In de onderstaande voorschriften beschrijven we een zeer eenvoudige manier om neutrofielen extracellulaire vallen (NET) uit humaan totaal bloed met gemakkelijk beschikbare reagentia isoleren. Wij dan tonen hoe de geïsoleerde netten kunnen worden gebruikt in een in vitro adhesietest met kankercellen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Vereenvoudigde Human Neutrophil Extracellular traps (NET) Isolatie en Handling
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Neutrofielen Extracellular traps (NET) zijn onlangs geïdentificeerd als onderdeel van antimicrobiële armamentarium de neutrofielen's. Naast hun rol bij de bestrijding van infecties, heeft recent onderzoek aangetoond dat zij betrokken zijn bij vele ziekteprocessen, met inbegrip van kanker progressie. Isoleren gezuiverd NET is een cruciaal element om de studie van deze functies mogelijk te maken.
In deze video tonen we een vereenvoudigde werkwijze voor celvrije NET isolatie uit humaan totaal bloed met gemakkelijk beschikbare reagentia. Geïsoleerde netten kunnen vervolgens worden gebruikt voor immunofluorescentie kleuring, blotting of verschillende functionele assays. Dit maakt een beoordeling van hun biologische eigenschappen bij afwezigheid van de mogelijke verstorende effecten van neutrofielen zelf.
Een dichtheid gradiënt scheidingstechniek toegepast om neutrofielen uit gezonde donor volbloed te isoleren. Geïsoleerde neutrofielen worden dan gestimuleerd door forbol 12-myristate 13-acetaat (PMA) aan NETosis induceren. Geactiveerde neutrofielen worden dan weggegooid, en een cel-vrij NET voorraad wordt verkregen.
Vervolgens hebben we zien hoe geïsoleerd netten kunnen worden gebruikt in een adhesietest met A549 menselijke longkankercellen. De NET voorraad wordt gebruikt voor het bekleden van de putjes van een 96 putjes celkweekplaat O / N, en na een adequate NET monolagen bodem van de putjes, CFSE gelabelde A549 cellen worden toegevoegd. Hechtende cellen worden gekwantificeerd met behulp van een Nikon TE300 fluorescentiemicroscoop. In sommige putten, wordt 1000U DNAse1 10 min voordat het tellen naar NET degraderen toegevoegd
Inleiding
Neutrofielen extracellulaire vallen (NET) zijn nieuw ontdekte neutrofiel-afgeleide elementen opgebouwd uit strengen van extracellulair DNA ingericht door honderden eiwitten en histonen. Zij worden uitgescheiden door neutrofielen in de context van infectie en ontsteking na specifieke stimuli en werden initieel gedeelte van afweermechanismen neutrofielen tegen infecties. Ze werden voor het eerst getoond aan het opsluiten van verschillende microbiële indringers zoals bacteriën, virussen en schimmels 1-3 te bevorderen. Het vangen van de microbe zou dan leiden tot de vernietiging zowel direct door-NET-geassocieerde eiwitten 3,4 en indirect via de lok....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
OPMERKING: Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de lokale institutionele ethische richtlijnen.
1. Bloed Tekening
- Door antecubitale venipucture, verzamel 14 buisjes bloed van een gezonde vrijwilligers in groene top (heparine) buizen en omkeren elke buis voor de afwikkeling op het ijs. Verzamel bloed binnen 10-15 min van experiment om optimale neutrofielen opbrengst te garanderen.
2. neutrofielen Isolatie van volbloed
- Was beide groene bovenbuis bloed met 5 ml PBS zonder Ca en Mg om het bloed te verdunnen. In elk van 4 x 50 ml conische buizen, voeg 15 ml van lymfo....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Succesvolle voltooiing van een statische adhesietest met NET een adequate bekleding van de putjes met een monolaag van NET vóór de toevoeging van kankercellen (figuur 1). Alle volgende stappen moeten worden gedaan met de zorg die laag niet te verstoren. Wanneer een voldoende laag NET is gevormd, wordt verwacht aanzienlijke kankercellen adhesie netten zoals getoond in figuur 2A en 2C zien. Dit effect wordt opgeheven door de toevoeging van DNAse1 die NET degradeert gezien.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De neutrofielen extracellulaire Trap isolatie protocol gedemonstreerd in deze video combineert verschillende technieken die gebruikt worden in de literatuur voor neutrofielen isolatie en NET formatie. Het vereenvoudigt een vrij complex en variabel proces en biedt een zeer betrouwbare en reproduceerbare manier om gezuiverd cel-vrije NET's met minder stappen dan andere protocollen te isoleren. Bovendien zijn gemakkelijk verkrijgbaar reagentia toe te voegen aan de protocollen eenvoud en de kosten aanzienlijk vermindere.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen
Dankbetuigingen
De auteurs willen Dr. Paul Kubes danken voor zijn begeleiding en mentorschap die centraal stonden bij de totstandkoming van dit werk.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS), Modified, without calcium chloride and magnesium chloride | Wisent | 311-425-CL | |
| Lymphocyte Separation Medium (LSM) | Wisent | 305-010-CL | |
| Dextran hydrochloride (poeder) | Spectrum | DE130 | 6% Dextran-oplossing wordt gemaakt door PBS aan te vullen met Ca en Mg met 6% Dextran-poeder |
| RPMI-1640 Medium with L-glutamine | Wisent | 350-000-CL | 3% RPMI-oplossing wordt gemaakt door RPMI aan te vullen met 3% foetaal runderserum |
| BD Pharm Lyse Lysing buffer | BD Biosciences | 555899 | |
| Phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| DNAse1 | Roche | 11284932001 | |
| F12 DMEM | Wisent | 319-075-CL | |
| Foetaal runderserum (FBS) | Wisent | 080-150 | |
| Penicilline/Streptomycine | Gibco | 15140-122 | |
| CFSE | Invitrogen | C1157 | |
| 0,25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Integrid weefselkweekschaal met 20 mm raster (150 x 25 mm) | Falcon | 353025 |
Referenties
- Saitoh, T., et al. Neutrophil extracellular traps mediate a host defense response to human immunodeficiency virus-1. Cell Host Microbe. 12 (1), 109-116 (2012).
- Bruns, S., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
