Dit manuscript beschrijft een geautomatiseerde aanpak voor gelgrootteselectie voor het zuiveren van DNA-fragmenten voor next-generation sequencing. De Ranger-technologie biedt volledige automatisering van het gehele proces van agarose gel laden, elektroforetische analyse en herstel van gerichte DNA-fragmenten, waardoor high-throughput en hoge kwaliteit next-generation sequencing bibliotheken mogelijk zijn.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Geautomatiseerde Gel Size Selectie om de kwaliteit van next-generation sequencing bibliotheken Bereid uit Environmental watermonsters Verbeteren
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Next-generation sequencing van omgevingsmonsters kan een uitdaging zijn vanwege de variabele DNA-hoeveelheid en -kwaliteit in deze monsters. Hoge kwaliteit DNA-bibliotheken zijn nodig voor optimale resultaten van next-generation sequencing. Milieumonsters zoals water kunnen een lage kwaliteit en hoeveelheden DNA hebben, evenals contaminanten die meeprecipiteren met DNA. De mechanische en enzymatische processen die betrokken zijn bij extractie en voorbereiding van de bibliotheek kunnen het DNA verder beschadigen. Gelgrootteselectie maakt zuivering en herstel van DNA-fragmenten van een gedefinieerde grootte mogelijk voor sequencing-toepassingen. Desondanks is deze taak een van de meest tijdrovende stappen in het workflow voor DNA-bibliotheekvoorbereiding. Het hier beschreven protocol maakt volledige automatisering van agarose gel laden, elektroforeseanalyse en herstel van gerichte DNA-fragmenten mogelijk.
In deze studie beschrijven we een high-throughput aanpak om hoogwaardige DNA-bibliotheken voor te bereiden uit zoetwatermonsters die ook kunnen worden toegepast op andere omgevingsmonsters. We gebruikten een indirecte aanpak om bacteriecellen uit omgevingszoetwatermonsters te concentreren; DNA werd geëxtraheerd met behulp van een commercieel verkrijgbaar DNA-extractiekit en DNA-bibliotheken werden voorbereid met behulp van een commercieel transposon-gebaseerd protocol. DNA-fragmenten van 500 tot 800 bp werden geselecteerd op grootte in een gel met behulp van Ranger Technology, een geautomatiseerde elektroforese werkstation. Sequencing van de groottegeselecteerde DNA-bibliotheken toonde significante verbeteringen in de lengte en kwaliteit van de sequencing-reads.
Inleiding
Metagenomica omvat de sequentiebepaling van al het genetisch materiaal in een monster om de aanwezige microbiële gemeenschappen te karakteriseren. Het is een complex en duur proces waarbij geëxtraheerde nucleïnezuren worden omgezet in DNA-bibliotheken, gevolgd door volgende generatie sequencing. Hoogwaardige bibliotheken zijn essentieel voor maximale data-output en nauwkeurige metagenomische analyse. Milieumonsters, zoals watermonsters, vormen vaak aanzienlijke uitdagingen voor het genereren van hoogwaardige bibliotheken, vanwege lage hoeveelheden DNA die mogelijk ook gedegradeerd zijn1-3 en de aanwezigheid van remmers van PCR4-6.
Hoogwaardige bibliotheken bestaan idealiter uit langere segmenten DNA binnen een nauwkeurig bepaald bereik van lengtes. Om de hoeveelheid nuttige data per sequencing-run te maximaliseren, moet de lengte van het DNA in de bibliotheek minstens zo lang zijn als de maximale leeslengte van de gebruikte sequencing-methode. Bij gebruik van een sequencing-by-synthesis technologie zoals de Illumina MiSeq, beïnvloedt de grootte van de DNA-fragmenten de efficiëntie waarmee clusters worden gegenereerd op de flowcel. Wanneer een bibliotheek bijvoorbeeld zowel kortere als langere DNA-fragmenten bevat, zullen de kortere fragmenten oververtegenwoordigd zijn in de sequencing-data7,8. Daarentegen zal een bibliotheek met DNA-fragmenten van vergelijkbare grootte evenredig vertegenwoordigd zijn in de sequencing-data. Veel bibliotheekvoorbereidingskits gebruiken ligatie-gebaseerde methoden om adapters aan de DNA-fragmenten toe te voegen en maatselectie is noodzakelijk om adapter-dimers die geen insert bevatten te verwijderen9,10. Er zijn talrijke methoden11,12 om dit te bereiken, maar de techniek die de meest consistente resultaten geeft is de elektroforetische scheiding van DNA gevolgd door de terugwinning van de gewenste lengtes DNA13,14. Dit proces kan handmatig worden uitgevoerd voor een klein aantal monsters, maar wanneer honderden monsters moeten worden verwerkt, zijn geautomatiseerde oplossingen vereist. De momenteel beschikbare platforms voor geautomatiseerde gelmaatselectie hebben een lage doorvoer en er zijn nieuwe platforms nodig om grote aantallen monsters voor sequencing te verwerken. De Ranger Technology kan worden geïntegreerd met bestaande liquid handling werkstations om het gebruik van agarose gelelektroforese voor maatselectie en analytische doeleinden mogelijk te maken op een schaal die voldoet aan de huidige high-throughput omgeving.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Water Collection en Filtration
- Verzamel zoetwater monsters uit verschillende plaatsen (Figuur 1). Ga monsters door een reeks filters: 1 um filter, 0,2 urn filter, en 30 kDa cutoff tangentiële filter systematisch afzonderlijke eukaryote, bacteriële en virale deeltjes, respectievelijk.
Opmerking: Alleen de zuivering en analyse van de teruggewonnen op de filters 0,2 urn (vrijlevende bacteriën) wordt beschreven in dit rapport, maar soortgelijke aanpak kan worden gebruikt voor andere deeltjes teruggewonnen uit de filters.
2. Bacteriële Concentratie, DNA-extractie en zuivering
- Verwijder de 0,2 pm membraanfilter (s) vanaf het waterfiltratie (schematisch diagram, figuur 2). Vouw de 0,2 um disc filter in de helft en plaats deze in een 50 ml buis met de open kant naar boven. Voeg 5 ml van 1x fosfaat gebufferde oplossing (PBS) en 0,01% Tween, pH 7.4 inde buis. Indien meer dan één filter gebruikt tijdens het proces gebruiken een verschillende buis per filter. Store tube (s) met filter bij 4 ° C totdat verwerkt. Anders, ga verder met stap 2.2.
- Verwijder de 0,2 pm membraan filter van de 50 ml buis met een steriel pincet. Plaats op een petrischaal filter (s) (laat de PBS-buffer in de buis).
- Met een steriel pincet en een steriele schaar, knip de filter in kleine stroken (1 cm x 1 cm). Ontsmet tang en schaar door het weken in 70% isopropanol, vegen met een DNA-oppervlak ontsmettend en spoelen met ultrapuur water van type 1 tussen de verschillende monsters.
- Plaats het filter in reepjes gesneden terug in dezelfde buis van 50 ml. Voeg 10 ml 1x PBS en 0,01% Tween, pH 7,4 om het filter zodat er in totaal 15 ml buffer in de 50 ml buis.
- Voeg 6 schoon wolfraam kralen (3 mm diameter) aan elke 50 ml tube, hebben betrekking op de buis met Parafilm, en vortex krachtig gedurende 20 min (gebruik 50 ml buisjes vortex adapter). Als multIPLE filters zijn uit één monster, de overdracht en het zwembad alle homogenisaat verwerkt in een schone 50 ml buis. Centrifugeer de buizen bij 3300 xg gedurende 15 min bij 4 ° C.
- Resuspendeer de pellet en monster bacteriële cellen (~ 1 ml hoeveelheden) in 1,7 ml microcentrifuge buizen. Merk op dat er 5 reactievaatjes per monster.
- Spin down de microcentrifugebuizen bij 10.000 xg gedurende 10 min, en verwijder het grootste deel van de bovenstaande vloeistof naar beneden tot ~ 200 ul merk.
- Bewaar de monsters bij -80 ° C, of naar het bacterieel DNA extraheren met behulp van een commercieel verkrijgbare DNA isolatie kit volgens de instructies van de fabrikant. Tijdens bacterieel DNA-extractie gebruik ofwel PBS of water als een negatieve extractie controle, en E. coli als een positieve controle extractie.
- Omdat DNA van meerdere buizen worden uitgepakt, bundelen parallelle sub-monsters uit hetzelfde monster in een 2 ml buis. Vervolgens een O / N precipitatie met een oplossing bestaande uit 0,1volume van 3 M natriumacetaat, 2 volumes 100% ethanol en 5 ui 5 ug / ul lineaire acrylamide. Meng goed en bewaar monsters bij -80 ° C.
- Centrifugeer bij maximale snelheid (17000 xg) gedurende 30 min bij 4 ° C. Was pellet met 1 ml ijskoude 70% ethanol, drogen in een bio kast niet meer dan 5 minuten en resuspendeer DNA pellet in 34 ui 10 mM Tris-Cl, pH 8,5.
Opmerking: lineaire acrylamide helpt DNA pellet visualiseren na de O / N precipitatie. - Bepaal DNA kwantiteit en kwaliteit met een hoge gevoeligheid fluorescerende nucleïnezuur kwantificatie assay en een microvolume spectrofotometer respectievelijk de instructies van de fabrikant (zie Tabel Materials).
Opmerking: Indien meerdere monsters worden bereid in de tijd kan een ultragevoelige fluorescerende nucleïnezuur assay voor het kwantificeren dsDNA en plaat-gebaseerde fluorometer / spectrofotometer worden gebruikt.
3. DNA Bibliotheek Voorbereiding
- Normaliseren bacterieel genomisch DNA geëxtraheerd uit watermonsters tot een concentratie van ongeveer 0,2 ng / ul.
- Enzymatisch fragment één nanogram van bacterieel DNA met een transposon-gebaseerde werkwijze (tagmentation). Voeg adapter en index sequenties op gefragmenteerd DNA volgens de instructies van de fabrikant. Onder tagmented monsters 12 cycli van PCR zoals is aangegeven in de instructies van de fabrikant, waarna de sequentie indexen zijn opgenomen.
4. Geautomatiseerde Gel Grootte Selectie
- Skip standaard post-PCR clean-up stap in de instructies van de fabrikant beschreven (zie tabel van Materialen). Maat selecteren post-PCR monsters direct behulp van een geautomatiseerd gel gebaseerde grootte selectie platform.
- Voeg 3,5 gl laadbuffer aan elk monster.
- Volgens het protocol van de fabrikant, laadt de monsters op de elektroforese werkstation, het opgeven van een grootte-selectie doelstelling van 500-800 bp, in een 300 ul extractionenvolume, met behulp van een pre-cast 1,5% agarose cassette.
- Concentreer de ruwe uitvoer materiaal (300 ul) tot 25 pi via ethanolprecipitatie.
Opmerking: U kunt ook gebruik maken van de elektroforese werkstation om de concentratie te automatiseren voor grotere aantallen monsters via filter plaat en vacuümspruitstuk.- Neerslag ruwe elutievolume toepassing van 0,1 volumina van 3 M natriumacetaat, 2 volumes 100% ethanol en 5 ui 5 ug / ul lineaire acrylamide. Meng goed, plaats monsters bij -80 ° CO / N. Centrifugeer de monsters bij 17.000 xg gedurende 30 min.
- Gooi supernatanten en ga verder met DNA pellet te wassen met 1 ml ijskoude 70% ethanol.
- Centrifugeer monsters weer bij 17.000 xg gedurende 30 min, gooi supernatant, drogen en tenslotte resuspendeer DNA pellet in 25 ui 10 mM Tris-Cl, pH 8,5.
- (Optioneel) Gebruik 1 ui van DNA-bibliotheken grootte geselecteerd met de geautomatiseerde gel grootte selectie platform om een vijf makenvoudige verdunning met Tris-EDTA-buffer, pH 8,0. Analyseer bibliotheken met een chip gebaseerde capillaire elektroforese instrument dsDNA kwaliteit analyse volgens instructies van de fabrikant.
5. Bibliotheek Normalisatie en Sequencing
- Ga verder met monsters met behulp van de bibliotheek normalisering kralen (inbegrepen in de transposon-gebaseerde voorbereiding bibliotheek kit) zoals beschreven in het klaarmaken van de fabrikant te normaliseren.
- U kunt ook meten dsDNA bibliotheken met een hoge gevoeligheid fluorescerende nucleïnezuur kwantificatie test, gevolgd door het poolen bij equimolaire verhoudingen tot een uiteindelijke dsDNA concentratie van 2 nM bereiken. Ga naar bibliotheken met 10 ui gepoolde bibliotheken en 10 pl 0,2 N NaOH denatureren, incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verdun gedenatureerd bibliotheken met hybridisatie buffer (geleverd bij de transposon gebaseerde preparaat kit) tot een eindvolume van 1 ml en de concentratie van 11:05.
- Load monsters in een next-generation sequencing platform door het volgen van standaard sequencing protocollen van de fabrikant.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
DNA-concentratie, en Quality Assessment
Bacterieel DNA-concentraties varieerden 0,01-0,11 ng / ml per watermonster van de verschillende waterscheiding sites (Tabel 1). DNA geïsoleerd uit bacteriële fractie had A 260/280 en 260/230 A verhoudingen van 1,4-1,8 en 0,3-1,6, respectievelijk. Hoewel sommige van de A 260/230 ratio relatief laag werd geen duidelijke inhibitie waargenomen in de bereide bibliotheek en andere afgeleide...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De aanwezigheid van de adapter dimeren en clustering van kleine insert maten voorkeur worden gesequenced in de huidige platforms vertegenwoordigen een afname van de bruikbare opbrengst en onderbenutting van de apparatuur capaciteit 15. Het gebruik van kralen slaan methoden gekoppeld met een transposon gebaseerde benadering bibliotheken te bereiden, kan leiden tot DNA afschuiving in vergelijking met andere werkwijzen voor extractie 4,5. Niettemin zijn alle extractie- en bibliotheek bereiding mogelij...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Jared R. Slobodan en Matthew J. Nesbitt zowel aandelen houden van Coastal Genomics, een particulier British Columbia corporatie het aanbieden van de Ranger Technology.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gefinancierd door Genome BC, Genome Canada en Coastal Genomics. De auteurs danken Kirby Cronin en Michael Chan voor hun hulp bij het verzamelen en verwerken van monsters. We willen ook Thea Van Rossum en Dr. Fiona Brinkman bedanken voor hun hulp bij bioinformatica.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Peristaltic pump Masterflex P/S 1400 Series | Thermo Scientific | 1400-1620 | |
| 0.2 µm Supor Membrane | VWR | CA28143-969 | Pall Corporation, Ann Harbor, MI |
| Tungsten carbide beads 3 mm (200) | Qiagen | 69997 | |
| Isopropyl alcohol 70% | Jedmon Products | 825751 | Healthcare Plus |
| DNA away | VWR | 7010 | Molecular BioProducts, Inc. San Diego, CA |
| Milli-Q water purification system | Fisher Scientific | ZMQS6VF0Y | Merck Millipore. Dit systeem is stopgezet. |
| 20x PBS pH 7.5 | VWR | E703-1L | Amresco, Inc., Solon, OH |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | Fisher chemicals |
| Vortex adapter for 2 (50 ml) tubes | VWR | 13000-V1-50 | MoBio, Carlsbad, CA |
| Vortex-Genie 2, 120 V (Model G560) | VWR | SI-0236 | Scientific Industries, Inc. |
| Beckman Centrifuge | Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd | Model J-6B | |
| PowerLyzer Powersoil DNA isolation kit | VWR | 12855-100 | MoBio, Carlsbad, CA |
| Vortex adapter for 24 (1.5-2 ml) tubes | VWR | 13000-V1-24 | MoBio, Carlsbad, CA |
| Microfuge 18 centrifuge | Beckman Coulter | 367160 | |
| Nimbus Select workstation met Ranger Technology | Hamilton Robotics | 92720-01 | Inclusief de liquid handling werkstation en geïntegreerde Ranger Tech (elektroforese hardware) |
| Ranger reagent kit | Coastal Genomics | CG-10600-150-12-21 | Inclusief laadbuffer en cassettes |
| Ethyl alcohol (anhydrous) | Commercial Alcohols | P016EAAN | Greenfield Ethanol |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889-250G | |
| Linear acrylamide (5 mg/ml) | Life Technologies | AM9520 | Ambion |
| Eppendorf gekoelde centrifuge | Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd. | 5417R | |
| Buffer EB (250 ml) | Qiagen | 19086 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Qubit fluorometer | Life Technologies | Q32857 | Invitrogen. Dit product is stopgezet. |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Life Technologies | Q32854 | Invitrogen |
| High sensitivity DNA reagent | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| High sensitivity DNA chips | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Agilent 2011 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2938B | |
| Nextera XT DNA sample preparation kit | Illumina | FC-131-1024 | |
| Nextera XT index kit | Illumina | FC-131-1001 | |
| MiSeq reagent kit v2 (500-cycles) | Illumina | MS-102-2003 | |
| Miseq systeem | Illumina | SY-410-1003 |
Referenties
- Siuda, W., Chrost, R. J. Concentration and susceptibility of dissolved DNA for enzyme degradation in lake water - some methodological remarks. Aquatic Microbial Ecology. 21, 195-201 (2000).
- Butler, J. M., Hill, C. R. Scientific Issues with Analysis of Low Amounts of DNA. , Available from: http://www.promega.ca/resources/profiles-in-dna/2010/scientific-issues-with-analysis-of-low-amounts-of-dna (2010).
- Ficetola, G. F., Miaud, C., Pompanon, F., Taberlet, P. Species detection using environmental DNA from water samples. Biology letters. 4, 423-425 (2008).
- Liles, M. R., et al. Recovery, purification, and cloning of high-molecular-weight DNA from soil microorganisms. Applied and environmental microbiology. 74, 3302-3305 (2008).
- Bey, B. S., Fichot, E. B., Dayama, G., Decho, A. W., Norman, R. S. Extraction of high molecular weight DNA from microbial mats. BioTechniques. 49, 631-640 (2010).
- Tebbe, C. C., Vahjen, W. Interference of humic acids and DNA extracted directly from soil in detection and transformation of recombinant DNA from bacteria and a yeast. Applied and environmental microbiology. 59, 2657-2665 (1993).
- Solonenko, S. A., et al. Sequencing platform and library preparation choices impact viral metagenomes. BMC genomics. 14, 320(2013).
- Aird, D., et al. Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries. Genome biology. 12, R18(2011).
- Quail, M. A., Swerdlow, H., Turner, D. J., et al. Improved protocols for the illumina genome analyzer sequencing system. Current protocols in human genetics / editorial board, Jonathan L. Haines .. [et al.]. 18, 18(2009).
- Head, S. R., et al. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. BioTechniques. 56, 61-64, 66, 68 (2014).
- Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias. Experimental cell research. 322, 12-20 (2014).
- Grunenwald, H., Baas, B., Caruccio, N., Syed, F. Rapid, high-throughput library preparation for next-generation sequencing. Nature Methods. 7, (2010).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning : a laboratory manual. , 3rd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (2001).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of visualized experiments. , (2012).
- Quail, M. A., et al. A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system. Nature methods. 5, 1005-1010 (2008).
- Marine, R., et al. Evaluation of a transposase protocol for rapid generation of shotgun high-throughput sequencing libraries from nanogram quantities of DNA. Applied and environmental microbiology. 77, 8071-8079 (2011).
- Rohland, N., Reich, D. Cost-effective high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome research. 22, 939-946 (2012).
- Lamble, S., et al. Improved workflows for high throughput library preparation using the transposome-based nextera system. Bmc Biotechnology. 13, (2013).
- Picelli, S., et al. Tn5 transposase and tagmentation procedures for massively scaled sequencing projects. Genome research. , (2014).
- Rhodes, J., Beale, M. A., Fisher, M. C. Illuminating Choices for Library Prep: A Comparison of Library Preparation Methods for Whole Genome Sequencing of Cryptococcus neoformans Using Illumina HiSeq. PloS One. 9, e113501(2014).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
