Dit protocol beschrijft repetitieve hypoxische preconditie, of korte blootstellingen aan systemische hypoxie die infarctvolumes en bloed-hersenbarrière-storingen verminderen na een voorbijgaande occlusie van de middelste hersenslagader bij muizen. Het beschrijft ook dubbele kwantificering van infarctvolume en bloed-hersenbarrière-storing na een beroerte om de werkzaamheid van neurovasculaire bescherming te beoordelen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Kwantificering van Neurovasculaire Protection Na Repetitive Hypoxische Voorconditionering en Transient midden cerebrale slagader Occlusie in Muizen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Experimentele diermodellen van een beroerte zijn van onschatbare waarde tools voor het begrijpen van een beroerte pathologie en het ontwikkelen van meer effectieve behandeling strategieën. Een 2 week protocol voor repetitieve hypoxische preconditionering (RHP) induceert langdurige bescherming tegen het centrale zenuwstelsel (CNS) letsel in een muismodel van focale ischemische beroerte. RHP bestaat uit 9 stochastische blootstelling aan hypoxie die variëren in zowel duur (2 of 4 uur) en de intensiteit (8% en 11% O2). RHP vermindert infarct volumes bloed-hersen barrière (BBB) verstoring, en de post-stroke ontstekingsreactie weken na de laatste blootstelling aan hypoxie suggereert een langdurige inductie van een endogene CNS-beschermende fenotype. De methode voor de dubbele kwantificering van infarct volume BBB verstoring is doeltreffend worden geëvalueerd neurovasculaire bescherming bij muizen met RHP of andere putatieve neuroprotectieve. Volwassen mannelijke Swiss Webster muizen werden geconditioneerd door RHP of duur equivalent blootstelling aan 21% O (dwz kamer lucht). Een 60 min voorbijgaande midden cerebrale slagader occlusie (tMCAo) werd geïnduceerd 2 weken na de laatste hypoxische blootstelling. Zowel de occlusie en reperfusie werden bevestigd door transcraniële laser Doppler flowmetry. Tweeëntwintig uur na reperfusie, Evans Blue (EB) werd intraveneus toegediend via een injectie in de staartader. 2 uur later werden de dieren opgeofferd door een overdosis isofluraan en hersencoupes werden gekleurd met 2,3,5- trifenyltetrazoliumchloride (TTC). Infarcten volumes werden vervolgens gekwantificeerd. Vervolgens EB geëxtraheerd uit het weefsel dan 48 uur om BBB storing te bepalen na tMCAo. Samengevat, RHP is een eenvoudig protocol dat kan worden gerepliceerd, met minimale kosten, langdurige bescherming tegen endogeen neurovasculaire beroerte letsel bij de muis, de translationele potentieel voor andere CNS-gebaseerde en systemische pro-inflammatoire ziektetoestanden.
Inleiding
Aangezien de voornaamste oorzaak van volwassen gehandicapten en de vierde doodsoorzaak, beroerte is één van de meest slopende ziekten tegenover de volwassen bevolking van de Verenigde Staten. 1 Diermodellen van een beroerte zorgen voor experimenteel onderzoek van nieuwe methoden ter vermindering van ischemische schade en het verbeteren van post-stroke herstel. Een roman avenue voor dergelijke translationeel onderzoek is preconditionering. Voorbehandeling het opzettelijk gebruik van een niet schadelijk stimulus om de schade op een volgende, en ernstiger letsel. 2 hypoxische preconditionering is aangetoond pleiotrope veranderingen in de hersenen d....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
NB: Dit protocol werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) op UT Southwestern Medical Center, dat zich aan de National Institutes for Health (NIH) beleid voor experimentele gebruik van dieren.
1. Repetitieve Hypoxische Voorconditionering
- Aangepast ontwerp vier flowmeters gas toezichthouders en hechten aan de standaard 15 L inductie kamers met PVC buizen samengeperst gas toestaan van de zuurstof (O 2) tanks te stromen in de kamers via een inlaatpoort. Zie apparatuur en materialen voor meer informatie over het aangepaste ontwerp.
- Verdeel muizen in 2 groepen: Repetitive Hyp....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Deze studie omvatte 25 mannelijke Swiss Webster muizen die 10 weken oud waren bij aanvang van randomisatie tot RHP (n = 10) of 21% O 2 (n = 15) groepen. Twee weken na de laatste RHP blootstelling werden chirurgische procedures uitgevoerd met groepen blind en vorkheftruck tussen dag. Na tMCAo, 1 muis stierf tijdens postoperatieve herstel en 1 muis werd uit het onderzoek uitgesloten omdat het niet voldeed aan de reperfusie CBF criterium. Beide uitgesloten muizen werden van de 21% O 2-groep. Overeenko.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Een enkele blootstelling aan systemische hypoxie (dat wil zeggen, 2 uur van 11% O 2) bij muizen "tijdelijk" beschermt de hersenen tegen tMCAo, 29 betekent dat de epigenetische antwoord op de hypoxische preconditionering uitdaging is de korte levensduur, en de basislijn fenotype wordt hersteld binnen dagen. Repetitieve presentaties van de hypoxische preconditionering stimulus dramatisch verlengen van de duur van de neuroprotectieve fenotype. 6 Vele studies hebben aanget.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Speciale dank aan het Gidday lab voor hun werk in het ontwikkelen van het RHP-protocol, evenals de Neuro-Models Facility (UTSW) voor hun assistentie bij de tMCAo-operaties. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de American Heart Association (AMS), The Haggerty Center for Brain Injury and Repair (UTSW; AMS) en de Spastic Paralysis Research Foundation van de Illinois-Eastern Iowa District van Kiwanis International (JMG).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Flowmeters, regulators | VetEquip, Inc | Specialty order | Vier flowmeters zijn bevestigd aan 6,0 mm flexibele PVC-buis die met een vrouwelijke kunststof connector op de inlaatpoort van elke inductiekamer wordt aangesloten. Deze flowmeters zijn aan een metalen balk van 6,5" x 1" x 1" vastgeschroefd. Deze metalen balk is vastgeschroefd aan een MI-246-P drukmeter met een DISS-uitgang. Deze drukmeter en flowmeterapparatuur kunnen met een sleutel aan elke nieuwe gascilinder worden bevestigd. |
| 21% O2 tank | AirGas | OX USP200 | |
| 11% O2 tank | AirGas | Specialty order | |
| 8% O2 tank | AirGas | Specialty order | |
| 15 L inductiekamers | VetEquip | 941454 | |
| Moor Laber Dopper Flow | Moor Instruments | moorVMS-LDF1-HP | 0,8 mm diameter sonde |
| High Intensity Illuminator | Nikon | NI-150 | |
| Zoom Stereo Microscope | NIkon | SMZ800 | Andere chirurgische microscopen kunnen worden gebruikt. |
| Kent Scientific Right Temperature CODA | Kent Scientific Corporation | Discontinued | Aanbevolen vervanging is PhysioSuite met RightTemp Temperatuurbewaking en Homeothermische Controle (Kent Scientific, #PS-RT). |
| Hovabator Incubator | Stromberg's | 2362-E | Ons model is de 2362N. 2362E is een later model en bevat een elektronische thermostaat. |
| V010 Anesthesie systeem | VetEquip | 901807 | Inclusief: tien voet hogedruk zuurstofslang, frame, flowmeter, zuurstof flush-assemblage, verdamper, ademhalingscircuit, kamer, neuskoningen, afvoerbuis voor afvalgas en twee VapoGuard-filters |
| 250 ml isofluraand | Butler Schein | NDC-11695 | |
| D-6 Vet Trim Animal Cordless Trimmer | Andis | #23905 | Vervangende messen zijn verkrijgbaar bij Andis (#23995) |
| Betadine | Fisher Scientific | 19-898-867 | |
| Q-tips | Meerdere verkopers | Catalogusnummer niet beschikbaar | |
| Gauze Pads | Fisher Scientific | 67622 | |
| Chirurgische draperie | Fisher Scientific | GM300 | |
| Zijde Sutures | Look/Div Surgical Specialties | SP115 | |
| Nylon Sutures | Look/Div Surgical Specialties | SP185 | |
| Durmont #5 forceps (2) | Fine Science Tools | 11251-35 | Verticaal 45° |
| Chirurgische schaar | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| 3 mm Vannas | Kent Scientific Corporation | INS600177 | Rechte kling |
| Hartman Hemostatis | Fine Scientific Tools | 13002-10 | |
| Occluderende filamenten | Washington University | Specialty order | Filamenten zijn siliconen gecoat bij Washington University en worden voor een vergoeding aan UTSW-faciliteiten verstrekt. |
| Evans Blue | Sigma Aldritch | E2129-10G | |
| Filterpapier | Sigma Aldritch | WHA1001150 | 150 mm, cirkels, Grade 1 |
| Weigh Boats | Fisher Scientific | 02-202-101 | 2,5" diameter |
| 0,9% Natriumchloride-injectie USP | Baxter Pharmaceutics | 2B1321 | |
| 0,3 cc insulinesyringe met 29 gauge naald | Becton Dickinson Labware | 309301 | |
| Flat bottom restrainer | Braintree Scientific | FB M | 2,0" diameter |
| TTC | Sigma | T8877 | |
| 10x PBS, pH 7.4 | Fisher Scientific | BP399-20 | |
| Waterbad | Meerdere verkopers | Catalogusnummer niet beschikbaar | Scintillatiebuisjes met TTC kunnen handmatig onder stromend warm water worden gehouden als alternatief voor het waterbad. |
| Styrofoam bord | Meerdere verkopers | Catalogusnummer niet beschikbaar | |
| Grote spuitenset | PumpSystems Inc | P-SYRKIT-LG | |
| Perfusiepomp | PumpSystems Inc | NE-300 | |
| 60 cc spuit | Fisher Scientific | NC9203256 | |
| 27 gauge gevleugelde infuusset | Kawasumi Laboratories, Inc | D3K1-25G 1 | |
| 20 ml scintillatieglas | Fisher Scientific | 50-367-126 | |
| Roestvrijstalen spatel | Fisher Scientific | 14-373-25A | |
| Alto acryl 1,0 mm muisbrein, coronaal | CellPoint Scientific | Catalogusnummer niet beschikbaar | |
| 0,21 mm roestvrijstalen messen, 25 pk | CellPoint Scientific | Catalogusnummer niet beschikbaar | Herbruikbare cryostat-messen zijn een goedkope alternatief. |
| 4% paraformaldehyde | Santa Cruz Biotechnology | SC-281692 | |
| Superfrost microscoopglazen | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| HP Scanjet G4050 | Meerdere verkopers | Catalogusnummer niet beschikbaar | Andere commerciële scanners zijn geschikt voor deze stap in het protocol. |
| ImageJ | National Institute of Health | Catalogusnummer niet beschikbaar | |
| Analytische weegschaal | Mettler Toledo | XSE 205U | |
| Precision Compact Oven | Thermo Scientific | PR305225M | |
| 1,7 ml microcentrifugebuisjes (Eppendorfs) | Denville Scientific | C2170 | |
| Formamide | Fisher Scientific | BP228-100 | |
| 96-well platen | Fisher Scientific | 07-200-9 | |
Referenties
- Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
- Gidday, J. M. Cerebral preconditioning and ischaemic tolerance. Nat Rev Neurosci. 7
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
