Het toepassen van stereotactische injectie techniek om genetische effecten op Animal Gedrag Studie

Summary

Stereotactische injectie van lentivirussen uiten cDNAs of shRNAs kan genexpressie moduleren in specifieke hersengebieden van muizen. Hier presenteren we een protocol om stereotactische injecties te combineren met gedragsproblemen taken, zoals het open veld Test (OFT) en de Gedwongen Swim Test (FST).

Abstract

Stereotactische injectie is een nuttige techniek om hoge titer lentivirussen leveren aan gerichte hersengebieden bij muizen. Lentivirussen kunnen hetzij overexpressie of knockdown genexpressie in een relatief geconcentreerde gebied zonder significante schade aan het hersenweefsel. Na het herstel, kan de geïnjecteerde muis worden getest op verschillende behavioral taken, zoals het open veld Test (OFT) en de Gedwongen Swim Test (FST). De OFT is ontworpen om de voortbeweging en de angstige fenotype bij muizen beoordelen door het meten van de hoeveelheid tijd die een muis doorbrengt in het midden van een nieuw open veld. Een angstig muis aanzienlijk minder tijd in het midden van het nieuwe veld in vergelijking met controles. De FST beoordeelt de anti-depressieve fenotype door het kwantificeren van de hoeveelheid tijd die de muizen onbeweeglijk doorbrengen indien opgelost in een emmer water. Een muis met een anti-depressieve fenotype zal aanzienlijk minder tijd immobiel vergelijking met controledieren brengen. Het doel van dit protocol is om de ster te gebruikeneotactic injectie van een lentivirus in combinatie met gedrags-tests om te beoordelen hoe genetische factoren moduleren dierlijk gedrag.

Introduction

De muis is op grote schaal gebruikt in neurobiologie omdat het gemakkelijk genetisch te manipuleren. Gene knockout technieken kunnen de onderzoekers te onderzoeken hoe elke genetische factor vormen muis gedrag. Bovendien is het cre-loxP systeem een waardevol instrument voor weefsel- en cel type- specifiek gen knockout muizen, die onderzoekers in staat stelt bestudering van genfunctie in verschillende weefsels. ¹ In de praktijk, expressiepatronen van cre promoters zijn moeilijk te beheersen , en tot nu toe veel gevestigde cre stuurprogramma's zijn niet regio-specifieke expressie bereikt. ^2,3

Alternatief stereotact....

Protocol

LET OP: Alle protocollen met dieren werden gevolgd in overeenstemming met het dier zorg richtlijnen van de Pennsylvania State University, IACUC # 44057

1. Lentivirus Production

NB: De dag voor transfectie, moet LentiX-293-cellen worden op 80% confluentie.

1. Spoel de cellen met DMEM net vóór transfectie en incuberen in 10 ml DMEM / 10% FBS met penicilline (100 IU / ml) en streptomycine (100 ug / ml) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
2. Verdun DNA en Polyethyleenimine (PEI) (1 mg / ml) in 1: 3 verhouding (1 ug DNA: 3 pl PEI) in 1 ml DMEM en vortex gedurende 1 minuut. De hoeveelheid DNA to....

Results

Accurate stereotactische injectie leunt zwaar op het instellen van de juiste coördinaten. De punt van de naald gebruikt om het virus te injecteren moeten rechtstreeks worden ingesteld op de kruising van bregma en de interaurale lijn (figuur 1). Het is nuttig om een ​​stereomicroscoop gebruiken om na te gaan of de naald correct is geplaatst. Bij het zoeken door de microscoop moet de naald worden geplaatst dat wanneer het virus werden geïnjecteerd, zou direct landen op de kruising van bregma en de i.......

Discussion

Succesvolle stereotactische injecties afhankelijk van drie factoren: het houden van de muis in leven, het instellen van het juiste nulpunt voor coördinaten (tip van de naald op de kruising van bregma en de interaurale lijn), en het instellen van de juiste diepte aan het nulpunt (tip van de naald alleen aanraken van de buitenzijde van het hersenweefsel). De levensvatbaarheid van de muizen belang. Chirurgie overleving kan worden geholpen door ervoor te zorgen dat de muis goed is verdoofd en krijgt voldoende pijnstillende........

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotactic Apparatus item 51725	Stoelting co.	51725
Quintessential stereotaxic pump	Stoelting co.	53311
Injection Styringe, 65 RN	Hamilton	7633-01
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796
PEI	Polysciences Inc.	23966
Scissors	Fine Surgical Tools	14084-08
Blunt end forceps	Fine Surgical Tools	11002-12
Needle holder	Fine Surgical Tools	12001-13
Drill	Ram Products Inc	Microtorque control box, Tech2000 handpiece	with pedal
Glass bead sterilizer	Inotech	IS-400
Absorbable sutures	Unify	M-K518r19	Absorbable, reverse cutting
Cotton swabs	VWR	89031-270
Heating pad	Gaymar	T-pump TP-500 PN11184-000
Artificial tears	Rugby	NDC 0536-6550-91
Disposable syringe	BD Syringe	309623
Cloth
Gloves	Ansell	Senseitouch #7823
Avertin or other anesthetic	see recipe citation
Ketoprofen or other analgesic	see veternarian
Tracking software	Noldus	Ethovision XT
Tracking Camera	Noldus	Media Recorder