorescentie werd waargenomen bij endocardiale cellen die het trabeculaire myocyten (pijlen) lijn. (C) Drie-dimensionale weergave van de trabeculaire cardiomyocyten, gezien vanaf de bovenkant van de stapel. (D) Drie-dimensionale weergave vanhet trabeculaire cardiomyocyten, gezien vanaf de onderkant van de stapel. Intensiteit histogramscherm range 470-900 (van de mogelijke 0-65535) voor zowel de 488 nm laser kanaal en voor de 561 nm laser kanaal A en B; weergave range 460-800 voor beide kanalen in C en D. Schaalbalk 10 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Film 1. 360 ° roterende 3D-weergave van s- α -actinin en actine organisatie in trabeculaire hartspiercellen op embryonale dag 12.5. Het beeld stapel uit figuur 6 werd teruggegeven in drie dimensies met behulp van de Image J 3D Viewer plugin binnen de Fiji-beeldanalyse programma. Intensiteit histogramscherm range 470-800 (van de mogelijke 0-65535) voor zowel de 488 nm en 561 nm laser kanalen.

Movie 2. Geselecteerde 3D ​​uitzicht s- α -actinin en actine organisatie in trabeculaire hartspiercellen op embryonale dag 12.5. Het beeld stapel uit figuur 6 werd teruggegeven in drie dimensies met behulp van de Image J 3D Viewer plugin binnen de Fiji-beeldanalyse programma. Kleine rotaties rond de x, y en z-assen bleek relatief uitgelijnd myofibrils binnen hartspiercellen maar slechte afstemming tussen de meeste hartspiercellen. Kleine rotaties toonde ook de nauwe onderlinge aanpassing van de endocardiale cellen ontbreekt s-α-actinine rond hartspiercellen. Intensiteit histogramscherm range 470-800 (van de mogelijke 0-65535) voor zowel de 488 nm en 561 nm laser kanalen.

Discussion

De optimale fixatie van het weefsel techniek en verdunning moet empirisch worden bepaald voor elk antilichaam. In onze handen, snap-bevriezen is superieur aan PFA fixatie enkele cardiomyocyten antigenen, zoals s-α-actinine, β-catenine, β1-integrine, tropomyosine, taline (niet getoond) en N-cadherine; Daarentegen PFA fixatie levert superieure resultaten voor focale adhesie kinase (niet getoond). Het eiwit crosslinks gevormd door PFA kan epitopen en beperken antilichaam binding te maskeren; antigen retrieval kan nodig zijn in dergelijke gevallen, en methoden voor het antigen retrieval kunnen op een andere ²⁰ worden gevonden. PFA concentratie of lengte van fixatie kan worden verlaagd tot epitoop maskering verminderen en optimale omstandigheden empirisch bepaald voor elk antilichaam en bij elk ontwikkelingsstadium. Passende negatieve controles moeten worden gebruikt bij het karakteriseren van een nieuw antilichaam of cardiale mutant, inclusief pre-immuun serum als het primaire antilichaam controle en een "no primair antilichaam" control. Gebruik van knockout muizen een goede negatieve controle maar vroege sterfte voorkomt het gebruik van vele genproducten bestudeerde.

Gebruik van adequate volumes aan experimentele en controle dia's volledig onder te dompelen in dezelfde immunofluorescentie blokkeren, antilichaam, en wassen oplossingen was belangrijk als zachte wiegen van dia's tijdens de incubatie om een ​​uniforme belichting van de secties om de oplossingen te garanderen was. Deze aanpak geminimaliseerd technische variabiliteit in kleuring tussen secties en dia's binnen een experiment. Wanneer de kosten beperkt het antilichaam oplossing volume, gebruik maken van een uitstrijkje pen om stroom van oplossingen beperken buiten het weefsel secties en dia's in een vochtige kamer te houden tijdens lange incubatie. Als een monoklonaal muis primair antilichaam - en dus een anti-muis secundair antilichaam - wordt gebruikt, wordt een tweede blokkerende stap endogene muis immunoglobulinen omvatten die noodzakelijk (stap 3.4) om niet-specifieke achtergrondsignaal te verlagen.

Gepaste microscopie en beeldverwerking technieken zijn cruciaal voor het verkrijgen van biologisch accurate informatie ^21. Het histogram toont de verdeling van pixels op elk intensiteitsniveau (0-65.535 niveaus beeld een 16-bit) voor elke kleur. Achtergrond, kan de helderheid en het contrast worden aangepast door het instellen van een intensiteit weergave bereik dat het histogram piek flankeert; zinvolle vergelijkingen tussen de condities te maken, moeten dezelfde instellingen tussen controle en experimentele omstandigheden worden gebruikt.

Dit protocol voorziet in een betrouwbare methode om cardiomyocyte rijping en ontwikkeling te analyseren in de moedertaal embryonale muis hart. Terwijl immunofluorescentie cardiomyocyt-eiwitten wordt vaak gebruikt om hartspiercellen tijdens de ontwikkeling markeren weinig studies met technieken die hoge-resolutie analyse van myofibril structuur en de opkomst geïntercaleerde schijven en costameres ^12-14,22,23 mogelijk. Deze techniek kan worden gebruikt voor in vivo beoordeling van mutaties die ontwikkelingsstoornissen hartafwijkingen veroorzaken, als een middel ter identificatie van veranderingen in cardiomyocyte rijping die licht kunnen werpen op de mechanismen van structurele afwijkingen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cryomold, Disposable Base Mold, 7x 7 mm	Richard-Allen Scientific	58949	This size not available from Fisher Scientific
Cryomold, Disposable Base Mold, 15 x 15 mm	Fisher Scientific	22-050-159	Also available from Richard-Allen Scientific, catalog number 58950
Tissue-Tek Optimal Cutting Temperature (OCT) medium 4583	VWR	25608-930
2-methyl butane	Sigma	M32631
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	T353-500	Use fresh 4% solution in 1x PBS, pH 7.2-7.4.
Sucrose	Sigma	S0389	Use 15% and 30% solutions in 1X PBS.
Disposable transfer pipette	Fisher Scientific	S30467-1
Superfrost Plus slides	Fisher Scientific	12-550-15	"Plus" indicates positively-charged coating and is critical for maintaining tissue adherence to the slide.
Acetone	Sigma	179124
Triton X-100	Sigma	X100
Western Blocking Agent	Roche	11921673001	Blocking buffer for immunofluorescence, when secondary antibodies are from different species. Dilute to 1x in PBS.
Tween 20	Sigma	P9416
Donkey Anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment	Jackson ImmunoResearch	715-007-003	Goat Anti-mouse IgG (H+L) also available. For blocking endogenous immunoglobulins.
Anti-s-α-actinin antibody	Sigma	A7811	Mouse monoclonal, clone EA53. Dilute 1:400 for snap-frozen/acetone-fixed sections, dilute 1:300 for PFA-fixed sections. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment.
Anti-βcatenin antibody	Cell Signaling	9587s	Rabbit polyclonal. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:400.
Anti-β1 integrin antibody	R&D	AF2405	Goat polyclonal. Dilute 1:200. Snap-frozen/acetone-fixed tissue staining is superior to PFA-fixed tissue.
Anti-tropomyosin antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa	CH1	Mouse monoclonal. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:200. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment.
Anti-N-cadherin antibody	Santa Cruz	sc-7939	Rabbit polyclonal. Dilute 1:200. Snap-frozen/acetone-fixed tissue staining is superior to PFA-fixed tissue.
Anti-talin antibody	Sigma	T3287	Mouse monoclonal, clone 8d4. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:200. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment.
Anti-phosphotyrosine 397 focal adhesion kinase antibody	Invitrogen	700255	Rabbit monoclonal antibody. Requires PFA fixation. Dilute 1:500.
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody	Life Technologies	A-21202
Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody	Life Technologies	A10042
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody	Life Technologies	A-11001
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Antibody	Life Technologies	A-11011
Hoechst 33342 dye	Life Technologies	H3570	Nuclear stain
Vectashield	Vector labs	H-1000
Coverslips	Fisher Scientific	12-548-5M
MLC 400B Monolithic Laser Combiner Laser box	Keysight (formerly Agilent)
Clara Interline CCD camera	Andor
Eclipse Ti inverted microscope	Nikon
CSU-X1 Spinning disk confocal scanner unit	Yokogawa
CFI Plan Apochromat 4X air objective	Nikon	Numerical aperture (NA) 0.2, Working distance (WD) 15.7 mm
CFI Plan Apochromat VC 60x oil immesion objective (MRD01602)	Nikon	NA 1.4, WD 0.13 mm
NIS Elements Imaging Software	Nikon	http://nikon.com/products/instruments/lineup/bioscience/img_soft/index.htm
Image analysis software	Fiji	http://fiji.sc/Fiji