$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
OPMERKING: Man C57BL / 6 muizen (5-7 weken oud) zijn van Charles River Laboratories International, Inc. (St-Constant, Quebec, Canada.) En gemanipuleerd volgens de protocollen door de CHU Sainte-Justine Animal Care Comité is goedgekeurd. Mouse bronchiale weefselexplantaten een goede bron van primaire bronchiale epitheelcellen onderzoeken van de pro-apoptotische effecten van LMPs op epitheelcellen. Dit protocol beschrijft de in vitro generatie van LMPs, alsmede een werkwijze voor het detecteren van apoptotische epitheelcellen op LMPs behandelde bronchiale weefselexplantaten. Het protocol bestaat uit 3 delen.
1. LMPs Productie en karakterisering
OPMERKING: Om besmetting te voorkomen, ervoor zorgen dat alle in dit experiment gebruikte materialen zijn steriel of geautoclaveerd. Voer alle stappen bij kamertemperatuur in een bioveiligheidskast onder steriele voorwaarde, tenzij anders aangegeven.
1.1) Stimulatie en verzamelen van parlementsleden9
- Ontdooi een portie van 10 miljoen CEM T-cellen in een 37 ° C waterbad. Verdun 10 ml voorverwarmd serumvrij medium hematopoietische zoals X-VIVO, in een 15 ml steriele buis en centrifugeer bij 200 gx 5 min. Zuig het supernatant en resuspendeer cellen in 5 ml voorverwarmde medium.
- Overdracht cellen in een T75 weefselkweekfles (voor suspensie cellen) met 15 ml voorverwarmd medium hematopoietische zoals X-VIVO en incubeer gedurende 4 dagen in een bevochtigde incubator bij 37 ° C met 5% CO2.
- Na 4 dagen, breng dan het kweekmedium en de cellen in een T175 weefselkweek kolf die 100 ml vers medium. Verder incuberen van de cellen gedurende 72 uur onder dezelfde omstandigheden totdat zij zijn gegroeid tot een dichtheid van 2 miljoen cellen / ml.
- Gelijkmatig verdeeld over vier cellen T175 kolven die elk 150 ml vers medium en verder celkweek tot cellen gekweekt (ongeveer 48 uur incubatie) tot een dichtheid van 2 miljoen / ml.
- Verzamel cellen van elke door centrifugatie bij 200 xg gedurende 5 minuten en resuspendeer 300 x 10 6 cellen in een nieuw T175 kolf met 150 ml vers medium tot 2 miljoen / ml celdichtheid handhaven.
- Voeg actinomycine D (opgelost in DMSO bij 2 mg / ml) aan het medium tot een eindconcentratie van 0,5 ug / ml en geïncubeerd gedurende 24 uur.
- Breng al het kweekmedium in 50 ml conische buizen en spin neer de cellen bij 750 g gedurende 5 min. Breng het supernatant in 50 ml conische buizen en centrifugeer bij 1500 xg gedurende 15 min tot grote cel fragmenten verwijderen.
- Breng de bovenstaande vloeistof in een fles van 250 ml en ultracentrifuge bij 12.000 xg gedurende 50 min. Verwijder het supernatant en het verzamelen van pellets.
- Wash LMPs verrijkte pellets met 40 ml steriele PBS in een 50 ml buis door centrifugatie bij 12.000 xg gedurende 50 min. Herhaal deze stap twee keer.
- Verzamel de laatste wasbeurt supernatant; het zal worden gebruikt als dragercontrole. Hang de LMPs pellets in 1ml PBS en overbrengen in een 1,5 ml steriele microbuisjes. Aliquot en bewaar geïsoleerd LMPs bij -80 ° C (meerdere gratis dooi-cycli te vermijden).
1.2) Karakterisering van de parlementsleden via FACS-analyse 4
- Bereid 2 monsters van annexine buffer, 1 met en de andere zonder CaCl2: Hepes 10 mM, NaCl 140 mm, plus of min 5 mM CaCl2.
- Filter annexine buffer en FACS stroming omhullingfluïdum met een 0,22 urn filter om deeltjes te verwijderen.
- Verdun 1 pl LMPs in 44 pi annexine buffer met 5 mM CaCl2 in een FACS buis. Maak een andere buis met 1 pl LMPs in 44 gl annexine buffer zonder CaCl2 (negatieve controle).
- Voeg 5 ul van annexinV-Cy5 in elke buis en meng goed. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Stop de reactie door het verdunnen van het mengsel met 400 ul FACS stroming sheath vloeistof in elke buis.
- Voeg 10 ul (200.000 kralen) van 7 micrometer tellen beads suspensie als interne standaard in elke buis een absolute telling te verkrijgen.
- Vestigen poorten van de relatieve grootte (FSC-H, PMT E00, log schaal) en relatieve granulariteit (SSC-H, PMT 325, log schaal) dot perceel aan de flowcytometer behulp-size gekalibreerde fluorescerende kralen van 1 micrometer (poort 1) en het tellen van kralen poort bij 7 micrometer (poort 2).
- Analyseer de LMPs monster op FSC-H / SSC-H plot met behulp van de gevestigde poorten en FL-4-kanaals voor annexine (PMT 765, log schaal) dot plot, door het verwerven van een signaal tot 20.000 tellen van kralen in poort 2 worden bereikt.
- Bepaal de positieve annexinV gebeurtenissen van LMPs in annexine buffer met CaCl2 en daarna aftrekken de gebeurtenissen van LMPs in annexine buffer zonder CaCl2 (negatieve controle).
- Bereken het absolute aantal MPs basis van de volgende vergelijking:
1.3) Bepaling van MP PProtein Concentratie (Bradford Assay)
- Bereid 5 seriële verdunningen van een standaard eiwit 1,25-20 ug / ml. Pipet 800 pi van elke standaard en monster-oplossing in een schone reageerbuis in tweevoud. Voeg 200 ul van Bradford kleurstofreagens aan elke buis. Meng goed, dan incuberen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Meet absorptie bij 595 nm. Bepaal de eiwitconcentratie van LMPs met de lineaire regressie van standaardcurve.
2. bronchiale weefselexplantaten en LMPs Behandeling
OPMERKING: Let vooral op de steriele werkomgeving, en aseptisch bereiden de oplossingen en medium gebruikt in volgende experimenten. Om de volledige genezing Medium bereiden, voeg 1 ml Tissue Healing Medium Supplementen met Serum (ontdooid op ijs) tot 100 ml Tissue Healing Medium en meng goed.
2.1) Voorbereiding van de bronchiale weefselexplantaten
- Voordat kweken, krassen 6 gebieden van 1 cm 2elk aan de rand van het oppervlak van elk 100 mm weefselkweekplaat met een scalpel. Coat elk gekrast 100 mm weefselkweekplaat met 2 ml van de kweekschaal bekledingsoplossing en incubeer de schotel in een bevochtigde CO2 incubator O / N bij 37 ° C. Vacuüm zuig het overtollige oplossing en vul de schaal met 15 ml Tissue Wassen Medium.
- Euthanaseren C57BL / 6-muizen (5-7 weken oud) van CO2 inhalatie volgens de protocollen van de dierlijke zorg ethische commissie goedgekeurd.
- Aseptisch ontleden longweefsel met scalpel, Dumont super fijne pincet, en chirurgische schaar. Verwijder voorzichtig parenchym en bloedvaten. Plaats longweefsel in ijskoud Tissue Wassen Medium voor transport naar het laboratorium, indien van toepassing.
- Verder ontleden bronchus ondergedompeld in de Tissue wasmedium en scheid de bronchus met een diameter van 1 tot 2,5 mm uit perifere longweefsel. Slice bronchiale weefsels in ~ 5 mm dik bronchiale ringen met een scalpel.
- Gebruik een scheppende beweging met de steriele gebogen microdissecting pincet te halen de bronchiale fragmenten en plaats ze op de krassen van de gerechten.
- Verwijder de Tissue Wassen Medium, en incubeer de fragmenten bij KT ~ 5 min om hen in staat stellen zich te houden aan de gerechten.
- Voeg 10 ml van volledige genezing Medium om elk gerecht en plaats ze in een gecontroleerde atmosfeer modulaire incubator kamer. Spoel de kamer met hoge O2 gasmengsel (70% O2, 25% N2 en 5% CO2). Plaats de kamer in een tafelmodel orbitale incubator en schud bij 37 ° C. Schud de kamer voor 24 uur bij 10 cycli per minuut om het medium te tussenpozen stroom over de fragmenten.
- Na 24 uur incubatie, observeert de weefselexplantaten onder een fase-contrast omgekeerde lichtmicroscoop. Selecteer bronchiale explants met complete, fijn haar beweging en levendige bronchusepitheel voor volgende LMPs behandeling.
2.2) LMPs Behandeling
- Bereid compleet groeimedium als volgt: dooi groeimedium supplementen met serum en fibroblast-remmer op ijs. Voeg 1 ml van het kweekmedium supplementen serum en 200 ui fibroblast remmer 100 ml groeimedium; meng goed. Verwarm het volledige groeimedium bij 37 ° C gedurende 10 min vóór gebruik.
- Verdun geïsoleerd LMPs in een nieuwe steriele Eppendorf buis met PBS tot een LMPs stock bereid in een concentratie van 800 ug / ml.
- Voeg 0,5 ml compleet groeimedium aan elk putje van een 12-well weefselkweek platen.
- Overdracht van de geselecteerde bronchiale explantaten met de gebogen microdissecting tang van het vorige protocol (paragraaf 2.1) aan elk putje van de weefselkweek plaat.
- Label de cultuur plaat op de juiste wijze te LMPs behandeling putten en controle putten identificeren. Voeg 25 ul LMPs voorraad in elkaar LMPs behandeling goed (voor een uiteindelijke concentratie van 40 ug / ml) en 25 pi controle over het voertuig (zie LMP en productie) aan de controleputjes.
- Verdere incubatie in een gecontroleerde atmosfeer modulaire incubator kamer bij 37 ° C onder zacht schudden.
- Na 24 uur, wassen explants 3 keer met PBS en ga verder met de volgende stap (4% paraformaldehyde [PFA] fixatie).
3. Histopathologisch onderzoek
3.1) Bereid de volgende oplossingen voordat u verder gaat naar de volgende stappen
- Bereid 1x PBS buffer door het mengen van 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,76 mM KH 2PO 4, pH 7,4.
- Ter voorbereiding 4% PFA, los 20 g PFA in 400 ml water, verwarmd tot 60 ° C onder roeren; voeg enkele druppels 10 M NaOH om de oplossing te verwijderen. Voeg vervolgens 1x PBS buffer en het volume tot 500 ml en de pH op 7,4 stellen. Filter en de hoeveelheid; bewaren bij -20 ° C.
- Bereid de volgende uitdroging of rehydratatie reagentia; 100%, 90%, 70%, 50% ethanol en xyleen.
e_step "> 3.2) Explantatie Fixatie en Tissue Sectie deparaffinisatie
- Plaats elk explantaat in een gemerkte microcentrifugebuis van 1,5 ml van 4% PFA en geïncubeerd O / N bij 4 ° C. Twee keer Spoel de explantaten met 1x PBS.
- Dehydrateer explantaten via een alcohol reeks (70% ethanol: 3 keer 30 minuten elk, 90% ethanol: 2 keer 30 minuten elk, 100% ethanol: 3 keer 30 minuten elk, vervolgens xyleen: 3 keer 20 min elk). Voer alle stappen bij RT in een zuurkast.
- Verankeren weefselexplantaten in paraffine bij 58 ° C in een oven. Bereid 5 pm dikke coupes met behulp van een rotatiemicrotoom.
- Drijven de secties in een 56 ° C waterbad, en monteer vervolgens de secties op het label histologische coupes. Plaats de objectglaasjes handmatige kleuring rekken en droog bij 65 ° C gedurende 1 uur. Laat de dia afkoelen bij kamertemperatuur.
- Dompel de rekken in 4 opeenvolgende vlek gerechten met xyleen gedurende 10 minuten elk om paraffine te verwijderen. Dompel het rekken in een ethanol serie xyleen te verwijderen 100%, daarna 95%, then 80%, daarna 70%, daarna 50% ethanol (5 min voor elke stap). Spoel de rekken met kraanwater gedurende 5 minuten om ethanol te verwijderen.
3.3) Hematoxyline en eosine (H & E) kleuring
- Blijven werken met de vaste weefsel secties; Plaats het rek in een kleuring schotel gevuld met Mayer's hematoxyline gedurende 15 min. Spoel het rek met leidingwater om Hematoxyline verwijderen gedurende 20 min.
- Plaats in gedestilleerd water gedurende 30 sec.Place in 95% ethanol gedurende 30 sec. Plaatsen in Eosine Y oplossing kleuring schotel voor 1 min. Dehydrateer door 2 verandering van 95% ethanol, 100% ethanol en xyleen gedurende 2 minuten elk.
- Voer een snelle controle onder een microscoop zodat overmaat eosine verwijderd. Leg 2 tot 3 druppels montage medium (Fisher SP15-100) op elke dia, dek af met een deksel glas.
3.4) In Situ Cell Death Detection: TUNEL Assay
- Voordat u begint, bereiden proteinase K werkende oplossing: 20 ug / ml in10 mM Tris / HCl, pH 7,4.
- Herhaal de stappen 1 tot 5 van paragraaf 3.2 (Explantatie fixatie en weefsel sectie deparaffinisatie). De glaasjes met gedeïoniseerd H2O Spoel
- Dompel de dia's met 1x PBS gedurende 10 min. Giet de overtollige PBS. Incubeer weefselcoupes gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met proteinase K werkoplossing. Spoeling glijdt tweemaal met 1x PBS.
- Voer de TUNEL assay zoals beschreven in de instructiehandleiding van celdood detectie kit. Monteer met behulp van montage medium, en dekglaasje handmatig met dekglaasjes.
- Analyseer monsters onder een lichtmicroscoop. Gebruik Image Pro 4.5 de apoptotische cellen in bruine kleur analyseren.