Vereenvoudigde Human Neutrophil Extracellular traps (NET) Isolatie en Handling

Samenvatting

In de onderstaande voorschriften beschrijven we een zeer eenvoudige manier om neutrofielen extracellulaire vallen (NET) uit humaan totaal bloed met gemakkelijk beschikbare reagentia isoleren. Wij dan tonen hoe de geïsoleerde netten kunnen worden gebruikt in een in vitro adhesietest met kankercellen.

Samenvatting

Neutrofielen Extracellular traps (NET) zijn onlangs geïdentificeerd als onderdeel van antimicrobiële armamentarium de neutrofielen's. Naast hun rol bij de bestrijding van infecties, heeft recent onderzoek aangetoond dat zij betrokken zijn bij vele ziekteprocessen, met inbegrip van kanker progressie. Isoleren gezuiverd NET is een cruciaal element om de studie van deze functies mogelijk te maken.

In deze video tonen we een vereenvoudigde werkwijze voor celvrije NET isolatie uit humaan totaal bloed met gemakkelijk beschikbare reagentia. Geïsoleerde netten kunnen vervolgens worden gebruikt voor immunofluorescentie kleuring, blotting of verschillende functionele assays. Dit maakt een beoordeling van hun biologische eigenschappen bij afwezigheid van de mogelijke verstorende effecten van neutrofielen zelf.

Een dichtheid gradiënt scheidingstechniek toegepast om neutrofielen uit gezonde donor volbloed te isoleren. Geïsoleerde neutrofielen worden dan gestimuleerd door forbol 12-myristate 13-acetaat (PMA) aan NETosis induceren. Geactiveerde neutrofielen worden dan weggegooid, en een cel-vrij NET voorraad wordt verkregen.

Vervolgens hebben we zien hoe geïsoleerd netten kunnen worden gebruikt in een adhesietest met A549 menselijke longkankercellen. De NET voorraad wordt gebruikt voor het bekleden van de putjes van een 96 putjes celkweekplaat O / N, en na een adequate NET monolagen bodem van de putjes, CFSE gelabelde A549 cellen worden toegevoegd. Hechtende cellen worden gekwantificeerd met behulp van een Nikon TE300 fluorescentiemicroscoop. In sommige putten, wordt 1000U DNAse1 10 min voordat het tellen naar NET degraderen toegevoegd

Inleiding

Neutrofielen extracellulaire vallen (NET) zijn nieuw ontdekte neutrofiel-afgeleide elementen opgebouwd uit strengen van extracellulair DNA ingericht door honderden eiwitten en histonen. Zij worden uitgescheiden door neutrofielen in de context van infectie en ontsteking na specifieke stimuli en werden initieel gedeelte van afweermechanismen neutrofielen tegen infecties. Ze werden voor het eerst getoond aan het opsluiten van verschillende microbiële indringers zoals bacteriën, virussen en schimmels ^1-3 te bevorderen. Het vangen van de microbe zou dan leiden tot de vernietiging zowel direct door-NET-geassocieerde eiwitten ^3,4 en indirect via de lokale werving van fagocyterende cellen ^5,6. De rol van NET betekent echter niet te worden beperkt tot de verdediging te organiseren. Recenter bleken ze een belangrijke rol in auto-immuunziekten ^7,8 spelen, trombose ^9, zwangerschap gerelateerde aandoeningen ¹⁰ en zelfs progressie van kanker^11,12. Derhalve blijkt dat NET spelen een belangrijke rol in een groot aantal verschillende fysiologische processen. Gezien het nieuwe karakter van dergelijk onderzoek, nog veel worden toegelicht met betrekking tot de mechanismen die NET hun werking uitoefenen. Hierin presenteren we een vereenvoudigde werkwijze voor de isolatie van netten voor de afwezigheid van neutrofielen.

In de volgende video, demonstreren we een eenvoudige en gemakkelijke techniek om NET's uit humaan totaal bloed geïsoleerd. Celvrije netten kunnen vervolgens worden gebruikt in verschillende in vitro experimenten, waaronder kleuring imuunofluorescence, evenals blotting een aantal testen zoals hechting, proliferatie en migratie. Andere protocollen bestaan ^{​​13, 19,} maar ze zijn vaak langdurig, ingewikkeld, duur en vaak lage opbrengst ^13. Deze vereenvoudigde protocol gebruikt basische reagentia en vermindert het aantal stappen om neutrofielen te isoleren, dus het minimaliseren van de lengte van de procedure terwijl het maximaliseren van de opbrengst.

De volgende methode combineert verschillende technieken voor neutrofielen isolatie eerder in de literatuur beschreven van een eenvoudig protocol waarbij een zeer zuiver monster van levende neutrofielen verkrijgen. Zoals voorgesteld in de literatuur, wordt veneus bloed in EDTA-buizen en binnen 10 minuten tot neutrofiel activatie ¹⁴ voorkomen. We gebruiken lymfocyt scheidingsmedium (LSM) dichtheidsgradiënt centrifugering granulocyten en rode bloedcellen te isoleren uit gehepariniseerd volbloed, een aangepaste werkwijze uit de Ficoll dichtheidscentrifugatie techniek oorspronkelijk beschreven door Boyum et al ^15. LSM is een modificatie van de Boyum formulering die natrium diatrizoaat vervangt het natrium metrizoate en is met succes gebruikt in veel studies neutrofielen ^16-18 isoleren.

Na differentiële dichtheid centrifugatie, monocyten en lymfocyten worden verwijderd; rode bloedcellen worden vervolgens gesedimenteerdmet een 6% dextran-oplossing ¹⁴ en de overblijvende rode bloedcellen worden gelyseerd om een populatie van zuivere neutrofielen, die wordt gecontroleerd met trypan blauw en methyleenblauw kleuring te verkrijgen.

Talrijke middelen zijn gebruikt om NETosis induceren zowel in vitro als in vivo, waaronder lipopolysaccharide (LPS) en forbolmyristaatacetaat (PMA) en interleukinen (IL-8) ^3,5,6. In het volgende protocol worden geïsoleerde neutrofielen gestimuleerd met 500 nM PMA gedurende 4 uur, waarvan is aangetoond dat een voldoende concentratie consistente en betrouwbare nettovorming toestaan ​​zonder bevorderen apoptose ^19,20 zijn.

Na isolatie tonen we hoe celvrije NET verkregen van de protocol kan worden gebruikt in een adhesietest. DNAse1 wordt gebruikt verteerbaar en degraderen NET eerder beschreven en dus dient als controle ^2,3,11. Andere opties zijn het gebruik van neutrofielelastase remmer (NEI) naar NET formati remmenop, hetgeen een aanvaardbaar alternatief wanneer het doel is het NET te remmen dan bewerkstelligen de afbraak ervan ^11. Hoewel NEI heeft een aantal zeer gevarieerde functies, is eerder aangetoond dat NET depositie kan worden geremd door NEI door verstopping van chromatine decondensatie, nucleaire degranulatie en neutrofielen dood ¹²

Protocol

OPMERKING: Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de lokale institutionele ethische richtlijnen.

1. Bloed Tekening

1. Door antecubitale venipucture, verzamel 14 buisjes bloed van een gezonde vrijwilligers in groene top (heparine) buizen en omkeren elke buis voor de afwikkeling op het ijs. Verzamel bloed binnen 10-15 min van experiment om optimale neutrofielen opbrengst te garanderen.

2. neutrofielen Isolatie van volbloed

1. Was beide groene bovenbuis bloed met 5 ml PBS zonder Ca en Mg om het bloed te verdunnen. In elk van 4 x 50 ml conische buizen, voeg 15 ml van lymfocyt scheidingsmedium (LSM) bij kamertemperatuur. Met behulp van een 18 G naald gemonteerd op een spuit 60 ml, het verdunde bloed op de LSM zorgvuldig te laag, waardoor een scherpe LSM-bloed-interface.
   OPMERKING: Meng geen van de lagen zoveel mogelijk.
2. Centrifugeer bij 800 xg gedurende 30 min bij 21 ° C zonder onderbreking.
   OPMERKING: Plotselinge pauzes kanveroorzaken mengen van de verschillende lagen.
3. Let op de erytrocyten en neutrofielen sediment op de bodem. Zuig en gooi de bovenste 2 lagen (plasma en LSM) en zorg ervoor om zich te ontdoen van de interface tussen deze lagen die lymfocyten en mononucleaire cellen bevat, waardoor alleen de onderste rode laag.
4. Aan elke buis, voeg 20 ml fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS) en 20 ml 6% dextran oplossing. Voorzichtig omkeren elke buis te mengen met de laag van erytrocyten en neutrofielen en laat zitten bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
   LET OP: Dit zal toelaten rode bloedcellen (RBC) aan sediment op de bodem.
5. Na 30 min, de overdracht van de neutrofielen rijke supernatant in de frisse buizen en gooi de RBC pellets. Centrifugeer supernatanten 450 xg bij 4 ° C gedurende 5 min. Na het centrifugeren, gooi supernatant. De pellet zal vooral neutrofielen en weinig rode bloedcellen bevatten.
6. Bereid een lyserende oplossing door het toevoegen van 0,5 ml lysisbuffer met 4,5 ml steriel water. Lyse resterende RBC met thij bereid 5 ml lyseren oplossing overdracht van deze geresuspendeerde pellets in een buis. Laat lysis bij kamertemperatuur in het donker gedurende 10 min.
7. Centrifugeer bij 450 xg bij 4 ° C gedurende 5 min. Verwijder supernatant en pellet wassen met 5 ml PBS zonder Ca en Mg en centrifugeer weer bij 450 xg bij 4 ° C te ontdoen van de resterende lyserende oplossing. De verkregen op dit punt pellet bevat de neutrofielen. Resuspendeer de pellet in 30 ml koud 3% RPMI en op ijs gezet.
   Opmerking 3% RPMI wordt gemaakt door aanvulling RPMI medium met 3% foetaal runderserum (FBS)
8. Controleer zuiverheid van het monster met behulp van Methyleenblauw vlekken. > 95% van de cellen moet granulocyten met multi-lobaire kernen. Gebruik Trypaan blauwe vlekken te controleren> 95% levensvatbaarheid van cellen en tel de laatste neutrofielen opbrengst. Verdun neutrofielen in ijskoude 3% RPMI tot een eindconcentratie van 5 x 10 ⁶ neutrofielen / ml.

3. NET Generation

1. Stimuleer neutrofielen met 500 nM van PMA (per 30 ml neutrofielen oplossing) en incubeer op een 150 x 25mm platte weefselkweekplaat met 20 mm rooster gedurende 4 uur bij 37 ° C 5% _CO2. Dit zal NETosis toelaten.
2. Na 4 uur stimulatie, Zuig en de media te verwijderen, waardoor de laag van NET en neutrofielen gehecht aan de onderzijde. Laat deze laag niet verstoren.
3. Met een totaal van 15 ml koud PBS zonder Ca en Mg per schaaltje, was de bodem van de schaaltjes pipetteren 15 ml PBS op de bodem van de schaal om tillen alle aanhangend materiaal van de bodem.
4. Verzamel oplossing verkregen wassen elke schaal (stap 3.3) in een 15 ml conische buis en centrifugeer gedurende 10 min bij 450 xg bij 4 ° C. Neutrofielen en eventuele resterende cellen pellet op de bodem, waardoor een celvrij NET-rijk supernatant.
5. Verdeel supernatant in 1,5 ml micro-centrifugebuizen en centrifugeren gedurende 10 min bij 18.000 xg bij 4 ° C. Hierdoor kunnen alle DNA te pellet.
   OPMERKING: Centrifugeren in grotere tubes gemakkelijker en minder tijdrovend als dergelijke hoge snelheden kunnen worden bereikt op de normale centrifuge, anders moet supernatanten in kleinere buizen splitsen om hoge snelheid micro-centrifuge gebruikt.
6. Verwijder supernatant en resuspendeer alle pellets verkregen samen in ijskoude PBS tot een concentratie overeenkomend met 2 x 10 ⁷ neutrofielen per 100 pl PBS. Dit zal de opbrengst celvrije NET stock die kunnen worden gebruikt voor verdere experimenten.
7. Meet DNA-concentratie in de verkregen met behulp van spectrofotometrie of alternatieve DNA kwantificering hulpmiddel monster. 180 ng / ul - een adequate concentratie in het monster moet tussen de 140 variëren.

4. NET-Cancer Cell Statische aantrekkingskracht Assay

1. Voeg 100 ul van de eerder verkregen NET voorraad per putje in een 96 putjes vlakke bodemplaat en laten bekleden putjes O / N bij 4 ° C in het donker.
2. Tussen 12 en 20 uur later, verifiëren vorming van een uniforme monolaag van cellengratis NET onderaan de putjes onder de microscoop (Figuur 1). Op dit moment, Zuig alle niet-hechtend materiaal uit de putjes en zorg om netwerktoegang niet monolaag onderaan verstoren.
3. Voeg 100 pi van 1% runderserumalbumine (BSA) blokkeren aan elke well en laat gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
4. Maak A549 kankercellen uit een T-75 kolf met 2 ml 0,25% trypsine oplossing. Eenmaal los, voeg 10 ml A549 media om cellen getrypsiniseerd en centrifugeer bij 450 xg bij 4 ° C gedurende 5 min. Verwijder supernatant en resuspendeer cellen in medium tot een concentratie van 2 x10 ⁴ kankercellen per 100 pl media verkrijgen.
   OPMERKING: A549-cellen werden afzonderlijk gekweekt. In het kort, cellen werden gekweekt en gehouden in DMEM F12 medium met 10% FBS en 1% penicilline streptomycine en geïncubeerd bij 37 ° C 5% _CO2. Wanneer 70-80% celconfluentie bereikt, werden ze losgemaakt met 0,25% trypsine-EDTA en opnieuw gesuspendeerd in dezelfde mediahierboven beschreven.
5. Stain kankercellen met CFSE door toevoeging van 1 pi van CFSE per ml medium en laat vlek bij kamertemperatuur gedurende 10 min. Na het kleuren centrifuge beneden 450 xg bij 4 ° C gedurende 5 min gooi supernatant en resuspendeer cellen oorspronkelijke volume medium tot een concentratie van 2 x10 ⁴ kankercellen per 100 pl media verkrijgen.
6. Na 1 uur NET blokkeren, zacht aspireren blokkeeroplossing en voeg 2 x10 ⁴ kankercellen in media, wat overeenkomt met 100 pl per put via NET monolaag en laat zich gedurende 90 minuten bij 37 ° C 5% _CO2. Zuig de cellen en voeg 100 ul van PBS aan elk putje alle niet hechtende cellen te wassen.
7. In sommige putten, voegen 1000U van DNAse1 per putje gedurende 10 minuten vóór het wassen aan NET degraderen. Dit zal als negatieve controle te dienen. In andere putjes, 100 ul steriel water per putje gedurende 10 minuten, die zal dienen als vehikel controle (VC).
   OPMERKING: 3 repliceert per condition worden meestal uitgevoerd monster vergroten.
8. Zuig en al in de putjes waardoor alleen NET en hechtende kankercellen onderaan ontdoen. Voeg 100 ul van 4% formaldehyde-oplossing per putje hechtende kankercellen vast netten en lees assay onder de fluorescentiemicroscoop (figuur 1). Plot de resultaten te analyseren (Figuur 3).

Resultaten

Succesvolle voltooiing van een statische adhesietest met NET een adequate bekleding van de putjes met een monolaag van NET vóór de toevoeging van kankercellen (figuur 1). Alle volgende stappen moeten worden gedaan met de zorg die laag niet te verstoren. Wanneer een voldoende laag NET is gevormd, wordt verwacht aanzienlijke kankercellen adhesie netten zoals getoond in figuur 2A en 2C zien. Dit effect wordt opgeheven door de toevoeging van DNAse1 die NET degradeert gezien...

Discussie

De neutrofielen extracellulaire Trap isolatie protocol gedemonstreerd in deze video combineert verschillende technieken die gebruikt worden in de literatuur voor neutrofielen isolatie en NET formatie. Het vereenvoudigt een vrij complex en variabel proces en biedt een zeer betrouwbare en reproduceerbare manier om gezuiverd cel-vrije NET's met minder stappen dan andere protocollen te isoleren. Bovendien zijn gemakkelijk verkrijgbaar reagentia toe te voegen aan de protocollen eenvoud en de kosten aanzienlijk vermindere...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS), Modified, without calcium chloride and magnesium chloride	Wisent	311-425-CL
Lymphocyte Separation Medium (LSM)	Wisent	305-010-CL
Dextran hydrochloride (poeder)	Spectrum	DE130	6% Dextran-oplossing wordt gemaakt door PBS aan te vullen met Ca en Mg met 6% Dextran-poeder
RPMI-1640 Medium with L-glutamine	Wisent	350-000-CL	3% RPMI-oplossing wordt gemaakt door RPMI aan te vullen met 3% foetaal runderserum
BD Pharm Lyse Lysing buffer	BD Biosciences	555899
Phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA)	Sigma-Aldrich	P8139
DNAse1	Roche	11284932001
F12 DMEM	Wisent	319-075-CL
Foetaal runderserum (FBS)	Wisent	080-150
Penicilline/Streptomycine	Gibco	15140-122
CFSE	Invitrogen	C1157
0,25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
Integrid weefselkweekschaal met 20 mm raster (150 x 25 mm)	Falcon	353025