Een test voor het meten van de effecten van ethanol de voortbeweging Snelheid<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Samenvatting

C. elegans is een nuttig model voor het bestuderen van de effecten van ethanol op het gedrag. We presenteren een gedragstest die de effecten van ethanol op de bewegingssnelheid van kruipende wormen kwantificeert; zowel de initiële gevoeligheid als de ontwikkeling van acute functionele tolerantie voor ethanol kunnen met deze test worden gemeten.

Samenvatting

Alcoholgebruiksstoornissen zijn een belangrijke publieke gezondheidsproblematiek, waarvoor er weinig effectieve behandelingsstrategieën zijn. Een moeilijkheid die de ontwikkeling van effectievere behandelingen heeft vertraagd, is het relatieve gebrek aan begrip van de moleculaire grondslagen van de effecten van ethanol op het gedrag. De rondworm, Caenorhabditis elegans (C. elegans), biedt een nuttig model om hypothesen te genereren en te testen over de moleculaire effecten van ethanol. Hier beschrijven we een test die is ontwikkeld en gebruikt om de rollen van bepaalde genen en omgevingsfactoren in gedragsreacties op ethanol te onderzoeken, waarbij voortbeweging het gedragsuiterlijk is. Ethanol veroorzaakt dosisafhankelijk een acute depressie van het kruipen op een agaroppervlak. De effecten zijn dynamisch; dieren die aan een hoge concentratie worden blootgesteld, vertonen een initiële sterke depressie van het kruipen, hier verwezen als initiële gevoeligheid, en herstellen vervolgens gedeeltelijk de voortbewegingssnelheid ondanks de aanhoudende aanwezigheid van het medicijn. Deze door ethanol geïnduceerde gedragsplasticiteit wordt hier de ontwikkeling van acute functionele tolerantie genoemd. Deze test is gebruikt om aan te tonen dat deze twee fenotypes onderling verschillend en genetisch te scheiden zijn. De eenvoudige voortbewegingstest die hier wordt beschreven, is geschikt voor het onderzoeken van de effecten van zowel genetische als omgevingsmanipulaties op deze acute gedragsreacties op ethanol in C. elegans.

Inleiding

Stoornissen in alcoholgebruik (AUD) zijn wijdverbreid en veroorzaken ernstige gezondheids-, sociale en economische problemen. Bij mensen wordt de vatbaarheid om een AUD te ontwikkelen sterk beïnvloed door zowel genetica als de omgeving^1,2. Een sterke fysiologische voorspeller van misbruiksgevoeligheid is het initiële responsniveau (LR) op alcohol (ethanol) dat wordt getoond door naïeve drinkers^3-5. Dit LR-fenotype wordt beïnvloed door genetica en niet-genetische componenten⁶. Het bepalen van de moleculaire mechanismen die de LR naar ethanol beïnvloeden, is een belangrijk doel van de studie naar ethanolresponsgedrag.

Protocol

1. Stappen om te presteren op de Dag voor de Assay

1. Pick L4 stadium wormen in de frisse nematode groeimedium (NGM) platen gezaaid met een gazon van OP50 E. coli, en cultuur ze op 20 CO / N. Elke test conditie vereist 10 wormen; pick een overmaat van wormen om voor O / N verlies van wormen.
   1. Alleen assay dieren die de eerste dag volwassenen zijn; vele mutanten groeien in een langzamer tempo dan wild-type. Pas de timing van plukken voor stammen die ontwikkelingsstoornissen vertragingen hebben, zodat alle dieren getest zijn eerste dag volwassenen.

2. Stappen om te presteren op de Dag van de Assay

....

Resultaten

Representatieve gegevens (figuur 1) van verschillende genotypen en hun gepaarde controles worden gepresenteerd ^8,24; gegevens werden specifiek gekozen die highlight verschillen in de geteste dieren. De mate van het effect bij 10 minuten blootstelling wordt beschouwd als de oorspronkelijke gevoeligheid van een stam, die wordt weergegeven aan de linkerkant assen in Figuur 1B-G. Mutante stammen met een relatieve snelheid groter dan de controle 10 min worden geacht resistent etha.......

Discussie

De eenvoudige neurobiologie en genetische hulpmiddelen die beschikbaar zijn in C. elegans maken de worm een uitstekend model om de moleculaire basis van de effecten van ethanol op gedrag te bestuderen. Hier beschrijven we een test die is gebruikt om verschillende moleculaire en milieu mediatoren van acute gedragsreactie tot ethanol ^{8,10,20,24,25} identificeren. Deze methode maakt de differentiatie en gelijktijdig onderzoek van twee verschillende ethanol responsgedrag fenotypes, aanvankelijk gevoelighe.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
C. elegans stammen	Caenorhabditis Genetics Center
60 x 15 mm Petri-schotels, drievoudig geventileerd	Greiner Bio-One	628161	Andere merken platen zijn voldoende.
NGM-agar	Verschillende		NaCl (3 g/L), agar (17 g/L), pepton (2,5 g/L), 1 ml cholesterol (5 mg/ml in ethanol), 1 ml (1 M) MgSO4, 1 ml (1 M) CaCl2, 25 ml (1 M) KPO4, pH=6, 975 ml H2O
Pincet	Verschillende		bijv., Fisher Scientific #10300
37 °C Incubator	Verschillende		Voor het drogen van agar
Digitale balans	Verschillende		Voor het bepalen van plaatgewichten en agarvolume
Koperen ringen	Plumbmaster	STK#35583 (48 cap draad gasket)	1,6 cm binnendiameter, 1,8 cm buitendiameter koperringen
100% ethanol	Verschillende
Parafilm M	Bemis	PM996
CCD-camera	QImaging	RET-4000R-F-M-12	Deze camera heeft een groot gezichtsveld.
Stereomicroscoop met C-mount en 0,5X objectief	Leica	MZ6	Uit productie genomen model, M60 is het huidige equivalent.
Lichtbron	Schott	A08923	3”x3”  achtergrondverlichting voor een gelijkmatige verlichting over het gezichtsveld
Beeldvormings- en trackingsoftware	Media Cybernetics	ImagePro-Plus v6.0-6.3	Nieuwere versies van de software hebben trackingfuncties.