Methodenartikel

Gebruik makend van de Antigen Capsid-Incorporation strategie voor de ontwikkeling van adenovirus serotype 5-Vectored Vaccin Approaches

DOI:

10.3791/52655

⸱

6 mei 2015

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 2Center for AIDS Research, University of Alabama at Birmingham

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol om een proof-of-principle bivalente adenovirus type 5 (Ad5) vector genereren Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 door gebruik te maken van de Antigen Capsid-Incorporation strategie. Deze vector werd aangetoond kwalitatieve conditie vertonen het vermogen om Ad5-positieve sera in vitro, en de antigeniteit en immunogeniteit ontsnappen naar de opgenomen antigenen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adenovirus serotype 5 (Ad5) is uitgebreid gemodificeerd transgen met traditionele methoden voor vaccinontwikkeling. De verminderde efficacies deze traditioneel gemodificeerde Ad5 vectoren in klinische trials kon hoofdzakelijk worden gecorreleerd met reeds bestaande immuniteit Ad5 (PEI) onder de meerderheid van de bevolking. To-Ad5 vectored vaccin ontwikkeling te bevorderen door het oplossen van de bezorgdheid van Ad5 PEI, heeft het innovatieve Antigeen Capsid-Incorporation strategie toegepast. Door verdienste van deze strategie, Ad5-vectored we eerst gebouwd de hexon shuttle plasmide HVR1-KWAS-HVR5-His 6 / pH5S door subkloneren het hypervariabele gebied (HVR) 1 van hexon in een eerder opgebouwd shuttle plasmide HVR5-His 6 / pH5S, die moest Zijn 6-tag opgenomen in het HVR5. Deze HVR1 DNA-fragment dat een HIV epitoop ELDKWAS gesynthetiseerd. HVR1-KWAS-HVR5-His 6 / pH5S was toen lineair en co-getransformeerd met gelineariseerde backbone plasmide pAd5 / ΔH5 (GL),homologe recombinatie. Deze gerecombineerde plasmide pAd5 / H5-HVR1-KWAS HVR5-6-His werd getransfecteerd in cellen om de virale vector Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 genereren. Deze vector werd gevalideerd kwalitatieve conditie wordt aangegeven door virale titer fysische (VP / ml), infectieuze titer (IP / ml) en bijbehorende VP / IP ratio. Zowel de HIV-epitoop en Zijn 6-tag waren oppervlak blootgestelde op de Ad5 capside, en behield epitoopspecifieke antigeniciteit van hun eigen land. Een neutralisatietest vermeld het vermogen van deze divalente vector neutralisatie omzeilen door Ad5-positieve sera in vitro. Muizen immunisatie toonden de vorming van sterke humorale immuniteit specifiek voor het HIV epitoop en His 6. Deze studie proof-of-principle suggereerde dat het protocol in verband met het antigeen capside-Incorporation haalbare strategie kan worden toegepast voor de productie van Ad5-gevectoriseerd vaccins modificeren andere capside eiwitten. Dit protocol kan zelfs worden ferdere aangepast voor het genereren van zeldzame adenovirus serotype-gevectoriseerd vaccin.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Human adenovirus (Ad) is een middelgrote, niet-omhulde virus met een icosahedraal nucleocapside met een dubbelstrengs DNA-genoom. Ad behoort tot de familie Adenoviridae, met een indeling in zeven groepen (A tot G). Elke groep bevat virus van verschillende serotypen. Waarvan adenovirus serotype 5 (Ad5) uit groep C is het meest uitgebreid bestudeerd en de meest gevraagde vectored benaderingen zoals gentherapie en vaccinatie.

De traditionele transgen strategie ontwikkeld en toegepast voor Ad5 modificaties die wordt gekenmerkt door de verplaatsing van het virus vroege genen met een gen-van-belang en de gerichte expressie van het gen-van-belang in een gastheer. Voorbeelden zijn de aanleg van pENV9 / Ad5hrΔE3 door vervanging vroege gen 3 (E3) met rev-gen van Simian Immunodeficiency Virus 1, de opbouw van AdCMVGag door vervanging vroege gen 1 (E1) met het gag-gen van Human ImmunodeficiencyVirus (HIV) 2 en de constructie van Ad lacZ door vervanging E1 met lacZ gen 3. De brede toepassing van de traditionele transgene strategie op Ad5 afhankelijk van de volgende voordelen: het brede scala van gastheren voor Ad5, het haalbare gentechniek op virus en virus vermeerdering, de grote accommodatie van vreemd gen insert en de veiligheid van Ad5 4,5. De verminderde efficacies van Ad5-gevectoriseerd klinische therapieën met behulp van deze strategie is een belangrijk knelpunt, die is toegewezen aan voornamelijk geassocieerd met Ad5 PEI, aangezien Ad5 zo voorkomt onder de meeste kinderen en volwassenen 4,6.

Om de belangrijkste bottleneck van Ad5 te overwinnen, het primaire doel is om een ​​alternatieve strategie te omzeilen Ad5 PEI ontwikkelen. Aangeboren immuniteit 7, adaptieve immuniteit zoals neutraliserende antilichamen (NAbs) 8-10 en CD8 + T cel responsen 10 tegen Ad5 is aangetoond dat contribute tot Ad5 PEI, met Ad5 NAbs verschijnen aan de dominante rol in de bijdragen spelen om Ad5 PEI 10,11. Bovendien Ad5 NAD doelepitopen in capside-eiwitten, waaronder de voornaamste eiwit hexon, fiber en penton basis. Waarvan, hexon is het belangrijkste doelwit van Ad5 NAbs 8,11-13. Gebaseerd op deze bevindingen, is een innovatieve Antigeen capside-Incorporation strategie ingevoerd. Deze nieuwe strategie benadrukt de vervanging of incorporatie van eiwitten-of-rente op Ad5 capsideproteïnen, die verschuift of maskeert de Ad5 neutraliserende epitopen, wat leidt tot de verminderde erkenning door de NAbs en efficiënte Ad5 vector administraties. Het is opmerkelijk dat deze strategie concurrerend omdat het kan ook helpen systemen wekken sterke humorale immuniteit en krachtige cellulaire immuniteit door direct presenteren antigenen-plaats aan het immuunsysteem 4,14,15. Op basis van deze strategie kan de moleculaire klonering en recombinante virale vector Ad rescue structureel verdeeldin vier hoofdstappen: (a) de bereiding van gen-plaats-fragment door een polymerase kettingreactie (PCR) of synthese; (B) het ligeren van het genfragment in een shuttle plasmide dat het fragment gen-plaats en homologe armen een adenovirus skelet bevat; (C) de homologe recombinatie door co-transformatie van de shuttle plasmide dat het gen-van-belang-fragment met de gelineariseerde plasmide backbone pAd5 / ΔH5 (AR) 16; (D) de transfectie van lineair recombinante adenovirale plasmide aan de recombinante Ad vector opgenomen met antigenen-of-interest redden.

Onze groep en enkele anderen hebben deze alternatieve Ad integratie strategie voor Ad vectored ontwikkeling van vaccins tegen verschillende besmettelijke ziekteverwekkers verlengd. We meldden het genereren van een recombinante Ad vector Ad-HVR1-LGS-His 6-V3 doordat een His-gemerkte HIV-1 antigen V3 in het HVR1 locale van Ad5 hexon (hexon5). Dit gegenereerde vector geactiveerd strong humorale immuunrespons specifiek voor de V3 epitoop 4. We meldden ook de ontwikkeling van Ad5 / HVR2-MPER-L15ΔE1 door het opnemen van HIV-1 membraanproximale ectodomain gebied (MPER) in de HVR2 locale van hexon5 2. Daarnaast heeft het team van Dr. Zhou de voordelen van deze Ad opneming strategie gebruikt om Ad serotype 3 (Ad3) gevectoriseerd vaccins ie. Ontwikkelt, de vorming van virale vector R1SP70A3 doordat een neutraliserende epitoop SP70 enterovirus 71 in het HVR1 van Ad3 hexon (hexon3). R1SP70A3 gegenereerde sterke NAbs en IFN-γ productie specifiek voor het epitoop SP70, die leiden tot het hoge percentage bescherming tegen Enterovirus 71 15 challenge.

Voor de toepassing van technische referentie, onze studie maakte gebruik van de kwalitatieve Antigeen Capsid-Incorporation strategie om zich te concentreren op het genereren van een divalent Ad5 vector Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 door het opnemen van een HIV-1-antigeen in HVR1 eenda Zijn tag in HVR5 van hexon5. De gegenereerde virale vector werd immunologisch onderzocht. Het antigeen capside-Incorporation strategie kan worden toegepast voor de ontwikkeling van Ad5-gevectoriseerd vaccinatie benaderingen tegen verschillende infectieziekten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De universiteit van Alabama in Birmingham Institutional Animal gebruik en onderhoud goedgekeurd het gebruik van muizen als hierin beschreven onder het goedgekeurde protocol nummer 101.109.272.

1. Genetische Constructie van een gewijzigd Plasmid pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 met de Antigen Capsid-Incorporation Strategy

  1. De bouw van de shuttle plasmide HVR1-KWAS-HVR5-His 6 / pH5S
    1. Bestel een plasmide dat het gesynthetiseerde DNA-sequentie HVR1-KWAS tussen de restrictie-enzymplaatsen Agel tot AccI van hexon5 gen.
    2. Digest 6 ug van het gesynthetiseerde fragment (HVR1-KWAS) met de enzymen Agel (6 eenheden) en AccI (6 eenheden) gedurende 3 uur bij 37 ° C. Scheid de verkregen fragment in een 2% agarosegel door elektroforese, en zuiver het fragment met DNA gel extractie kit volgens het protocol van de fabrikant.
    3. Op basis van de molaire verhouding van insertie tot vector van 3: 1, gebruik T4 DNA ligase en ligase bUffer tot 12 ng van het fragment (HVR1-KWAS) ligeren aan 100 ng van een eerder geconstrueerde shuttleplasmide HVR5 His-6 / pH5S 17 in een 10 pl volume bij kamertemperatuur gedurende 2 uur, via de plaatsen van Agel en Accl.
    4. Transformeren 1 pl van 10 ul van het ligatieproduct in 50 ui elektrocompetente DH5a cellen in een electroporator (bij 1800 V). Voeg 950 pl SOC medium om de getransformeerde DH5a-cellen en incubeer het mengsel gedurende 1 uur bij 37 ° C met 300 rpm. Spread 100-200 pl van de 1 ml mengsel op Luria-Bertani (LB) agar met kanamycine en geïncubeerd O / N bij 37 ° C.
      1. Om te screenen ~ 10 kolonies door PCR targeting het fragment HVR1-KWAS, meng de voorwaartse primer (TATGTGTGTCATGTATGCGT), reverse primer (GGAGGCCCACTTGTCCAGCTC) en een enkele DH5a kolonie in een PCR master mix oplossing (volgens het protocol van de fabrikant). Run monsters op een thermocycler door te verwijzen naar de handleiding die bij de PCR master mix oplossing.
      2. Gebruik de voorwaartse primer (TATGTGTGTCATGTATGCGT) om het fragment HVR1-KWAS sequentie in de klonen gescreend in de sectie 1.1.4.1.
  2. Constructie van het plasmide pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6
    1. Digest 6 ug HVR1-KWAS-HVR5 His-6 / pH5S met enzymen EcoRI (6 eenheden) en Pmel (6 eenheden) gedurende 3 uur bij 37 ° C, en zuiver het fragment dat homologe recombinatie armen en het dubbele gemodificeerde hexon5 gen, zoals in stap 1.1.2. Lineariseren de ruggengraat plasmide pAd5 / ΔH5 (GL) 16 met Swal.
    2. Co-transformatie 100 ng van het doelwit fragment van de shuttle plasmide en 100 ng van gelineariseerde pAd5 / ΔH5 (GL) backbone in 50 ui elektrocompetente BJ5183 cellen voor de homologe recombinatie in een electroporator (bij 1800 V). Voeg 950 pl SOC medium om de getransformeerde cellen en incubeer het mengsel gedurende 1 uur bij 37 ° C, 300 rpm. Verdeel 100-200 gl van het mengsel 1 mlop LB-agar met kanamycine (uiteindelijke 50 ug / ml) voor O / N incubatie bij 37 ° C.
      1. Extra ~ 10 kleine kolonies in 3 ml vloeibare LB met kanamycine (uiteindelijke 50 ug / ml) voor O / N incubatie bij een schudapparaat (250 rpm, 37 ° C). Uittreksel plasmiden uit de kweek. Met PCR analyse om de 10 kolonies te screenen door het richten fragment HVR1-KWAS, zoals geïllustreerd in stap 1.1.4.1.
      2. Om hetzelfde kolonies door PCR-analyse te richten op de pIX fragment van de ruggengraat genoom te screenen, meng de voorwaartse primer (AGCTGTTGGATCTGCGCCAGCAGGTT), reverse primer (CCAAACAGAGTCTGGTTTTTTATTTAT) en een enkele BJ5183 kolonie in een PCR master mix oplossing (volgens het protocol van de fabrikant). Run monsters op een thermocycler door te verwijzen naar de handleiding die bij de PCR master mix oplossing.
      3. Wijzen de PCR dubbel-positieve kolonies als pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6.
    3. Transformeer 100 ng van het plasmide pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 inDH5a cellen zoals geïllustreerd in stap 1.1.4.
      1. Met PCR-analyse voor het screenen ~ 10 kolonies doelwit het fragment HVR1-KWAS, zoals geïllustreerd in stap 1.1.4.1.
      2. Met PCR-analyse met dezelfde kolonies te screenen door zich te richten de pIX fragment van de ruggengraat genoom, zoals geïllustreerd in stap 1.2.2.2.
      3. Gebruik de voorwaartse primer (TATGTGTGTCATGTATGCGT) om het fragment HVR1-KWAS sequentie in pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6.

2. Voorbereiding van de Modified Ad5 virale vector Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6

  1. Vormen de volledige medium door toevoeging FBS (uiteindelijke 10%), 100X Niet-essentiële aminozuren (0,1 mM uiteindelijke), 200 mM L-glutamine (2 mM final) en penicilline / streptomycine-oplossing (uiteindelijke 1%) in DMEM met hoog glucosegehalte . Handhaaf humane embryonale niercellen (HEK293) cellen in compleet medium in een incubator (37 ° C en 5% CO2 onder 85% bevochtigde omstandigheden).
  2. Redding van virale vector Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6
    1. Seed 3,0 x 10 6 van de HEK293 cellen in een T-25 kolf met 5 ml compleet medium en kweken O / N een monolaag met 80% confluentie bereiken.
    2. Lineariseren 15 ug pAd5 / H5-HVR1-KWAS HVR5-6-His in een 100 pl volume met restrictie-enzym Pacl (15 eenheden) bij 37 ° C gedurende 3 uur.
      1. Uittreksel gelineariseerd pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 door het centrifugeren het reactiemengsel twee keer (10.000 xg gedurende 1 min) met een gelijk volume fenol: chloroform: isoamylalcohol (ratio van 25: 24: 1) in een zuurkast en door opeenvolgende centrifugatie (10.000 x g gedurende 10 min) met een gemengde oplossing (300 ul 100% ethanol en 10 pl natriumacetaat) en 700 pl 70% ethanol. Gooi supernatant in elk stap van centrifugale bewerking.
    3. Resuspendeer het gezuiverde plasmide ~ 40 pi gedestilleerd water of Tris-EDTA (TE) -buffer. Kwantificeren het plasmide-DNA door de optische DEnsity (OD) bij 260 nm.
    4. Transfecteren 3 ug gelineariseerde plasmide commerciële liposomaal transfectiereagens in de T-25 kolf, volgens de handleiding van de fabrikant. Verander het transfectiemedium met compleet medium op 6 uur na transfectie en de daaropvolgende incubatie in de incubator. Handhaaf getransfecteerde cellen door het vervangen van compleet medium elke 2-3 dagen, tot individuele virale plaques vormen.
    5. Wanneer plaques volledig cytopathisch effect (CPE), schrapen de resterende cellen van de kolf in een steriele kap en oogsten cellysaat medium door centrifugeren bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Suspendeer de celpellet in ~ 1 ml medium dat 2% FBS en cellen doorbreken door vriesdrogen viermaal. Verzamel de bovenstaande vloeistof bevattende geredde virus na centrifugeren lysaat bij 10.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
  3. Grootschalige verspreiding van de virale vector Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6
    1. Propageren the virus in een T-75 kolf met HEK293-cellen in de steriele kap door het infecteren met 1/3 tot volledige lysaat van de T-25 kolf. Laat volledige CPE om binnen 2-3 dagen in de incubator. Oogst de lysaat supernatant zoals in stap 2.2.5.
    2. Propageren virus in 1-3 T-175 flessen in de steriele kap door het infecteren met 1/2 tot volledige lysaat van de T-75 kolf, afhankelijk van de virus geluidsoverdracht. Laat volledige CPE om binnen twee tot drie dagen in de incubator. Oogst de lysaat supernatant zoals in stap 2.2.5.
    3. Propageren virus in een twaalftal T-175 flessen in de steriele kap door het infecteren met 1/2 tot volledige lysaat van de vorige T-175 kolf (s). Bepaal de hoeveelheid kolf taalgebruiksgebaseerde het virus geluidsoverdracht en de hoeveelheid virus in nood. Oogst de lysaat supernatant zoals in stap 2.2.5 wanneer volledige CPE binnen twee tot drie dagen in de incubator.
  4. Purificatie van Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 door cesium chloride
    1. Bereid twee dichtheden van CsCl oplossing in 5 mM HEPES: 1,33 g / ml en 1,45 g / ml en het vermijden van contact met CsCl.
    2. Lading 4 ml CsCl (1,33 g / ml) in een steriele ultracentrifuge buis en voorzichtig laad 4 ml CsCl (1,45 g / ml) tegen bodem van de buis. Lading 4 ml lysaat supernatant langzaam bovenop de gradiënten in de steriele kap.
    3. Centrifugeer de buis bij 110.000 xg gedurende 3 uur bij 4 ° C tot de mature / onderste virusband gescheiden van de defecte / hogere virusband. Verzamel de onderste band met behulp van een 3 ml spuit gewapend met een 33 G naald en verdun de band met 5 mM HEPES tot een volume 4 ml in de steriele kap.
    4. Laad een andere buis met twee dichtheden van CsCl oplossingen en verdunde band virus zoals beschreven in stap 2.4.2. Centrifugeer de buis bij 110.000 xg O / N bij 4 ° C. Verzamel de virale band zoals beschreven in stap 2.4.3.
    5. Injecteer de verzamelde virus oplossing in een dialysis cassette door een 3 ml spuit gewapend met een 33 G naald in de steriele kap.
    6. Plaats de cassette in 700 ml 1 x dialysebuffer (1 L recept: 100 ml 10 x PBS, 100 ml 100% glycerol en 800 ml gedestilleerd water, filter de buffer door een 0,22 urn filter) en vervang de dialyse buffer elke 3 uur gedurende 4 keer. Zuigen uit gedialyseerde virus oplossing met genaaide spuit.

3. Validatie van de geredde virale vector

  1. Virale vector Titraties
    1. Voor de virus titer fysische, zowel verdund virus en dialyse buffer (achtergrondcontrole) op 1: 10 en 1: 20 virus in lysisbuffer (10% SDS in Tris-EDTA) in buisjes en incubeer alle buizen bij 56 ° C gedurende 10 min.
    2. Zet op een BioPhotometer en stel de wijze van absorptie bij OD 260 nm. Gebruik de verdunde dialyse buffer (1: 10) naar de achtergrond signaal evenwicht door te klikken op de "blanco" bottom. Type "10 + 90" in de BioPhotometer screen, en leest het signaal van de verdunde virusoplossing (1: 10).
    3. Lees het signaal van de verdunde virusoplossing (1: 20) volgens de werkwijze in stap 3.1.2, maar typ "5 + 95" in het BioPhotometer scherm. Vermenigvuldig de twee virus uitlezing getallen door 1.1x10 12 en bereken het gemiddelde titer een eenheid VP / ml, gebaseerd op de twee individuele titers van de twee verdunningen.
    4. Voor het infectieuze virus titer (IP / ml), met de Karber statistische TCID50 werkwijze 14 voor de infectie diepte op HEK293 cellen te bepalen op 10 dagen na infectie (dpi)
  2. Evaluatie van antigene blootstelling weergave op de virale vector
    1. Coat de virale vector in een ELISA plaat en gaan met de overige stappen in een standaard ELISA-werkwijze 14. Gebruik humane anti-gp41 (2F5) monoklonaal antilichaam (mAb) en muis anti-His tag mAb voor detectie van overeenkomstige opgenomen antigenen 14.
    2. Het oplossen van de virale vector in een denatured eiwit gel elektroforese (SDS-PAGE), waarna de rest van de stappen in een standaard Western blot-werkwijze 14. Gebruik humane anti-gp41 (2F5) monoklonaal antilichaam (mAb) en muis anti-His tag mAb voor detectie van overeenkomstige opgenomen antigenen 14.
  3. In vitro evaluatie van de vector op het vermogen om Ad5-positve sera omzeilen
    1. Handhaaf HeLa-cellen in compleet medium in de incubator (37 ° C en 5% CO 2 onder 85% bevochtigde omstandigheden). Vormen de volledige medium door toevoeging FBS (uiteindelijke 10%), 200 mM L-glutamine (2 mM final) en penicilline / streptomycine-oplossing (uiteindelijke 1%) in Minimum Essential Medium Eagle (MEME).
    2. Seed HeLa-cellen in 6-well platen met 1x10 6 cellen / putje en incubeer de platen in de incubator (37 ° C en 5% CO 2 onder 85% bevochtigde omstandigheden) gedurende 2 uur. Incubeer Ad5-positieve sera (0,1 ul of 0 pi) met 5 IP / cel van virale vector (Ad5 of Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6) in de incubator gedurende 1 uur vóór het toevoegen van het mengsel op de 6-well platen met cellen.
    3. Op 24 uur na infectie (HPI), spoelen cellen eenmaal met PBS en lyseren cellen in 0,5 ml lysis buffer. Centrifugeer bij 15.000 xg gedurende 5 minuten en verzamel de supernatant. Meng 20 ui van het supernatant met 100 ui luciferase substraat voor luciferase signaallees-, omdat virussen bevatten het luciferasegen.

4. Immunologische Evaluatie van de geredde virale vector

  1. Bereid twee immunisatie groepen: Ad5 en Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6.
    1. Injecteer muizen (n = 8 / groep) intramusculair met virussen op 1x10 10 VP / muis, in een homoloog "prime-boost" immunisatieregime, met een interval van 2 weken.
    2. Op 2 weken na elke injectie, bloeden muizen zonder verdoving door wang bloeden met dierlijke lancetten (5 mm tip lengte) aanbloed te verzamelen in 1,5 ml buizen.
  2. Meng het bloed in de buizen door het omkeren en neer, en incuberen van het bloed bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Spin de buizen bij 10.000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en overdracht sera (bovenlaag) nieuwe 1,5 ml buizen.
    1. Draai de nieuwe buizen bij 10.000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en overdracht sera van nieuw gemarkeerde 1,5 ml buizen voor opslag bij -80 ° C.
  3. Evaluatie van antigeenspecifieke humorale immuniteit-sera gebaseerde ELISA
    1. Verdunnen Zijn peptide (voorraad bij 1 mM) en HIV-1 peptide (voorraad bij 1 mM) afzonderlijk in 100.
    2. mM carbonaatbuffer (pH 9,5) aan het peptide coatingconcentratie bereiken bij 10 uM. Coat de ELISA-platen met verdunde peptiden afzonderlijk door toevoeging van 100 pl per putje en het incuberen van de platen O / N bij 4 ° C.
    3. Was de platen met PBST viermaal met 200 gl / putje en block 1 uur in 5% BSA in PBST. Breng muizensera de platen bij 1: 100 verdunning in de blokkerende buffer, 100 ul / putje. Incubeer 2 uur incubatie bij KT.
    4. Was de platen met PBST vier keer. Blokkeer de platen incuberen bij kamertemperatuur gedurende 30 min in blokkerende buffer bij 100 pl / well.
    5. Breng geit anti-muis IgG-HRP (1: 5000 in blokkerende buffer) en 100 gl / putje van zowel de platen bekleed met Zijn peptide en HIV-1 peptide afzonderlijk. Incubeer 2 uur bij KT. Was de platen met PBST.
    6. Lees de platen bij OD450 nm na incubatie met HRP-substraat gedurende 30 min.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het antigeen capside-Incorporation strategie (figuur 1A) werd gebruikt om de tweewaardige Ad5 virale vector Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 genereren. Ten eerste, de shuttle plasmide HVR1-KWAS-HVR5-His 6 / pH5S werd geconstrueerd door subklonering HVR1-KWAS fragment in de vorige geconstrueerde shuttle plasmide HVR5-His 6 / pH5S 17. Ten tweede werd het plasmide pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 14 werd geconstrueerd door een homologe recombinat...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De toepassing van de traditionele transgen strategie Ad5 modificatie voor de ontwikkeling van vaccins is afgenomen voornamelijk door de bottleneck in verband met de Ad5 PEI 4,6. Dit knelpunt kan gedeeltelijk worden verminderd door toepassing van de alternatieve Antigeen Capsid-Incorporation strategie (figuur 1A), aangezien deze strategie neutralisatie kan omzeilen door Ad5 NAbs door het vervangen van neutraliserende epitopen van Ad5 met antigenen-of-interest, en het genereren van robuuste imm...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd mede ondersteund door de National Institutes of Health verleent 5T32AI7493-20 en 5R01AI089337-03. De financiers hadden geen rol in de onderzoeksopzet, het verzamelen en analyseren van gegevens, het besluit te publiceren, of de bereiding van het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1x DPBSThermo ScientificSH30256.01voor celsplitsing 
10x DPBSThermo ScientificSH30378.02voor dialyse buffer voorbereiding
glycerolSIGMAG5516-1Lvoor dialyse buffer voorbereiding
SDSBIO-RAD161-0301voor virus lysis buffer voorbereiding
Fetal Bovine Serum (FBS)Thermo ScientificSH30910.03component van kweekmedium
100x Non-Essential Amino Acids Thermo ScientificSH30238.01component van kweekmedium
200 mM L-glutamineCellgro25-005-CIcomponent van kweekmedium
penicillin/streptomycin solution Cellgro30-002-CIcomponent van kweekmedium
DMEM met hoge glucoseThermo ScientificSH30081.01voor HEK293 celkweek
Minimum Essential Medium EagleSIGMAM5650voor HeLa celkweek
fenol:chloroform:isoamyl alcohol SIGMAP3803-100MLvoor grote DNA zuivering
cesium chloride Research Products International Corp.C68050voor virus zuivering
HEPESCellgro25-060-CIvoor CsCl oplossing voorbereiding
HEK293ATCC51-0036voor virus redding en opschaling
HeLaATCCCCL-2voor neutralisatie test
T-25 flaconThermo Scientific156367voor celkweek 
T-75 flaconCORNING430641voor celkweek 
T-175 flaconThermo Scientific159910voor celkweek 
UltracentrifugeBECKMANNAvoor virus zuivering
Ultracentrifuge buisBECKMAN344059voor virus zuivering
dialyse cassette Thermo Scientific66380voor virus dialyse
ELISA plaatThermo Scientific442404voor ELISA
human anti-gp41 (2F5) mAbNIH AIDS Reagent Program1475voor immunologische tests
muis anti-His tag mAbGenScriptA00186voor immunologische tests
SOC mediumCORNING46-003-CRvoor transformatie
PCR master mix oplossingQIAGEN201445voor PCR
Dier lancet (puntlengte bij 5 mm)MEDIpointvoor muizen bloeden 
BiofotometerEppendorfvoor virus fysische titer titratie

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cheng, S. M., et al. Coexpression of the simian immunodeficiency virus Env and Rev proteins by a recombinant human adenovirus host range mutant. Journal of virology. 66, 6721-6727 (1992).
  2. Matthews, Q. L., et al. HIV antigen incorporation within adenovirus hexon hypervariable 2 for a novel HIV vaccine approach. PloS one. 5, e11815(2010).
  3. DeMatteo, R. P., et al. Long-lasting adenovirus transgene expression in mice through neonatal intrathymic tolerance induction without the use of immunosuppression. Journal of virology. 71, 5330-5335 (1997).
  4. Gu, L., et al. A recombinant adenovirus-based vector elicits a specific humoral immune response against the V3 loop of HIV-1 gp120 in mice through the 'Antigen Capsid-Incorporation' strategy. Virology journal. 11, 112(2014).
  5. Matthews, Q. L., Krendelchtchikov, A. L. G., Li, Z. C. Viral Vectors for Vaccine Development. INTECH. , (2013).
  6. Tang, D. C., Zhang, J., Toro, H., Shi, Z., Van Kampen, K. R. Adenovirus as a carrier for the development of influenza virus-free avian influenza vaccines. Expert review of vaccines. 8, 469-481 (2009).
  7. Flatt, J. W., Kim, R., Smith, J. G., Nemerow, G. R., Stewart, P. L. An intrinsically disordered region of the adenovirus capsid is implicated in neutralization by human alpha defensin 5. PloS one. 8, e61571(2013).
  8. Bradley, R. R., Lynch, D. M., Iampietro, M. J., Borducchi, E. N., Barouch, D. H. Adenovirus serotype 5 neutralizing antibodies target both hexon and fiber following vaccination and natural infection. Journal of virology. 86, 625-629 (2012).
  9. Zaiss, A. K., Machado, H. B., Herschman, H. R. The influence of innate and pre-existing immunity on adenovirus therapy. Journal of cellular biochemistry. 108, 778-790 (2009).
  10. Sumida, S. M., et al. Neutralizing antibodies and CD8+ T lymphocytes both contribute to immunity to adenovirus serotype 5 vaccine vectors. Journal of virology. 78, 2666-2673 (2004).
  11. Sumida, S. M., et al. Neutralizing antibodies to adenovirus serotype 5 vaccine vectors are directed primarily against the adenovirus hexon protein. Journal of immunology. 174, 7179-7185 (2005).
  12. Bradley, R. R., et al. Adenovirus serotype 5-specific neutralizing antibodies target multiple hexon hypervariable regions. Journal of virology. 86, 1267-1272 (2012).
  13. Gahery-Segard, H., et al. Immune response to recombinant capsid proteins of adenovirus in humans: antifiber and anti-penton base antibodies have a synergistic effect on neutralizing activity. Journal of virology. 72, 2388-2397 (1998).
  14. Gu, L., et al. Using multivalent adenoviral vectors for HIV vaccination. PloS one. 8, e60347(2013).
  15. Tian, X., et al. Protection against enterovirus 71 with neutralizing epitope incorporation within adenovirus type 3 hexon. PloS one. 7, e41381(2012).
  16. Wu, H., et al. Construction and characterization of adenovirus serotype 5 packaged by serotype 3 hexon. Journal of virology. 76, 12775-12782 (2002).
  17. Wu, H., et al. Identification of sites in adenovirus hexon for foreign peptide incorporation. Journal of virology. 79, 3382-3390 (2005).
  18. Qiu, H., et al. Serotype-specific neutralizing antibody epitopes of human adenovirus type 3 (HAdV-3) and HAdV-7 reside in multiple hexon hypervariable regions. Journal of. 86, 7964-7975 (2012).
  19. Parker, C. E., et al. Fine definition of the epitope on the gp41 glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1 for the neutralizing monoclonal antibody 2F5. Journal of virology. 75, 10906-10911 (2001).
  20. Farrow, A. L., et al. Immunization with Hexon Modified Adenoviral Vectors Integrated with gp83 Epitope Provides Protection against Trypanosoma cruzi Infection. PLoS neglected tropical diseases. 8, e3089(2014).
  21. Krause, A., et al. Epitopes expressed in different adenovirus capsid proteins induce different levels of epitope-specific immunity. Journal of virology. 80, 5523-5530 (2006).
  22. Omori, N., et al. Modification of a fiber protein in an adenovirus vector improves in vitro gene transfer efficiency to the mouse microglial cell line. Neuroscience letters. 324, 145-148 (2002).
  23. Dmitriev, I. P., Kashentseva, E. A., Curiel, D. T. Engineering of adenovirus vectors containing heterologous peptide sequences in the C terminus of capsid protein IX. Journal of virology. 76, 6893-6899 (2002).
  24. Xue, C., et al. Construction and characterization of a recombinant human adenovirus type 3 vector containing two foreign neutralizing epitopes in hexon. Virus research. 183, 67-74 (2014).
  25. Tian, X., et al. Construction and characterization of human adenovirus serotype 3 packaged by serotype 7 hexon. Virus research. 160, 214-220 (2011).
  26. Kim, J. W., et al. An adenovirus vector incorporating carbohydrate binding domains utilizes glycans for gene transfer. PloS one. 8, e55533(2013).
  27. Vasconcelos, J. R., et al. Pathogen-induced proapoptotic phenotype and high CD95 (Fas) expression accompany a suboptimal CD8+ T-cell response: reversal by adenoviral vaccine. PLoS pathogens. 8, e1002699(2012).
  28. Matthews, Q. L., et al. Genetic incorporation of a herpes simplex virus type 1 thymidine kinase and firefly luciferase fusion into the adenovirus protein IX for functional display on the virion. Molecular imaging. 5, 510-519 (2006).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Constructie van virale vectorenplasmidestransportsysteemhomologe recombinatieanalyse van virale titerneutralisatieassayHIV epitooppresentatieincorporatie van His6 tagcesiumchloridezuivering

Gerelateerde artikelen