Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Kwantificering van Neurovasculaire Protection Na Repetitive Hypoxische Voorconditionering en Transient midden cerebrale slagader Occlusie in Muizen

13.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52675

⸱

4 mei 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology and Neurotherapeutics, University of Texas Southwestern Medical Center, 2Department of Neurological Surgery, Washington University School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft repetitieve hypoxische preconditie, of korte blootstellingen aan systemische hypoxie die infarctvolumes en bloed-hersenbarrière-storingen verminderen na een voorbijgaande occlusie van de middelste hersenslagader bij muizen. Het beschrijft ook dubbele kwantificering van infarctvolume en bloed-hersenbarrière-storing na een beroerte om de werkzaamheid van neurovasculaire bescherming te beoordelen.

Samenvatting

Experimentele diermodellen van een beroerte zijn van onschatbare waarde tools voor het begrijpen van een beroerte pathologie en het ontwikkelen van meer effectieve behandeling strategieën. Een 2 week protocol voor repetitieve hypoxische preconditionering (RHP) induceert langdurige bescherming tegen het centrale zenuwstelsel (CNS) letsel in een muismodel van focale ischemische beroerte. RHP bestaat uit 9 stochastische blootstelling aan hypoxie die variëren in zowel duur (2 of 4 uur) en de intensiteit (8% en 11% O2). RHP vermindert infarct volumes bloed-hersen barrière (BBB) ​​verstoring, en de post-stroke ontstekingsreactie weken na de laatste blootstelling aan hypoxie suggereert een langdurige inductie van een endogene CNS-beschermende fenotype. De methode voor de dubbele kwantificering van infarct volume BBB verstoring is doeltreffend worden geëvalueerd neurovasculaire bescherming bij muizen met RHP of andere putatieve neuroprotectieve. Volwassen mannelijke Swiss Webster muizen werden geconditioneerd door RHP of duur equivalent blootstelling aan 21% O (dwz kamer lucht). Een 60 min voorbijgaande midden cerebrale slagader occlusie (tMCAo) werd geïnduceerd 2 weken na de laatste hypoxische blootstelling. Zowel de occlusie en reperfusie werden bevestigd door transcraniële laser Doppler flowmetry. Tweeëntwintig uur na reperfusie, Evans Blue (EB) werd intraveneus toegediend via een injectie in de staartader. 2 uur later werden de dieren opgeofferd door een overdosis isofluraan en hersencoupes werden gekleurd met 2,3,5- trifenyltetrazoliumchloride (TTC). Infarcten volumes werden vervolgens gekwantificeerd. Vervolgens EB geëxtraheerd uit het weefsel dan 48 uur om BBB storing te bepalen na tMCAo. Samengevat, RHP is een eenvoudig protocol dat kan worden gerepliceerd, met minimale kosten, langdurige bescherming tegen endogeen neurovasculaire beroerte letsel bij de muis, de translationele potentieel voor andere CNS-gebaseerde en systemische pro-inflammatoire ziektetoestanden.

Inleiding

Aangezien de voornaamste oorzaak van volwassen gehandicapten en de vierde doodsoorzaak, beroerte is één van de meest slopende ziekten tegenover de volwassen bevolking van de Verenigde Staten. 1 Diermodellen van een beroerte zorgen voor experimenteel onderzoek van nieuwe methoden ter vermindering van ischemische schade en het verbeteren van post-stroke herstel. Een roman avenue voor dergelijke translationeel onderzoek is preconditionering. Voorbehandeling het opzettelijk gebruik van een niet schadelijk stimulus om de schade op een volgende, en ernstiger letsel. 2 hypoxische preconditionering is aangetoond pleiotrope veranderingen in de hersenen die bescherming bieden tegen beroerte in zowel in vivo als in vitro studies produceren . 3 echter eenmalige blootstelling aan hypoxia biedt slechts kortdurende neuroprotectie, induceren minder dan 72 uur van tolerantie tegen ischemie bij volwassen muizen. 4 zelfs na vier weken van 14 uur dagelijkse blootstelling aan hypoxie hypobaric, Lin et al. found dat neuroprotectie werd volgehouden slechts één week. 5 Repetitive hypoxische preconditionering (RHP) wordt gekenmerkt door stochastische variaties in frequentie, duur en intensiteit van hypoxische blootstelling. In tegenstelling tot een voorbehandeling uitdaging RHP induceert een cerebroprotective fenotype die blijft tot acht weken bij muizen. 6 RHP verminderd infarct volumes bloed-hersen barrière (BBB) ​​verstoring, vasculaire inflammatie, en leukocyt diapedesis weken na de laatste hypoxische blootstelling . RHP bijzonder verminderde ontsteking in de ischemische hersenen door verlaging van T-cel, monocyt en macrofaag populaties, met behoud van B-celpopulaties in de ischemische hemisfeer. 7 In feite, RHP induceerde een immunosuppressief fenotype bij muizen vóór elke CNS letsel, waaronder beroerte. RHP-behandelde B-cellen geïsoleerd uit RHP behandelde gezonde muizen vertoonden een unieke anti-inflammatoir fenotype, met een neerwaartse regulatie van zowel antigeenpresentatie en antilichaamproductie. Dealgehele vermindering van pro-inflammatoire antigeen-specifieke afweermechanismen maakt RHP een uitstekende methode om endogene immunosuppressie te induceren niet alleen CNS-specifieke ontstekingsziekten, maar ook systemische verwondingen of ziekte modellen met een pro-inflammatoire pathologie omvatten.

RHP vermindert zowel infarct volume en BBB verstoring na een voorbijgaande midden cerebrale slagader occlusie (tMCAo). Diermodellen van beroerte, zoals de algemeen gebruikte tMCAo, drastisch verbeteren van het begrip van de pathofysiologie van beroerte, alsook het ontwerpen van effectievere Neurotherapeutics. Eerst ontwikkeld door Koizumi et al., In 1986, 8 de tMCAo procedure is een veel gebruikte werkwijze voor het induceren van een beroerte bij knaagdieren en één van de voorkeurswerkwijzen voor het onderzoeken van ontsteking na reperfusie. Als werkwijzen voor tMCAo evolueren, de meer recente gebruik van met silicone beklede filamenten verder het risico van subarachnoïdale bloeding te verminderen in vergelijking met andere modellen 9,10 </ Sup> en het verbeteren van de betrouwbaarheid, maar helaas tMCAo levert vaak een grote variatie in infarct volumes. 11-13 De meeste van deze studies af te bakenen infarct gebieden in coronale hersenen secties door kleuring met 2,3,5- trifenyltetrazoliumchloride (TTC), beschouwd als een gouden standaard voor kwantificatie infarct omdat het een eenvoudige en goedkope manier om levendige, reproduceerbare resultaten. TTC dient als een substraat van dehydrogenasen aanwezig in mitochondria. Wanneer hersenplakjes worden blootgesteld aan het TTC-oplossing wordt TTC selectief in levende cellen genomen als de niet-oplosbare reductieproduct, formazan, precipiteert een dieprode kleur in levensvatbare mitochondria. Omwille van mitochondriale dysfunctie in de ischemisch weefsel, dit weefsel blijft wit, waardoor voor differentiatie van beschadigde en gezond weefsel. 14

RHP vermindert ook BBB verstoring in de ischemische hemisfeer. 6 Daarom is de dubbele kwantificering van BBB integriteit binnen dezelfde Bregens als TTC-gebaseerde infarct volumebepalingen 15 nuttige informatie opleveren over de volledige werking van endogene bescherming en mogelijke causale verbanden tussen BBB verstoring en infarct bij onbehandelde en behandelde dieren te verschaffen. De instroom van perifeer bloed door een verstoorde BBB, secundaire beroerte, neemt leukocyt populaties, pro-inflammatoire cytokines, oxidatieve stress, vasogeen oedeem, en hemorragische transformatie in de ischemische hemisfeer uiteindelijk uitgebreid aantal besmettingen en mortaliteit bij patiënten met ischemische beroerte . 16,17 Een gebruikelijke meetmethode BBB verstoring in diermodellen met kwantificering van Evans blue (EB) kleurstof lekken in de hersenen. 15,18-21 EB selectief bindt aan albumine, een globulair eiwit serum (MW = 65 kDa) dat maakt de BBB niet oversteken ongedeerd dieren. 22 Naar aanleiding van ischemische beroerte, EB infiltreert de hersenen, en fluoresceert bij 620 nm, waardoor voor het meten van de optische dichtheid within geperfundeerde gewonden parenchym. 22 De extinctie is recht evenredig met de permeabiliteit van de BBB bij EB van transcardiale perfusie verricht van de post-mortem corticale vasculatuur gewassen. Met de onmiddellijke verwerking van TTC-gekleurd hersenen bij dieren met EB toediening kan zowel het infarct volume en BBB verstoring effectief worden gekwantificeerd. Opgemerkt zij echter dat neuronaal letsel en BBB verstoring niet gelijktijdige processen in de hersenen na een beroerte, 23,24 zodat de selectie van de tijd van offeren is een belangrijke overweging.

Het protocol dat volgt geeft de RHP werkwijze de tMCAo werkwijze voor het induceren van een tijdelijke arteriële occlusie die modellen middelste cerebrale arterie occlusie bij menselijke patiënten, en de dubbele histologische methoden om neurale en vasculaire beroerte letsel eindpunten. TTC meet celdood en cumulatief weefselschade, waardoor de kwantificering van de totale infarct volume, terwijl EB voorziet in de hemisferische kwantificering van BBB schade.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

NB: Dit protocol werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) op UT Southwestern Medical Center, dat zich aan de National Institutes for Health (NIH) beleid voor experimentele gebruik van dieren.

1. Repetitieve Hypoxische Voorconditionering

  1. Aangepast ontwerp vier flowmeters gas toezichthouders en hechten aan de standaard 15 L inductie kamers met PVC buizen samengeperst gas toestaan ​​van de zuurstof (O 2) tanks te stromen in de kamers via een inlaatpoort. Zie apparatuur en materialen voor meer informatie over het aangepaste ontwerp.
  2. Verdeel muizen in 2 groepen: Repetitive Hypoxische Voorconditionering (RHP) Group, die de vorderingen van ontvangen tot 8% en 11% O 2, en de controle groep, die de vorderingen ontvangt tot 21% O 2 (ruimte lucht) gelijktijdig. Zie tabel 1 voor de variaties in frequentie, intensiteit (8 en 11% O 2 of 21% O 2) en duur (2 of 4 uur) van RHP posities.
  3. Verwijder de bovenste filterdeksel per kooi en plaats de kooi met voedsel en water flessen intact, in de kamers verbonden met hun respectievelijke O 2 tanks. Sluit en zet het deksel van de kamer.
    1. Open de hoofdgasklep voor tanks en stel de voorloop per inductiekamer tot 2 liter per minuut (LPM) voor de eerste 5 minuten van blootstelling. Verminder het debiet tot 1 LPM voor de rest van de blootstelling.
    2. Aan het einde van de belichting, vermindering van de stroming aan 0 LPM en sluit de gasklep van de tanks.
    3. Open de kamer deksels en vervang het filter deksel op elke kooi. Plaats de kooien in de standaard woningbouw tot de volgende hypoxische blootstelling.
  4. Spray omlaag elke inductie kamer met NPD (Steris) of een gelijkwaardige desinfecterend middel / deodorant na elk gebruik.
  5. Expose zowel 21% en RHP muizen op hetzelfde tijdstip in de loop van twee weken zoals beschreven in tabel 1.

2. TransientMidden cerebrale slagader occlusie (tMCAo)

  1. Zie discussie voor meer informatie over de timing van een beroerte na de definitieve RHP blootstelling.
  2. Bereid een aseptische operatie werkplek. Schone omgeving werkplek met 70% ethanol of een gelijkwaardige ontsmettingsmiddel en autoclaaf alle chirurgische instrumenten.
    1. Stel de Laser Doppler Flowmetry (LDF) instrument om de relatieve veranderingen in de cerebrale doorbloeding (CBF) te meten. Zet het verwarmingselement tot 37 ° C. Zet de incubator tot 34 ° C.
  3. Verdoven muizen met een korte blootstelling aan een mix van 4% isofluraan / 70% NO 2/30% O 2 in een klein inductie kamer. Bevestig de juiste verdoving door licht te knijpen de poot. Als de muis trekt zijn poot, de terugkeer van de muis om de inductie kamer en isofluraan blootstelling blijven.
  4. Verwijder muizen uit de narcose inductie kamer en steek snel de neus van de muis in de neuskegel. Open de gasstroom naar de neuskegel afsluiten van stroom naar de anesThesia inductie kamer.
    1. Zonder de 70% NO 30/02% O 2 gasmengsel, vast isofluraan 1,8% als onderhoudsdosering voor de rest van de procedure. Ademhaling moet langzaam en regelmatig gedurende de procedure blijven, maar als de ademhaling wordt snel en oppervlakkig, verhoging van de dosis isofluraan. Maintenance dosis kunnen inhouden tussen productie en dierlijke gebruikt in het experiment.
  5. Met een microshaver, scheren haren op de temporale gebied tussen de hoek van het oog en oor en ventrale middenlijn van de nek. Verwijder overtollige bont en oculaire smeermiddel met een steriel wattenstaafje om de hoornvliezen niet uitdrogen tijdens de procedure. Veeg incisie met alcohol pads en swab providon-jood met een steriel wattenstaafje om aseptische omstandigheden te handhaven.
  6. Dien analgetica volgens knaagdieren chirurgische richtlijnen.
  7. Maak een incisie door de tijdelijke huid tussen het oog en het oor.Expose de temporalis spier. Met behulp van micro-chirurgische schaar, knip de temporale spier ligament in de temporale nok op het gebied van witte spier strepen.
    1. Duw de spiermassa zijdelings met een tang om de middelste cerebrale slagader (MCA) door de schedel te visualiseren. Na het insnijden van de temporale spier, kan de ruimte vullen met bloed. Gebruik voorzichtig een wattenstaafje om eventuele bloeden stelpen.
    2. Richt de de LDF sonde met de MCA gebied. Noteer het gekozen gebied varieert muizen vat.
    3. Houd de LDF op zijn plaats en gelijk met de schedel tot een stabiele rode bloedcel flux wordt gelezen en noteer deze waarde als de basislijn CBF. Ideaal basislijn CBF op een Laser Doppler Flowmetry zijn> 600 flux, maar dit zal variëren met de fabrikant. Als basislijn CBF <400 flux, de stroom opname hoogstwaarschijnlijk uit een nabijgelegen ader of een onvolledige plaatsing van de sonde in het doelvat.
  8. Nadat basislijn CBF is gevestigd, repositide muis, zodat de hals wordt blootgesteld. Ondersteunen haar hoofd en houdt de muis onder constante verdoving van de neuskegel.
  9. Maak een ventrale middellijn incisie van net onder de onderkaak naar het sleutelbeen.
    1. Met behulp van een tang stomp ontleden alle oppervlakkige fascia aan de linker gemeenschappelijke halsslagader (CCA) bloot te leggen. Scheid de CCA van bindweefsel en de nervus vagus.
    2. Permanent ligeren het CCA met een 6,0 zijden hechtdraad. Plaats de ligeren hechtdraad zo proximale mogelijk om genoeg ruimte voor het afsluiten van filament plaatsing mogelijk te maken.
    3. Loop en losjes bind een tweede zijde 6,0 hechtdraad rond de CCA distale aan de afsluitende hechtdraad. Wees voorzichtig de slagader niet om af te sluiten als de afsluitende filament vervolgens zullen worden geregen door de halsslagader.
    4. Gebruik een 8 x 2 mm licht micro serrafine areterial klem om de CCA distale klem om de losjes gebonden zijden hechtdraad. Til het CCA met een tang en een kleine longitudinale incisie, als proximale naar het afbinden hechtdraad alskan met 3 mm Vannas.
    5. Rijg een 12 mm-silicium gecoate 6.0 gauge nylon afsluitende filament door de incisie aan de slagader lumen in te voeren, en vooraf het een paar mm dan. Losjes draai de tweede losse zijden hechtdraad rond de tip van de afsluitende gloeidraad om ervoor te zorgen bloedstroom niet duw de gloeidraad uit de CCA en verwijder de arteriële klem.
    6. Bij de eerste splitsing van de CCA in de interne halsslagader (ICA) en de externe halsslagader (ECA), draai de afsluitende gloeidraad in de juiste tak van de eerste splitsing naar de ICA.Advance voer de afsluitende gloeidraad 9-10,5 mm verleden de tweede zijden hechtdraad in de linker interne halsslagader (ICA).
    7. Kort na het invoeren van de ICA, vooraf de afsluitende gloeidraad in de linker tak bij de tweede splitsing tussen de ICA en de pterogopalantine slagader (PPA). Visualisatie van de PPA is onwaarschijnlijk zo gaan totdat je voelt een lichte weerstand met volledige plaatsing van de afsluitende gloeidraad.Het opheffen van de ICA met een tang kan helpen de gloeidraad om gemakkelijker draad in de linker tak van de tweede birfurcation. Draai de tweede zijden hechtdraad.
    8. Draai de muis, zodat de incisie over de MCA zichtbaar is. Met de LDF apparatuur, bevestigen dat de CBF is geblokkeerd door de LDF metingen. Een succesvolle afsluiting is een reductie> 80% van de uitgangswaarde CBF.
    9. Volledig scherpen en dubbel-knoop de tweede zijden hechtdraad rond de afsluitende filament wanneer de juiste positie is bereikt. Indien nodig, licht duwen of trek de afsluitende gloeidraad CBF criteria voor een succesvolle afsluiting (bijvoorbeeld> 80% reductie ten opzichte van baseline CBF) te bereiken.
    10. Sluit de nek en hoofd opening met 6,0 nylon hechtingen.
  10. Plaats muizen in de 34 ° C incubator gedurende de duur van de occlusie. Aanbevolen lengte van occlusie 60 min, maar dit verschilt voor leeftijd, stamafhankelijke verschillen in cerebrovasculaire anatomie, 25 en de omvang van injury gewenst (mild, matig, ernstig). Zorg ervoor dat dieren weer bij bewustzijn binnen minuten van komende uit anesthesie.
  11. Opnieuw verdoven dieren met isofluraan, zoals beschreven in stap 2.3, 5 minuten vóór het einde van de vooraf bepaalde periode occlusie, opent de hoofdhuid incisie en bevestigen dat de MCA perfusie nog wordt verminderd door middel van transcraniële LDF metingen. Als CBF niet voldoende gereduceerd (bv <20% basislijn CBF), heeft de MCA reperfusie op enig moment tijdens de occlusie en de muis moeten verdere experimenten worden uitgesloten.
  12. Open de middellijn hals incisie en losjes bind derde zijden hechtdraad rond de CCA, distaal van de tweede zijden hechtdraad maar proximaal van de CCA bifurcatie zodat de uitwendige halsslagader (ECA) levensvatbaar blijft nadat het filament verwijderd.
    1. Snijd of ontkoppelen de knoop die de afsluitende gloeidraad (dwz tweede zijden hechtdraad) houdt en langzaam terug te trekken van de afsluitende gloeidraad. Eenmaal verwijderd, snel sluiten van dederde zijden hechtdraad rond de CCA om terugstroom van het bloed te minimaliseren van het ICA. Double-knoop deze hechtdraad en sluit de incisie met 6,0 nylon hechtingen.
    2. Verplaats de muis om het niveau van de CBF te kwantificeren na 5 min reperfusie. Succesvolle reperfusie wordt meestal verstaan ​​een CBF van> 50% van de uitgangswaarde CBF, maar zoals bij afsluiting debiet, kunnen onderzoekers hun eigen criteria vast te stellen. Wanneer dieren vertonen een CBF dan 50% van de uitgangswaarde, is het waarschijnlijk MCA "vaste" ingesloten, en vormt dus een andere studie exclusiecriterium.
    3. Sluit beide insnijdingen met 6,0 nylon hechtingen. Zorg saline, verdoving (lidocaïne) en antibiotica volgens knaagdieren richtlijnen. Maar sommige kleine doses antibiotica (3 mg / kg van minocycline) gevonden neuroprotectieve volgende beroerte. 26
  13. Na het terugbrengen van het bewustzijn in het verwarmde couveuse na een operatie, plaats muizen in een schone, steriele kooi. Zorg voor vochtige food of voedingswaarde hydratatie dieet gel supplementen en een petrischaal van water als de dieren zal hebben beperkte mobiliteit na een beroerte. Nauwlettend dieren tijdens het herstel voor overmatige post-operatieve pijn en dood.

3. Evans Blue (EB) Injection

  1. Injecteer EB 22 uur na reperfusie en moet circuleren in de bloedstroom gedurende 2 uren voorafgaand aan offeren en TTC kleuring.
  2. Een oplossing voor injectie EB (EB 2% in zoutoplossing) en meng bij kamertemperatuur. Filter oplossing door filtreerpapier of duwen door een 0,2 um filter gekoppeld aan een kleine spuit om onopgelost EB te verwijderen en bewaar bij kamertemperatuur.
  3. Bereid de hoeveelheid EB nodig voor injectie (4 ml / kg lichaamsgewicht) Teken de gewenste hoeveelheid kleurstof in een 0,3 cc insuline spuit met een 29 gauge naald en waarborgen dat de oplossing op kamertemperatuur
    1. Restrain muis met behulp van platte bodem restrainer. Houd de staart, zodat de laterale ader is uppermost. Zijnerven bevinden zich aan weerszijden van de hartlijn van de staart. Houd het puntje van de staart aan de muis stabiel voor injectie houden.
    2. Steek de naald in de ader ongeveer 3,5 mm, zorg dat de ader niet te perforeren. Controleer of de naald in de ader door terugtrekken op de spuit en naar bloedsporen.
    3. Injecteer van de kleurstof in de loop van 1 min. Als de oplossing gaat in de ader dient er minimale weerstand als druk wordt uitgeoefend op de injectiespuit. Bevestig succesvolle systemische veneuze toediening van EB door een onmiddellijke kleurverandering in de staart, ledematen en ogen van de muis.
    4. Verwijder de naald uit de staart en voorzichtig druk uit te oefenen met behulp van schone gaasje om het bloeden te stoppen.
  4. Begin timing wanneer de huid van de muis wordt blauw. Laat de EB circuleren gedurende 2 uur om de verzwakte BBB dringen.

4. 2,3,5- trifenyltetrazoliumchloride (TTC) kleuring

  1. Perfusie en TTC vlekken optreedt 24 uur na reperfusie.
  2. Bereid een 2% TTC-oplossing voorafgaand aan de aangegeven tijd van opoffering. Voeg 10 g poeder TTC 500 ml 0,01 M fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7,4. Heat oplossing 37 ° C in een waterbad op solubiliserende van de TTC vergemakkelijken. LET OP: TTC poeder en oplossing zijn een huid, longen, en irriterend voor de ogen. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen bij het hanteren van deze materialen.
    1. Nadat het poeder volledig is opgelost, onmiddellijk aan een flesje, afdekking in folie en bewaar bij 4 ° C. TTC en weefsel gekleurd met TTC zijn lichtgevoelig.
  3. Op 24 uur na tMCAo en 2 uur na EB administratie, offeren het dier met een isofluraan overdosis in een kleine inductie kamer. Perfusie onmiddellijk na sacricice teneinde autolyse die begint in afwezigheid van zuurstof na de dood minimaliseren beginnen.
  4. Snel zet de dierlijkeop een piepschuim platform met onderarmen opgespeld door de poten. Snijd een laterale incisie door de buikwand van de middellijn net onder de ribbenkast. Knip voorzichtig door het membraan naar het hart bloot te leggen.
    1. Start de perfusie pomp bij 5 ml / min debiet een 60 cc injectiespuit gevuld met ijskoude 0,01 M PBS en verbonden met een 27 gauge naald gevleugelde infusie. Plaats de punt van de naald ongeveer 0,5 cm in de linker hartkamer en snijd het rechter atrium. Progressief verdund veneuze bloed moet uit het atrium stromen tijdens de perfusie tot veneuze bloed verschijnt kleurloos. Transcardially perfuseren 30 ml 0,01 M fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) door het hart.
  5. Voeg 5 ml van TTC oplossing in doorzichtige 20 scintillatie flessen.
  6. Onmiddellijk na perfusie, onthoofden de dieren en ontleden van de hersenen met behulp van kleine schaar en een spatel indien nodig. Onderzoek de hersenen om dieren die subarachnoïdale hemorrha onderging sluitenge bij de Cirkel van Willis, secundair aan hechtdraad plaatsing. Controleer of de contralaterale halfrond naar de afgesloten MCA verschijnt bleke, zonder merkbare EB lekkage of oedeem.
  7. Giet PBS in een acryl brein matrix ontworpen om 1,0 mm dik coronale secties van een muis hersenen te maken. Plaats de hersenen, dorsale kant naar boven, in de matrix en onmiddellijk giet PBS over de hersenen. Houd de hersenen vochtig.
    1. Verwijder de reukkwabben door het met een roestvrijstalen 0,21 mm dikke mesje in de tweede sleuf van de rostrale zijde van de matrix.
    2. Verwijder de kleine hersenen door het met een mes in de vierde sleuf van de caudale kant van de matrix.
    3. Plaats een lemmet in het midden van de groef overblijvende sleuven in de matrix. Plaats de overige bladen gelijkmatig tweeën deelt het restmateriaal aan de gelijkmatige verdeling van weefsel gedurende het snijden te waarborgen.
    4. Zodra alle bladen zijn aangebracht, voeg 1-2 druppels PBS om de hersenen te bevochtigen.
    5. Verwijder het mess een voor een uit de matrix met 'rostrale gebied. Houd de eerste 7 plakjes voor TTC analyse na tMCAo. Gebruik een spatel om de plakken goed te brengen van de tanden om de TTC-vial.
  8. Nadat alle secties zijn in de flacon, sluit het af en plaatsen in een warm water bad tot de secties draaien roze. Zwenk de fles in het bad eventueel sectie overlap, wat kan leiden tot ongelijkmatige kleuring te vermijden. Dan gooi de TTC en giet er een 4% paraformaldehyde oplossing in de flacon van de hersenen secties omvatten om de TTC chemische reactie te beëindigen.
  9. Onmiddellijk regelen van de secties op een schone 1 "x 3" glasplaatje en oriënteren de delen van rostraal van caudale.
    1. Wanneer de secties aangebracht op de slede, scant de schuif met een standaard scanner. Stel de resolutie met een minimum van 600 dpi voor beeldanalyse. Zorg ervoor dat u de naam van het dier en een metrische heerser in het gescande beeld op te nemen.
    2. Flip over de diaen scan de achterkant alle gegevens verzameld waarborgen.

5. Infarct Volume Kwantificering

  1. Kwantificeren van het infarct volume met behulp van een standaard beeldanalyse software (bijvoorbeeld ImageJ).
  2. Scan beelden met een hoge resolutie (bv 600 dpi) voor een adequate analyse. Crop beelden. Standaardisering van de schaal voor alle beelden met de metrische heerser opgenomen in de gescande afbeelding.
  3. Bereken het totale volume van de contralaterale hemisfeer met de volgende formule. Herhaal deze formule om het totale volume van de ipsilaterale hemisfeer berekenen.
    Som van de totale contralaterale hemisfeer van elk segment x plakdikte
  4. Bereken de indirecte infarctvolume. . Controle voor ipsilaterale oedeem van een beroerte met behulp van de gezonde, contralaterale halfrond als een controle 27 Gebruik de volgende formule om de indirecte infarct volume te berekenen:
    Totale volume van de contralaterale hemisfeer -
    (Totaal volume van ipsilaterale hemisfeer -Gemiddelde volume van 3 metingen van infarct)

6. bloed-hersenbarrière (BBB) ​​Integriteit kwantificering

  1. Ter voorbereiding van EB kwantificering, eerste weegt 2,5 inch wegen boten. Registreer het gewicht en label twee wegen boten voor elk dier: een voor de ipsilaterale hemisfeer en een voor de contralaterale hemisfeer.
  2. Na het scannen van de TTC-gekleurde coupes, halveren elke sectie met een wegwerp scheermesje in ipsilaterale en contralaterale halfrond. Plaats de ipsilaterale hemisfeer van alle 7 secties in een gewichtboot en registreer het gewicht. Herhaal dit voor contralaterale halfrond.
  3. Onmiddellijk overdracht van het gewicht boten naar een oven set voor 56 ° C gedurende 48 uur.
  4. Weeg de droge gedeelten. Transfer beide hersenhelften in afzonderlijke 1,5 ml microcentrifuge buizen.
    1. Bereken de hoeveelheid formamide nodig voor elke hersenhelft (8 ml / g droog weefsel), en aan hun respectievelijke microcentrifuge tubes. Formamide is lichtgevoelig en heeft betrekking op alle-formamide behandelde monsters in folie vanaf dit punt verder.
    2. Breng de microcentrifugebuizen een incubator ingesteld op 56 ° C gedurende nog 48 uur.
  5. Na de 48 uur, pipet uit de blauwe supernatant naar een andere set van gelabelde microcentrifugebuisjes. Duw weefsel naar de bodem van de buis om het volume geëxtraheerde supernatant maximaliseren. Houd de buizen van supernatant en gooi alle weefsel.
  6. Bereid exponentiële seriële verdunningen van EB in formamide voor de standaardcurve. Inclusief 1 leeg (formamide) en vervolgens 10 exponentiële oplossingen van 0,125 ug / ml tot 64 ug / ml van EB in formamide.
    1. Pipetteer 300 ul van de verdunningen van de standaardcurve in een 96-wells plaat. Pipetteer 300 ul van de supernatant in overeenkomstige wells.
    2. Meet de absorptie op een spectrofotometer bij 620 nm.
    3. Vergelijk de standaardcurve van de EB verdunningen met absorptie of de bovenstaande voorbeelden. De optische dichtheid rechtevenredig met de integriteit van de BBB.
    4. Stel dat de optische dichtheid van de contralaterale hemisfeer als achtergrond en worden de formules (ipsilaterale-contralaterale) / contralateraal veelvoudverandering bepalen. Voor meer informatie over statistische analyse zie Martin et al., 2010. 18

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Deze studie omvatte 25 mannelijke Swiss Webster muizen die 10 weken oud waren bij aanvang van randomisatie tot RHP (n = 10) of 21% O 2 (n = 15) groepen. Twee weken na de laatste RHP blootstelling werden chirurgische procedures uitgevoerd met groepen blind en vorkheftruck tussen dag. Na tMCAo, 1 muis stierf tijdens postoperatieve herstel en 1 muis werd uit het onderzoek uitgesloten omdat het niet voldeed aan de reperfusie CBF criterium. Beide uitgesloten muizen werden van de 21% O 2-groep. Overeenko...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Een enkele blootstelling aan systemische hypoxie (dat wil zeggen, 2 uur van 11% O 2) bij muizen "tijdelijk" beschermt de hersenen tegen tMCAo, 29 betekent dat de epigenetische antwoord op de hypoxische preconditionering uitdaging is de korte levensduur, en de basislijn fenotype wordt hersteld binnen dagen. Repetitieve presentaties van de hypoxische preconditionering stimulus dramatisch verlengen van de duur van de neuroprotectieve fenotype. 6 Vele studies hebben aanget...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Speciale dank aan het Gidday lab voor hun werk in het ontwikkelen van het RHP-protocol, evenals de Neuro-Models Facility (UTSW) voor hun assistentie bij de tMCAo-operaties. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de American Heart Association (AMS), The Haggerty Center for Brain Injury and Repair (UTSW; AMS) en de Spastic Paralysis Research Foundation van de Illinois-Eastern Iowa District van Kiwanis International (JMG).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Flowmeters, regulatorsVetEquip, IncSpecialty orderVier flowmeters zijn bevestigd aan 6,0 mm flexibele PVC-buis die met een vrouwelijke kunststof connector op de inlaatpoort van elke inductiekamer wordt aangesloten. Deze flowmeters zijn aan een metalen balk van 6,5" x 1" x 1" vastgeschroefd. Deze metalen balk is vastgeschroefd aan een MI-246-P drukmeter met een DISS-uitgang. Deze drukmeter en flowmeterapparatuur kunnen met een sleutel aan elke nieuwe gascilinder worden bevestigd.
21% O2 tankAirGasOX USP200
11% O2 tankAirGasSpecialty order
8% O2 tank AirGasSpecialty order
15 L inductiekamersVetEquip941454
Moor Laber Dopper Flow Moor Instruments moorVMS-LDF1-HP0,8 mm diameter sonde 
High Intensity Illuminator NikonNI-150
Zoom Stereo Microscope NIkonSMZ800Andere chirurgische microscopen kunnen worden gebruikt. 
Kent Scientific Right Temperature CODAKent Scientific CorporationDiscontinuedAanbevolen vervanging is PhysioSuite met RightTemp Temperatuurbewaking en Homeothermische Controle (Kent Scientific, #PS-RT).
Hovabator IncubatorStromberg's2362-EOns model is de 2362N. 2362E is een later model en bevat een elektronische thermostaat. 
V010 Anesthesie systeem VetEquip901807Inclusief: tien voet hogedruk zuurstofslang, frame, flowmeter, zuurstof flush-assemblage, verdamper, ademhalingscircuit, kamer, neuskoningen, afvoerbuis voor afvalgas en twee VapoGuard-filters
250 ml isofluraand Butler ScheinNDC-11695
D-6 Vet Trim Animal Cordless Trimmer Andis #23905Vervangende messen zijn verkrijgbaar bij Andis (#23995)
Betadine Fisher Scientific19-898-867 
Q-tipsMeerdere verkopers Catalogusnummer niet beschikbaar 
Gauze PadsFisher Scientific67622
Chirurgische draperieFisher ScientificGM300 
Zijde Sutures Look/Div Surgical SpecialtiesSP115
Nylon SuturesLook/Div Surgical SpecialtiesSP185
Durmont #5 forceps (2) Fine Science Tools 11251-35Verticaal 45°
Chirurgische schaarFine Science Tools 14028-10
3 mm VannasKent Scientific CorporationINS600177Rechte kling
Hartman Hemostatis Fine Scientific Tools13002-10
Occluderende filamentenWashington UniversitySpecialty orderFilamenten zijn siliconen gecoat bij Washington University en worden voor een vergoeding aan UTSW-faciliteiten verstrekt. 
Evans BlueSigma AldritchE2129-10G
Filterpapier Sigma AldritchWHA1001150150 mm, cirkels, Grade 1 
Weigh BoatsFisher Scientific02-202-1012,5" diameter
0,9% Natriumchloride-injectie USP Baxter Pharmaceutics 2B1321
0,3 cc insulinesyringe met 29 gauge naaldBecton Dickinson Labware309301
Flat bottom restrainer Braintree Scientific FB M2,0" diameter
TTCSigmaT8877
10x PBS, pH 7.4Fisher ScientificBP399-20
WaterbadMeerdere verkopers Catalogusnummer niet beschikbaar Scintillatiebuisjes met TTC kunnen handmatig onder stromend warm water worden gehouden als alternatief voor het waterbad.
Styrofoam bordMeerdere verkopers Catalogusnummer niet beschikbaar 
Grote spuitensetPumpSystems IncP-SYRKIT-LG
PerfusiepompPumpSystems IncNE-300 
60 cc spuitFisher ScientificNC9203256
27 gauge gevleugelde infuussetKawasumi Laboratories, IncD3K1-25G 1
20 ml scintillatieglasFisher Scientific50-367-126
Roestvrijstalen spatelFisher Scientific14-373-25A
Alto acryl 1,0 mm muisbrein, coronaalCellPoint Scientific Catalogusnummer niet beschikbaar 
0,21 mm roestvrijstalen messen, 25 pkCellPoint Scientific Catalogusnummer niet beschikbaar Herbruikbare cryostat-messen zijn een goedkope alternatief.
4% paraformaldehydeSanta Cruz Biotechnology SC-281692
Superfrost microscoopglazen Fisher Scientific12-550-15
HP Scanjet G4050Meerdere verkopers Catalogusnummer niet beschikbaar Andere commerciële scanners zijn geschikt voor deze stap in het protocol.
ImageJ National Institute of HealthCatalogusnummer niet beschikbaar 
Analytische weegschaalMettler Toledo XSE 205U
Precision Compact Oven  Thermo Scientific PR305225M
1,7 ml microcentrifugebuisjes (Eppendorfs)Denville Scientific C2170
FormamideFisher ScientificBP228-100
96-well platenFisher Scientific07-200-9

Referenties

  1. Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
  2. Gidday, J. M. Cerebral preconditioning and ischaemic tolerance. Nat Rev Neurosci. 7 (6), 437-448 (2006).
  3. Stetler, R. A., et al. Preconditioning provides neuroprotection in models of CNS disease: paradigms and clinical significance. Prog Neurobiol. 114, 58-83 (2014).
  4. Bernaudin, M., et al. Normobaric hypoxia induces tolerance to focal permanent cerebral ischemia in association with an increased expression of hypoxia-inducible factor-1 and its target genes, erythropoietin and VEGF, in the adult mouse brain. J Cereb Blood Flow Metab. 22 (4), 393-403 (2002).
  5. Lin, A. M., Dung, S. W., Chen, C. F., Chen, W. H., Ho, L. T. Hypoxic preconditioning prevents cortical infarction by transient focal ischemia-reperfusion. Ann N Y Acad Sci. 993, 168-178 (2003).
  6. Stowe, A. M., Altay, T., Freie, A. B., Gidday, J. M. Repetitive hypoxia extends endogenous neurovascular protection for stroke. Ann Neurol. 69 (6), 975-985 (2011).
  7. Monson, N. L., et al. Repetitive hypoxic preconditioning induces an immunosuppressed B cell phenotype during endogenous protection from stroke. J Neuroinflammation. 11, 22(2014).
  8. Koizumi, J. Y. Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema, I: a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jpn J Stroke. 8, 1-8 (1986).
  9. Liu, F., McCullough, L. D. The middle cerebral artery occlusion model of transient focal cerebral ischemia. Methods Mol Biol. 1135, 81-93 (2014).
  10. Rousselet, E., Kriz, J., Seidah, N. G. Mouse model of intraluminal MCAO: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining. J Vis Exp. (69), (2012).
  11. Lin, X., et al. Surgery-related thrombosis critically affects the brain infarct volume in mice following transient middle cerebral artery occlusion. PLoS One. 8 (9), e75561(2013).
  12. Yuan, F., et al. Optimizing suture middle cerebral artery occlusion model in C57BL/6 mice circumvents posterior communicating artery dysplasia. J Neurotrauma. 29 (7), 1499-1505 (2012).
  13. Kuraoka, M., et al. Direct experimental occlusion of the distal middle cerebral artery induces high reproducibility of brain ischemia in mice. Exp Anim. 58 (1), 19-29 (2009).
  14. Feng Zhang, J. C. Animal Models of Acute Neurolgoical Injuries II. Springer Protocol Handbooks. Chen, X. X. J., Xu, Z. C., JZ, W. ang , Humana Press. 93-98 (2012).
  15. Ludewig, P., et al. Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1 inhibits MMP-9-mediated blood-brain-barrier breakdown in a mouse model for ischemic stroke. Circ Res. 113 (8), 1013-1022 (2013).
  16. Sandoval, K. E., Witt, K. A. Blood-brain barrier tight junction permeability and ischemic stroke. Neurobiol Dis. 32 (2), 200-219 (2008).
  17. Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. The blood-brain barrier: an overview: structure, regulation, and clinical implications. Neurobiol Dis. 16 (1), 1-13 (2004).
  18. Benedek, A., et al. Use of TTC staining for the evaluation of tissue injury in the early phases of reperfusion after focal cerebral ischemia in rats. Brain Res. 1116 (1), 159-165 (2006).
  19. Yasmina Martin, C. A., Maria Jose Piedras, A. K. Evaluation of Evans Blue extravasation as a measure of peripheral inflammation. Protocol Exchange. , (2010).
  20. Belayev, L., Busto, R., Zhao, W., Ginsberg, M. D. Quantitative evaluation of blood-brain barrier permeability following middle cerebral artery occlusion in rats. Brain Res. 739 (1-2), 88-96 (1996).
  21. Martin, J. A., Maris, A. S., Ehtesham, M., Singer, R. J. Rat model of blood-brain barrier disruption to allow targeted neurovascular therapeutics. J Vis Exp. (69), e50019(2012).
  22. Kaya, M., Ahishali, B. Assessment of permeability in barrier type of endothelium in brain using tracers: Evans blue, sodium fluorescein, and horseradish peroxidase. Methods Mol Biol. 763, 369-382 (2011).
  23. Chen, Z. L., et al. Neuronal death and blood-brain barrier breakdown after excitotoxic injury are independent processes. J Neurosci. 19 (22), 9813-9820 (1999).
  24. Abulrob, A., Brunette, E., Slinn, J., Baumann, E., Stanimirovic, D. In vivo optical imaging of ischemic blood-brain barrier disruption. Methods Mol Biol. 763, 423-439 (2011).
  25. Majid, A., et al. Differences in vulnerability to permanent focal cerebral ischemia among 3 common mouse strains. Stroke. 31 (11), 2707-2714 (2000).
  26. Xu, L., et al. Low dose intravenous minocycline is neuroprotective after middle cerebral artery occlusion-reperfusion in rats. BMC Neurol. 4, 7(2004).
  27. Goldlust, E. J., Paczynski, R. P., He, Y. Y., Hsu, C. Y., Goldberg, M. P. Automated measurement of infarct size with scanned images of triphenyltetrazolium chloride-stained rat brains. Stroke. 27 (9), 1657-1662 (1996).
  28. Drummond, G. B., Paterson, D. J., McGrath, J. C. ARRIVE: new guidelines for reporting animal research. J Physiol. 588 (Pt 14), 2517(2010).
  29. Miller, B. A., et al. Cerebral protection by hypoxic preconditioning in a murine model of focal ischemia-reperfusion). Neuroreport. 12 (8), 1663-1669 (2001).
  30. Zhu, Y., Zhang, Y., Ojwang, B. A., Brantley, M. A., Gidday, J. M. Long-term tolerance to retinal ischemia by repetitive hypoxic preconditioning role of HIF-1alpha and heme oxygenase-1. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (4), 1735-1743 (2007).
  31. Cui, M., et al. Decreased extracellular adenosine levels lead to loss of hypoxia-induced neuroprotection after repeated episodes of exposure to hypoxia. PLoS One. 8 (2), e57065(2013).
  32. Prass, K., et al. Hypoxia-induced stroke tolerance in the mouse is mediated by erythropoietin. Stroke. 34 (8), 1981-1986 (2003).
  33. Svorc, P., Benacka, R. The effect of hypoxic myocardial preconditioning is highly dependent on the light-dark cycle in Wistar rats. Exp Clin Cardiol. 13 (4), 204-208 (2008).
  34. Chen, S. T., Hsu, C. Y., Hogan, E. L., Maricq, H., Balentine, J. D. A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction. Stroke. 17 (4), 738-743 (1986).
  35. Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. J Cereb Blood Flow Metab. 13 (4), 683-692 (1993).
  36. Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2 (3), 396-409 (2005).
  37. Lesak, M. D., Howieson, D. B., Loring, D. W. Neuropsychological Assessement. , Oxford University Press. 195-197 (2004).
  38. Kapinya, K. J., Prass, K., Dirnagl, U. Isoflurane induced prolonged protection against cerebral ischemia in mice: a redox sensitive mechanism. Neuroreport. 13 (11), 1431-1435 (2002).
  39. Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model. J Vis Exp. (47), (2011).
  40. Liu, F., Schafer, D. P., McCullough, L. D. T. T. C. fluoro-Jade B and NeuN staining confirm evolving phases of infarction induced by middle cerebral artery occlusion. J Neurosci Methods. 179 (1), 1-8 (2009).
  41. Wang, Z., Leng, Y., Tsai, L. K., Leeds, P., Chuang, D. M. Valproic acid attenuates blood-brain barrier disruption in a rat model of transient focal cerebral ischemia: the roles of HDAC and MMP-9 inhibition. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (1), 52-57 (2011).
  42. Rosenberg, G. A., Estrada, E. Y., Dencoff, J. E. Matrix metalloproteinases and TIMPs are associated with blood-brain barrier opening after reperfusion in rat brain. Stroke. 29 (10), 2189-2195 (1998).
  43. Goryacheva, A. V., et al. Adaptation to intermittent hypoxia restricts nitric oxide overproduction and prevents beta-amyloid toxicity in rat brain. Nitric Oxide. 23 (4), 289-299 (2010).
  44. Lin, A. M., Chen, C. F., Ho, L. T. Neuroprotective effect of intermittent hypoxia on iron-induced oxidative injury in rat brain. Exp Neurol. 176 (2), 328-335 (2002).
  45. Paul, J., Strickland, S., Melchor, J. P. Fibrin deposition accelerates neurovascular damage and neuroinflammation in mouse models of Alzheimer's disease. J Exp Med. 204 (8), 1999-2008 (2007).
  46. Deumens, R., Blokland, A., Prickaerts, J. Modeling Parkinson's disease in rats: an evaluation of 6-OHDA lesions of the nigrostriatal pathway. Exp Neurol. 175 (2), 303-317 (2002).
  47. Lee, H., Pienaar, I. S. Disruption of the blood-brain barrier in Parkinson's disease: curse or route to a cure. Front Biosci (Landmark Ed. 19, 272-280 (2014).
  48. Jenkins, B. G., et al. Non-invasive neurochemical analysis of focal excitotoxic lesions in models of neurodegenerative illness using spectroscopic imaging). J Cereb Blood Flow Metab. 16 (3), 450-461 (1996).
  49. Chen, X., Lan, X., Roche, I., Liu, R., Geiger, J. D. Caffeine protects against MPTP-induced blood-brain barrier dysfunction in mouse striatum. J Neurochem. 107 (4), 1147-1157 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Kwantificering van het infarctvolumeVerstoring van de bloed-hersenbarrièreEvans Blue-assayTTC-kleuringMuismodel voor beroerteHypoxie-expositieprotocolDuale kwantificeringsmethode
Kwantificering van Neurovasculaire Protection Na Repetitive Hypoxische Voorconditionering en Transient midden cerebrale slagader Occlusie in Muizen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.